陳越 金風(fēng)

晝夜節(jié)律是指生物體的各種生命活動(dòng)以24 h 為周期的變動(dòng)規(guī)律，可由特定的基因控制。已知哺乳動(dòng)物體內(nèi)參與晝夜節(jié)律的生物鐘基因包括：Clock、Bmal1、Per1、Per2、Per3 和Cry1 等12 種成分［1］。有研究提示生物鐘基因可能刷新人類對(duì)自然界的認(rèn)識(shí)，是具有重大突破意義的研究領(lǐng)域［2］。生物鐘通過(guò)特定基因及其蛋白產(chǎn)物組成的正負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)路使得生理過(guò)程和行為隨晝夜交替呈節(jié)律性變化，并與外界周期性環(huán)境刺激同步化［3］。謝麗等［4］研究指出，腫瘤在本質(zhì)上屬于一種基因組疾病，其發(fā)生、發(fā)展與不斷累積的基因突變及其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的動(dòng)態(tài)變化有關(guān)。研究證實(shí)，生物鐘基因能夠通過(guò)調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡，而B(niǎo)mal1 作為生物鐘體系的核心基因，其突變后可引起生物節(jié)律體系的紊亂，并在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用［5］。隨著時(shí)間醫(yī)學(xué)的發(fā)展，晝夜節(jié)律在疾病發(fā)生中的作用被關(guān)注。因此，通過(guò)對(duì)Bmal1 基因的研究探討生物晝夜節(jié)律對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡、癌基因表達(dá)等方面所起的作用，對(duì)于了解腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移具有重要意義，并為臨床上選擇合適的治療方法提供新的理論依據(jù)。

1 Bmal1基因概述

Bmal1 基因，即ARNTL（aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like）基因，定位于11 號(hào)染色體短臂，是哺乳動(dòng)物生命活動(dòng)晝夜節(jié)律振蕩器中的關(guān)鍵元件［6］。其表達(dá)產(chǎn)物為Bmal1蛋白，是調(diào)節(jié)正反饋環(huán)路的因子之一，經(jīng)過(guò)泛素化修飾后，在cAMP/Ca2+反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CBP）介導(dǎo)下與分子伴侶Clock蛋白結(jié)合成Bmal1/Clock 異二聚體［7］，繼而與啟動(dòng)子上游的控制元件E-box 結(jié)合，最終激活Per、Cry 達(dá)到調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律作用。有研究發(fā)現(xiàn)，Bmal1基因的過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)Bmal1 與Clock 結(jié)合［8］，其組成的異二聚體可以通過(guò)微小RNA-142-3p（mir-142-3p）作用于Bmal1 mRNA的3'非翻譯區(qū)，形成Bmal1自行調(diào)控的負(fù)反饋環(huán)，在一定程度上抑制Bmal1 的表達(dá)［9］。研究表明，Bmal1 能削弱Bcl-w 的活性從而達(dá)到阻斷PI3KAKT-MMP-2 通路來(lái)抑制癌細(xì)胞入侵［10］。上述研究提示晝夜節(jié)律與腫瘤的形成和發(fā)展之間存在相關(guān)性。由于近年來(lái)對(duì)生物鐘基因的研究剛開(kāi)展，相關(guān)研究報(bào)道有限，目前對(duì)腫瘤的作用機(jī)制尚未明確。因此，本文基于現(xiàn)有的研究結(jié)論，介紹Bmal1 基因在不同腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的表達(dá)情況，并結(jié)合本課題組運(yùn)用晝夜節(jié)律進(jìn)行時(shí)辰治療的經(jīng)驗(yàn)，來(lái)進(jìn)一步探討晝夜節(jié)律在腫瘤治療方面的新思路。

2 Bmal1基因在不同腫瘤中的作用

2.1 Bmal1作為抑癌基因

2.1.1 Bmal1基因與頭頸部鱗癌及鼻咽癌 Hsu等［11］對(duì)40 例未行手術(shù)治療的頭頸部鱗癌患者，通過(guò)RTPRC 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在癌組織中Bmal1 的表達(dá)水平明顯低于正常組織，Bmal1基因在分期較晚的癌組織中表達(dá)低于分期早的癌組織。He 等［12］通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫組織化學(xué)法檢測(cè)鼻咽癌組織與正常組織中Bmal1 mRNA、Bmal1蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在癌組織中Bman1 基因的表達(dá)明顯低于正常組織。同時(shí)，顯示Bmal1 蛋白表達(dá)相對(duì)較高的鼻咽癌患者其總生存期（overall survival，OS）較長(zhǎng)，通過(guò)Cox 多因素分析證實(shí)，Bmal1 蛋白的表達(dá)情況為影響OS 的獨(dú)立預(yù)后因素?；谏鲜鰞身?xiàng)研究結(jié)果來(lái)分析，Baml1基因在頭頸部鱗癌及鼻咽癌中作為抑癌基因。其表達(dá)與患者年齡（≥48 歲：4.33±0.33；＜48 歲：5.00±0.44，P=0.23）、性別（男性：3.63±0.39；女性：4.73±0.35，P=0.87）、腫瘤大?。═1+T2期：5.16±0.94；T3+T4期：4.55±0.26，P=0.38）并無(wú)相關(guān)性，但腫瘤臨床分期越晚，Bmal1 基因在癌組織中的表達(dá)越低（M0：5.04±0.27；M1：3.37±0.66，P=0.011）。Tang 等［13］通過(guò)免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)Bmal1基因在舌鱗癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，且其表達(dá)具有時(shí)間節(jié)律性。

2.1.2 Bmal1 基因與中樞神經(jīng)性腫瘤 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）為成人最常見(jiàn)且惡性程度較高的侵襲性腦腫瘤，其中位生存時(shí)間僅15 個(gè)月。Jung 等［14］構(gòu)建GBM 細(xì)胞（U251），將Bmal1 基因過(guò)表達(dá)后發(fā)現(xiàn)U251 侵襲性降低。在PI3K 內(nèi)源性抑制劑水平無(wú)明顯變化下，敲除Bmal1 基因的PI3K 活性，AKT 磷酸化及MMP-2 蛋白表達(dá)水平均升高，應(yīng)用Bmal1靶向siRNA 處理后，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞侵襲作用增強(qiáng)，提示Bmal1 基因通過(guò)抑制PI3K-AKT-MMP-2 通路，導(dǎo)致GBM細(xì)胞侵襲水平降低。

2.1.3 Bmal1 與結(jié)直腸癌 Zeng 等［15］通過(guò)構(gòu)建沉默Bmal1 的結(jié)直腸癌細(xì)胞株發(fā)現(xiàn)，缺乏Bmal1 基因表達(dá)會(huì)增加癌細(xì)胞的增殖速度。對(duì)作用機(jī)制分析發(fā)現(xiàn)，沉默Bmal1 基因在能夠抑制癌細(xì)胞凋亡，同時(shí)抑制p53基因表達(dá)，從而促進(jìn)某些周期蛋白合成導(dǎo)致癌細(xì)胞加速增殖。Sakamoto 等［16］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Bmal1基因在結(jié)直腸癌中通過(guò)增加癌細(xì)胞凋亡來(lái)抑制腫瘤發(fā)生，能夠通過(guò)促進(jìn)p53基因表達(dá)起到抑制細(xì)胞周期蛋白D1 合成，從而阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程來(lái)發(fā)揮抑癌基因的作用，為探索Bmal1基因具體作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。但Karantanos等［17］研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌組織中Bmal1基因表達(dá)較高，且其表達(dá)與患者臨床病例特征并無(wú)相關(guān)性。Okazaki 等［18］研究指出，Bmal1 基因能促進(jìn)鐵調(diào)節(jié)蛋白2（iron regulatory protein 2，IRP2）轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（transferrin receptor，TFR1）表達(dá)，進(jìn)一步影響鐵代謝來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。同一基因?yàn)楹卧谕瑯拥哪[瘤中會(huì)出現(xiàn)相悖結(jié)果，是否因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室構(gòu)建的細(xì)胞株與實(shí)體瘤間存在差異性？又或者因?yàn)闄z測(cè)方法或參考指標(biāo)選擇不同？上述疑問(wèn)有待于繼續(xù)深入研究，為結(jié)直腸癌的基因研究及治療提供了啟發(fā)及新的視角。

2.1.4 Bmal1 基因與胰腺癌 胰腺癌早期臨床表現(xiàn)不典型且易被忽視，病程發(fā)展迅速，就醫(yī)時(shí)已為晚期，預(yù)后極差。Jiang 等［19］選取45 例未行放化療的胰腺癌患者，同時(shí)選取相同例數(shù)健康人群作為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)Bmal1 基因在胰腺癌組織中呈低表達(dá)。通過(guò)構(gòu)建敲除Bmal1的胰腺癌細(xì)胞株BxPC-3和AsPC-1證實(shí)，Bmal1 可直接與p53 啟動(dòng)子結(jié)合啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，激活下游信號(hào)通路，介導(dǎo)G2/M 阻滯，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。提示Bmal1基因可能為胰腺癌的抑癌基因，其是否可作為早期診斷胰腺癌的潛在性標(biāo)志物，亟需進(jìn)一步檢測(cè)胰腺癌組織與癌旁正常組織中Bmal1 基因的表達(dá)情況。

2.1.5 Bmal1基因與血液系統(tǒng)腫瘤 研究發(fā)現(xiàn)，在非霍奇金淋巴瘤中檢測(cè)到Bmal1 基因CpG 島的啟動(dòng)子高度甲基化，提示Bmal1基因的表觀遺傳學(xué)異?？赡艽偈寡耗[瘤的發(fā)生［20］。Yang等［21］通過(guò)對(duì)比新診斷的慢性粒細(xì)胞白血病、治療后的慢?；颊呒敖】等巳和庵苎?xì)胞發(fā)現(xiàn)，在新診斷的慢?；颊咧蠦mal1基因表達(dá)顯著降低，而經(jīng)過(guò)甲磺酸伊馬替尼治療達(dá)到完全緩解的慢性粒細(xì)胞白血病患者其Bmal1 表達(dá)有所升高甚至達(dá)到正常水平，提示Bmal1基因表達(dá)下降與慢性粒細(xì)胞白血病的發(fā)生存在相關(guān)性，可作為慢性粒細(xì)胞白血病的抑癌基因。另一項(xiàng)研究提示［22］，慢性粒細(xì)胞白血病患者外周血細(xì)胞中Bmal1 基因表達(dá)也明顯下降，下游控制細(xì)胞周期的Myc基因和周期蛋白D1 表達(dá)顯著升高，表明Bmal1 表達(dá)的降低使其無(wú)法激活下游信號(hào)通路造成細(xì)胞凋亡信號(hào)無(wú)法傳遞，引發(fā)細(xì)胞增殖導(dǎo)致慢性淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)生。

2.2 Bmal1作為促癌基因

Tiphaine等［23］通過(guò)定量RT-PCR檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)Bmal1 基因在甲狀腺濾泡癌及乳頭狀癌中的表達(dá)高于甲狀腺良性結(jié)節(jié)。楊福全等［24］檢測(cè)膽管癌癌組織與鄰近正常組織中Bmal1蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Bmal1 蛋白在膽管癌組織中表達(dá)明顯高于癌旁正常組織。這與Bmal1在頭頸部鱗癌、鼻咽癌中作為抑癌基因低表達(dá)的研究結(jié)論相反，出現(xiàn)這種相悖結(jié)論的原因可能因?yàn)椴煌[瘤微環(huán)境差異導(dǎo)致Bmal1 基因作用機(jī)制改變。

有研究檢測(cè)胃腺癌組織與癌旁組織中Bmal1 基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)兩者間無(wú)顯著性差異，且其表達(dá)與胃癌的分期并無(wú)相關(guān)性［25］。但該研究發(fā)現(xiàn)PER2、Cry1 在晚期胃癌中表達(dá)上調(diào)，由于Bmal1/Clock 異二聚體可激活Per、Cry，故需進(jìn)一步研究來(lái)證實(shí)Bmal1基因與胃癌的關(guān)系。上述研究指出Bmal1 基因參與多種類型腫瘤的發(fā)生、發(fā)展并發(fā)揮不同作用，其作用的多樣性可能與腫瘤內(nèi)環(huán)境變化相關(guān)，為腫瘤分子研究提供新思路與理論基礎(chǔ)。

3 時(shí)辰治療在惡性腫瘤治療研究中的進(jìn)展

通過(guò)檢測(cè)生物鐘Bmal1 基因在不同腫瘤中的表達(dá)情況，提示Bmal1基因在正常組織與腫瘤組織中呈不同表達(dá)，而B(niǎo)mal1基因作為生物鐘基因的核心元件調(diào)控晝夜節(jié)律，提示生物晝夜節(jié)律可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展存在相關(guān)性。

3.1 時(shí)辰化療

3.1.1 胃癌 hBmal1 基因定位于11p15，由32 個(gè)外顯子組成，和Bmal1基因同源，其表達(dá)產(chǎn)物也是Bmal1蛋白。宋俊梅等［26］通過(guò)人胃癌細(xì)胞（SGC-7901），用RT-PCR 檢測(cè)hBmal1 基因表達(dá)情況，其表達(dá)的高峰時(shí)間為20：00，低谷時(shí)間為08：00，分別于表達(dá)最高峰和最低谷時(shí)間給予多西他賽，對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制率分別為22.306%±0.266%和44.927%±0.454%，發(fā)現(xiàn)hBmal1 表達(dá)最高峰時(shí)多西他賽對(duì)SGC-7901 細(xì)胞的抑制率低于最低谷，提示hBmal1 的過(guò)表達(dá)會(huì)降低胃癌細(xì)胞對(duì)多西他賽的敏感性，為臨床治療胃癌提供了給藥時(shí)間的選擇。

3.1.2 結(jié)直腸癌 Li 等［27］采用伊立替康時(shí)辰化療大腸癌中發(fā)現(xiàn)Bmal1 的表達(dá)有助于降低化療不良反應(yīng)。Zeng等［28］采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)82例接受奧沙利鉑的結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）患者腫瘤細(xì)胞中Bmal1的表達(dá)情況，同時(shí)應(yīng)用MTT和集落形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定腫瘤細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的Bmal1基因能夠抑制CRC細(xì)胞的增殖，同時(shí)增加CRC 細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性，加強(qiáng)細(xì)胞凋亡，提高奧沙利鉑的療效。該研究為結(jié)直腸癌的基因治療提供了新的思路和途徑。此外，該研究還通過(guò)構(gòu)建Bmal1基因過(guò)表達(dá)的結(jié)直腸癌細(xì)胞株再次證實(shí)Bmal1基因過(guò)表達(dá)不但能抑制癌細(xì)胞增殖，而且可通過(guò)提高癌細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性，增強(qiáng)奧沙利鉑引起的細(xì)胞凋亡，提高療效。Bmal1高表達(dá)的結(jié)直腸癌患者OS、無(wú)疾病進(jìn)展生存期均優(yōu)于低表達(dá)患者。

3.1.3 中樞神經(jīng)性腫瘤 Slat 等［29］研究發(fā)現(xiàn)在放療或放療后使用替莫唑胺（temozolomide、TMZ）能夠延長(zhǎng)患者中位生存期，并提高生存率。該研究觀察5例GBM 細(xì)胞中Bmal1 基因連續(xù)5 天的啟動(dòng)子活性。根據(jù)Bmal1 基因的晝夜節(jié)律，采用TMZ 治療構(gòu)建GBM的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)在DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡和生長(zhǎng)抑制細(xì)胞內(nèi)在節(jié)律中，TMZ最高敏感性均出現(xiàn)在Bmal1表達(dá)高峰期，提示Bmal1的表達(dá)與TMZ的敏感性呈正相關(guān)。敲除Bmal1基因，晝夜節(jié)律對(duì)TMZ的增敏作用隨之消失，根據(jù)BMAL1 表達(dá)的晝夜節(jié)律，采用TMZ 時(shí)辰化療來(lái)增強(qiáng)TMZ 的敏感性，在一定程度上減少TMZ 使用劑量或縮短治療次數(shù)，從而降低化療不良反應(yīng)，使患者獲得更好的生存質(zhì)量及預(yù)后。作為治療GBM 的新方法，未來(lái)亟需進(jìn)一步設(shè)計(jì)并開(kāi)展隨機(jī)臨床對(duì)照研究，擴(kuò)大樣本量并延長(zhǎng)隨訪時(shí)間來(lái)揭示其相關(guān)機(jī)制。

上述研究發(fā)現(xiàn)，Bmal1 基因可提高化療療效，Bmal1 基因?yàn)樯镧娀虻暮诵脑?。有研究根?jù)晝夜節(jié)律的規(guī)律及差異性設(shè)計(jì)最佳治療時(shí)機(jī)來(lái)提高患者療效，降低不良反應(yīng)，并提出時(shí)辰化療的概念［30］。金風(fēng)等［31］采用DDP+5-FU/CF時(shí)辰化療方案治療鼻咽癌患者發(fā)現(xiàn)，時(shí)辰組完全緩解率及有效率較常規(guī)組高，且時(shí)辰組血液學(xué)毒性及消化道不良反應(yīng)等發(fā)生率較低，提示時(shí)辰化療可能對(duì)患者治療耐受性具有積極意義。畢婷等［32］研究發(fā)現(xiàn)，時(shí)辰組近期療效較好、不良反應(yīng)發(fā)生率較低、對(duì)免疫功能損傷較小。毛振華等［33］采用時(shí)辰化療治療初治遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移鼻咽癌，結(jié)果表明時(shí)辰化療能夠降低嘔吐發(fā)生率，在減少嚴(yán)重骨髓抑制方面存在優(yōu)勢(shì)，對(duì)改善患者免疫功能可能發(fā)揮重要作用。李卓玲等［34］研究發(fā)現(xiàn)，時(shí)辰組與常規(guī)組在有效率方面并無(wú)顯著性差異，但時(shí)辰組的惡心、嘔吐等不良反應(yīng)發(fā)生率較低，且時(shí)辰組CD4+/CD8+均值比常規(guī)組高。羅秀玲等［35］采用隨機(jī)分組進(jìn)行一項(xiàng)前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，治療方式相同的條件下，時(shí)辰給藥組可降低不良反應(yīng)，改善患者免疫功能。靳駿騰等［36］通過(guò)對(duì)比時(shí)辰化療組與常規(guī)化療組發(fā)現(xiàn)，時(shí)辰組無(wú)論是在誘導(dǎo)化療后或同步放化療后，其惡心、嘔吐發(fā)生率降低，總體健康狀況評(píng)分及生存質(zhì)量均高于常規(guī)組，上述研究結(jié)果充分提示相比于常規(guī)化療，時(shí)辰化療可能是更加合理的腫瘤治療模式。Zhang 等［37］進(jìn)一步增加樣本量，將148 例鼻咽癌患者隨機(jī)分組，在同等調(diào)強(qiáng)放療條件下，時(shí)辰化療組口腔黏膜炎、惡心、嘔吐等不良反應(yīng)發(fā)生率明顯降低，且對(duì)免疫功能損傷較小。雖然時(shí)辰化療組在提高化療療效方面還需進(jìn)一步研究，但不良反應(yīng)發(fā)生率顯著降低，且更好地保留機(jī)體免疫功能，達(dá)到“等效低毒”的作用，提高了患者對(duì)化療的耐受性及生存質(zhì)量。有研究表明，通過(guò)比較兩種不同給藥速度（正弦組與勻速組）時(shí)辰化療發(fā)現(xiàn)，兩組在即刻療效、不良反應(yīng)發(fā)生率及生存期上均無(wú)顯著性差異，但正弦給藥能夠在一定程度上改善患者T 細(xì)胞免疫功能［38］。該研究將生物晝夜節(jié)律與藥代動(dòng)力學(xué)相結(jié)合應(yīng)用于臨床治療。

3.2 時(shí)辰放療

根據(jù)腫瘤組織對(duì)放射敏感性的生物節(jié)律選擇癌細(xì)胞的放射敏感期，避開(kāi)正常組織的放射敏感期行放療，旨在提高腫瘤組織療效的同時(shí)保護(hù)正常組織。有研究發(fā)現(xiàn)，頭頸部鱗癌患者上午較下午放療的口腔黏膜反應(yīng)明顯減少［39］。而在人鼻咽癌移植瘤裸鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)［40］，不同時(shí)間放療會(huì)導(dǎo)致不同的放射敏感性。

3.2.1 鼻咽癌 何麗佳等［41］將CNE2 細(xì)胞分為單純放療組和藥物聯(lián)合放療組，在照射前后分別給予拓?fù)涮婵?。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在照射前0.5 h至照射后1.0 h放療的敏感度最高，提示此段時(shí)間內(nèi)放療增敏作用最佳。比較兩組細(xì)胞，唯一不同點(diǎn)即在特定時(shí)間內(nèi)給藥與否。Zhang等［40］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在拓?fù)涮婵德?lián)合時(shí)辰放療組3、9、15 和21 HALO 4 組中，15 HALO放療敏感性最好，而3 HALO 最差；15 HALO 細(xì)胞凋亡指數(shù)增加而S期細(xì)胞比例降低，證實(shí)了放射敏感性具有時(shí)間依賴性。

3.2.2 頭頸部腫瘤 加拿大國(guó)際癌癥研究中心（HN3）的一項(xiàng)頭頸部腫瘤的前瞻性隨機(jī)臨床研究［42］，將216例患者隨機(jī)分為上午放療組（8∶00～10∶00）和下午放療組（16∶00～18∶00），觀察兩組患者口腔黏膜炎的發(fā)生情況。結(jié)果表明，相比于3級(jí)及3級(jí)以上口腔黏膜炎發(fā)生率上午與下午放療組分別為52.9%和62.4%（P=0.17），提示通過(guò)細(xì)胞周期節(jié)律性選擇合適的時(shí)間放療可減輕消化道黏膜的劑量限制。

3.2.3 肺癌 史玉樹(shù)［43］將80例非小細(xì)胞肺癌患者隨機(jī)分為常規(guī)放療組及時(shí)辰組，常規(guī)放療組放療時(shí)間為每日8：00～12：00，時(shí)辰組患者放療時(shí)間為18：00～22：00，觀察兩組患者的臨床療效，結(jié)果表明時(shí)辰放療組患者癌細(xì)胞消退率（65%）顯著高于常規(guī)放療組（45%）。

近期，美國(guó)一項(xiàng)研究選擇在細(xì)胞周期的不同時(shí)間給藥，發(fā)現(xiàn)當(dāng)生物鐘Bmal1基因表達(dá)在日峰值時(shí)腫瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺最為敏感，同時(shí)會(huì)出現(xiàn)最大程度的DNA 損傷反應(yīng)、凋亡激活和生長(zhǎng)抑制［29］。該研究首次將生物鐘基因與腫瘤治療相聯(lián)系，為腫瘤治療新靶點(diǎn)提供了臨床經(jīng)驗(yàn)。上述研究均提示晝夜節(jié)律會(huì)影響腫瘤放射治療的療效。Bmal1 基因發(fā)揮哪些作用，目前相關(guān)研究還較少，亟需進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究及臨床試驗(yàn)來(lái)探索時(shí)辰放療對(duì)提高放射敏感度和臨床療效的作用機(jī)制。本課題組運(yùn)用qPCR、免疫組織化學(xué)法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)鼻咽癌組織Bmal1 蛋白的表達(dá)明顯低于癌旁組織，基于上述結(jié)果，構(gòu)建Bmal1 基因穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的鼻咽癌非角化型細(xì)胞株CNE2 及其對(duì)照組（3.996±1.886vs.1.000±0，P=0.017），兩組細(xì)胞經(jīng)同步化處理后均給予8 Gy照射，24 h后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)組G2/M 期比例明顯升高（0.579±0.014vs.0.448±0.024，P=0.001），72 h 后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)組細(xì)胞凋亡率顯著增加（0.295±0.013vs.0.240±0.009，P=0.004），提示BMAL1基因可能通過(guò)增加G2/M 期阻滯而增加放療后鼻咽癌細(xì)胞CNE2 的凋亡。探尋相關(guān)機(jī)制，本課題組采用Western Blot 法檢測(cè)ATM（ataxia telangiectasia mutated）/ATR（ATM）通路及其下游基因表達(dá)情況顯示BMAL1基因過(guò)表達(dá)組中ATM、CHK1、CHK2、CDC25C、p53 和p21 表達(dá)水平均高于對(duì)照組，說(shuō)明BMAL1表達(dá)水平與上述ATM通路各檢查點(diǎn)基因表達(dá)水平呈正相關(guān)。進(jìn)一步免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-iP）發(fā)現(xiàn)BMAL1 與ATM 之間存在相互作用，因此本課題組推測(cè)BMAL1可能與ATM相互作用，從而調(diào)控ATM/ATR 通路下游基因的表達(dá)升高，使細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，加速細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤增殖，為腫瘤治療提供了新的視角及理論基礎(chǔ)。本課題組擬檢測(cè)照射后Bmal1 基因過(guò)表達(dá)組與對(duì)照組ATM/ATR 通路及下游基因表達(dá)情況，對(duì)比照射前后蛋白表達(dá)情況，明確放療后Bmal1基因是否通過(guò)調(diào)控ATM/ATR 通路增加放射敏感度，從而加速腫瘤細(xì)胞凋亡作用。

4 展望

有研究通過(guò)果蠅實(shí)驗(yàn)揭示了生物節(jié)律的分子機(jī)制［44］。晝夜節(jié)律已成為近些年研究的熱點(diǎn)，Bmal1基因作為核心元件之一，在不同腫瘤發(fā)生、發(fā)展中具有獨(dú)特作用。同時(shí)該研究還發(fā)現(xiàn)，根據(jù)Bmal1基因表達(dá)的節(jié)律性給藥能夠提高腫瘤化療療效并降低不良反應(yīng)的發(fā)生。因此，對(duì)Bmal1基因的進(jìn)一步研究將開(kāi)啟全新的、更加微觀的視角，同時(shí)為腫瘤早期發(fā)現(xiàn)提供具有發(fā)展?jié)摿Φ闹笜?biāo)。Bmal1 基因在時(shí)辰化療和放療中的具體作用機(jī)制，有望為腫瘤“高效低毒”或“等效低毒”治療方法提供理論依據(jù)及臨床資料。