【摘 要】目的：探討脂聯(lián)素對糖尿病伴發(fā)局灶性腦缺血大鼠的神經(jīng)保護作用及可能機制。方法：取SD雄性大鼠45只，制作糖尿病大鼠，并在此基礎(chǔ)上制作急性局灶性腦缺血模型，后大鼠隨機分成3組，分別為假手術(shù)組、對照組、實驗組。干預(yù)后2周首先使用改良神經(jīng)功能缺損（mNSS）量表評價各組大鼠神經(jīng)功能缺損情況。激光共聚焦觀察各組大鼠缺血區(qū)微血管直徑、密度和總面積。ELISA法檢測血漿和局部腦組織的血管內(nèi)皮生長因子表達情況。結(jié)果：（1）mNSS評分：實驗組較對照組組明顯降低。（2）三維共聚焦顯示：實驗組血管直徑明顯小于假手術(shù)組及對照組;實驗組較對照組血管密度顯著增多，實驗組的微血管總面積顯著大于對照組。（3）ELISA法結(jié)果顯示：實驗組大鼠血漿VEGF濃度顯著高于對照組。結(jié)論：脂聯(lián)素具有明顯的神經(jīng)保護作用，其可能與VEGF有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】脂聯(lián)素;糖尿病;卒中;神經(jīng)保護;血管內(nèi)皮生長因子

脂聯(lián)素（Adiponectin，APN）是常見的脂肪因子之一，主要由脂肪細胞分泌的一種內(nèi)源性生物活性蛋白，具有調(diào)節(jié)糖脂代謝、抗炎、抗動脈粥樣硬化、促進血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移等多種作用，在缺血性腦血管病中有著廣泛的應(yīng)用前景 [1-2]。可惜的是至今為止，此類研究較少。為此，本課題選用在糖尿病模型基礎(chǔ)上，首先制備MCAO（缺血再灌注模型）大鼠，后給予APN干預(yù)，2周后觀察各組大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)情況，同時通過檢測血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達情況來探討其可能的分子生物學(xué)機制，為ICD的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與模型的制備和分組

從武漢大學(xué)動物實驗中心購得雄性SD大鼠60只，SPF級， 8～12周，體重180-220g。分籠飼養(yǎng)于江漢大學(xué)動物實驗中心飼養(yǎng)。

采用高脂高糖飲食加腹腔注射鏈脲佐菌素的方法制備2型糖尿病動物模型，后采用改良Longa-Zea線栓法制作大腦中動脈閉塞（MCAO）模型[3]。所有實驗大鼠隨機分成3組，分別為假手術(shù)組（sham組）、對照組（MCAO+生理鹽水）、實驗組（MCAO+APN干預(yù)），每組15只大鼠。所有干預(yù)措施采用腹腔注射，實驗組將APN注射到大鼠體內(nèi)，對照組以同等生理鹽水注入，連續(xù)干預(yù)14天。

1.2 神經(jīng)功能缺損評分

采用改良的大鼠神經(jīng)功能缺損評分量表（mNSS）[3]。分別在術(shù)前1d、術(shù)后14d進行，評分3～14分的動物入組。

1.3 共聚焦三維腦血管成像

于造模后14d，每組分別取6只采用振動切片機冠狀切片，選取視交叉部位，向大腦端連續(xù)切片，片厚100?m。用激光掃描共聚焦顯微鏡掃100個層面，分析各組大鼠血管形態(tài)、內(nèi)徑、密度及單位面積熒光物質(zhì)點數(shù)。

1.4 ELISA法檢測血漿VEGF濃度

干預(yù)后14d，每組分別取6只大鼠靜脈外周血，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血漿VEGF水平，具體操作過程依照試劑盒說明書進行。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準差（）表示，兩樣本間比較采用配對t 檢驗，組間比較采用單因素方差分析。所有統(tǒng)計計算由SPSS13.0軟件完成，以P<0.05表示存在統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 大鼠的神經(jīng)功能缺損評分

（1）模型制作前1d，假手術(shù)組、對照組、實驗組mNSS評分分別為（1.60±0.08）分、（1.63±0.43） 分和（1.63±0.63）分，組間無顯著性差異（F=0.70，P>0.05），術(shù)前各組大鼠的生理實驗基礎(chǔ)基本相同，各組具有可比性。

（2）術(shù)后3d對照組、實驗組在模型制作后均出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺損，mNSS評分分別為（10.03±0.44）分和（10.74±0.37）分，與假手術(shù)組（2.03±0.36）分相比，均出現(xiàn)顯著性差異（F= 864.46，P<0.01）。

2.2 三維共聚焦血管成像

實驗組的毛細血管直徑（2.93±0.49） ?m 較假手術(shù)組（4.44±0.16）?m和對照組（3.56±0.42）?m明顯減少（F=104.242，P<0.01）;實驗組的血管密度（234.68±14.64）個/0.002 mm3較假手術(shù)組（130.88±6.34）個/0.002 mm3及對照組（176.26±10.87）個/0.002 mm3均有顯著增大（F=290.49，P<0.01）;

2.3 血漿VEGF濃度

術(shù)后14d，用酶聯(lián)免疫吸附法測得假手術(shù)組、對照組和實驗組大鼠血漿VEGF濃度，分別為4.49±0.78、13.76±4.04、50.35±6.44pg/ml，三組間存在顯著性差異（F=436.04，P<0.01）。其中，對照組（P=0.004）和實驗組（P=0.002）顯著性高于假手術(shù)組，而實驗組也顯著性高于對照組（P=0.001）。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠干預(yù)后發(fā)現(xiàn)對照組、實驗組大鼠均出現(xiàn)明顯的功能缺損，但是對照組大鼠的腦損傷程度較重。說明APN可以有效的減輕腦缺血大鼠神經(jīng)功能受損。進一步的我們觀察了APN對急性腦缺血大鼠的血管形成影響，發(fā)現(xiàn)實驗組大鼠的血管密度明顯增加，血流恢復(fù)較快，而對照組的血管密度與兩個實驗組相比卻有很大的差異（P<0.01）。這表明，APN可以促進缺血區(qū)大腦的血管新生，其可能與腦缺血區(qū)域的微環(huán)境能夠促進血管內(nèi)皮細胞的遷移和存活并分化形成新生血管有關(guān)。

為了進一步探索APN的分子生物學(xué)機制，我們檢測了血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）這種經(jīng)典的血管生成因子。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，實驗組大鼠的血漿VEGF水平明顯增加（P<0.05）。我們知道，血管的生成主要包括血管新生和血管發(fā)生，而這兩個過程均與血管生成因子密切相關(guān)，尤其是在腦缺血發(fā)生后會反應(yīng)性增加，改善腦卒中預(yù)后[2，4]。其中VEGF是已知的最經(jīng)典的血管生成因子之一，在血管生成過程中，它與其受體VEGFR結(jié)合，促進內(nèi)皮增殖、黏附、遷移[3，5]，啟動血管新生，發(fā)揮其生物學(xué)功能，并促進神經(jīng)元生長。經(jīng)過研究證實，增加腦缺血組織的局部VEGF濃度，可刺激缺血附近的微血管生長和側(cè)支循環(huán)形成，從而達到腦缺血損傷的保護作用[3]。而且VEGF在嚙齒類動物海馬腦區(qū)的高親和力的Flk-1受體結(jié)合后，促進海馬小膠質(zhì)細胞內(nèi) VEGF-mRNA的高表達，發(fā)揮神經(jīng)保護效應(yīng)[6]。另最近有研究表明，VEGF不僅具有促進血管新生作用，還可發(fā)揮多效性神經(jīng)保護因子的作用[7]。

由此我們推測，APN能夠減輕腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)損傷和改善神經(jīng)功能，機制可能與VEGF介導(dǎo)的血管新生有關(guān)。

（通訊作者：朝浩）

參考文獻

[1]孔朝紅，劉煜敏，朱江等.自體骨髓來源內(nèi)皮祖細胞移植改善腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能轉(zhuǎn)歸 [J].國際腦血管病雜志，2012，20（4）：258-260.

[2]Lim CM， Kim SW， Park JY， et al. Fluoxetine affords robust neuroprotection in the postischemic brain via its anti-inflammatory effect. [J].Neurosci. Res. 2009， 87（4）： 1037-1045.

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[6]Warner Schmidt JL， Duman RS. VEGF is an essential mediator of the neurogenic and behavioral actions of antidepressants[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（11）： 4647-4652.

[7]Namieeinska M， Mareiniak K， Nowak JZ. VEGF as an angiogenic neurotrophic and neuroprotective factor [J]. Postepy Hig Med Dosw，2005，59（1）： 573-583.

作者簡介

尹曉新，主任醫(yī)師，教授，碩士研究生導(dǎo)師，副院長，武漢科技大學(xué)附屬漢陽醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科。

朝浩，副主任醫(yī)師，副教授，神經(jīng)內(nèi)科科室主任，武漢科技大學(xué)附屬漢陽醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科。

楊濤，副主任醫(yī)師，副教授，武漢科技大學(xué)附屬漢陽醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科。