于佳瑞 叢 晶 張 茗 吳效科

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科一科，黑龍江哈爾濱 150040；3.中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院感染控制管理科，北京 100102

泛素（UB）分子量為8.5 kDa，含76 個(gè)氨基酸殘基，是一類高度保守的小分子量蛋白。泛素化是指泛素在一些特殊酶的作用下，將細(xì)胞內(nèi)的蛋白進(jìn)行靶向分類及特異性修飾的過程。此外，還在各種細(xì)胞生命活動(dòng)中起著重要作用，如信號傳導(dǎo)、免疫應(yīng)答、轉(zhuǎn)錄翻譯等[1]。在生殖方面，泛素-蛋白酶體降解途徑（UPP）的調(diào)控異常會導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常，精子畸形及精子活力降低，影響胚胎著床，并引發(fā)少精子癥、不育及睪丸腫瘤等。因此，泛素化的深入研究能進(jìn)一步了解生殖過程，對治療人類不孕不育具有重要意義。

1 泛素-蛋白酶體降解途徑

泛素-蛋白酶體降解途徑（UPP）由UB、泛素激活酶（E1）、泛素結(jié)合酶（E2）、泛素連接酶（E3）、26S 蛋白酶體和去泛素化酶（DUB）組成[2]，是細(xì)胞中蛋白質(zhì)選擇性降解的重要途徑之一，主要降解被泛素修飾的蛋白。UB 標(biāo)記的蛋白會被蛋白酶體水解，或被細(xì)胞內(nèi)吞噬。被錯(cuò)誤標(biāo)記的蛋白會因DUB 作用，避免被降解。泛素分子在腺苷三磷酸（ATP）供能的情況下，通過E1、E2、E3 相互作用，與靶蛋白結(jié)合，經(jīng)多個(gè)循環(huán)形成一條多聚泛素鏈，多個(gè)泛素修飾的靶蛋白最終被26S 蛋白酶體識別并降解[3]。UPP 調(diào)控不同信號通路蛋白質(zhì)的表達(dá)，在不同生物過程中發(fā)揮作用，同時(shí)在生殖細(xì)胞發(fā)育的各階段均有表達(dá)。

2 泛素化過程中的相關(guān)酶

2.1 泛素活化酶E1

泛素的活化需要ATP 作為能量，E1 將活化后的泛素通過交酯化過程傳遞給E2。E1 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中最被熟知的是泛素活化酶（UBA）1 和UBA6。UBA1常見于蛋白質(zhì)降解通路中，UBA1 抑制劑可引起細(xì)胞功能顯著性改變[4]。UBA6 在人類細(xì)胞系和組織中有廣泛表達(dá)，但功能尚未明確。

2.2 泛素結(jié)合酶E2

E2 是負(fù)責(zé)UB 與細(xì)胞蛋白連接核心參與者。人類具有約40 個(gè)參與UB 蛋白轉(zhuǎn)移的E2[5]。E2 主要參與以下2 種類型的反應(yīng)：轉(zhuǎn)運(yùn)（從硫酯轉(zhuǎn)移到硫醇基團(tuán)）和氨解（從硫酯轉(zhuǎn)移到氨基）。此外，E2 也可以直接調(diào)節(jié)泛素化相關(guān)酶的活性[5]。其中泛素結(jié)合酶（UBE）2C、UBE2S、UBE2D 能調(diào)節(jié)小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂，促進(jìn)卵母細(xì)胞染色體分離[6]。

2.3 泛素-蛋白連接酶E3

E3 是一個(gè)龐大的家族，目前發(fā)現(xiàn)已超過600 個(gè)。目前在生殖系統(tǒng)中Cullin 蛋白（CUL）1 和胚胎的早期發(fā)育直接相關(guān)，CUL-3 與精子發(fā)生、雄性不育密切相關(guān)[7-8]；CUL-2、CUL-5 與卵巢的發(fā)育有關(guān)[9]。

3 泛素化對生殖功能的影響

3.1 泛素化與雌孕激素受體

女性排卵、卵母細(xì)胞發(fā)育及子宮內(nèi)膜的周期性變化均受雌孕激素的調(diào)控。雌孕激素的正常周期性變化對女性生殖至關(guān)重要。雌孕激素在與其受體的特異性結(jié)合后，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)及基因調(diào)控機(jī)制，調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄。雌激素受體（ER）和孕激素受體（PR）在細(xì)胞核中需要與其他蛋白或協(xié)同因子相互作用來調(diào)控靶基因的表達(dá)。作為生殖過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，ER和PR 蛋白都經(jīng)歷了不同的修飾性反應(yīng)。泛素化可以改變其相互協(xié)同作用的穩(wěn)定性、亞細(xì)胞定位以及親和力，從而影響這些受體的功能。泛素結(jié)合酶E2（UBCH7）對ER/PR 受體依賴性的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)至關(guān)重要[10]。UBCH7的表達(dá)能增強(qiáng)PR 轉(zhuǎn)錄的協(xié)同作用[11]。泛素連接酶E3A（UBE3A）過表達(dá)或敲除能夠改變雌激素和孕酮受體水平。ER 是一種泛素化蛋白也屬于UB 的信號網(wǎng)絡(luò)，與雌激素結(jié)合后，迅速泛素化和降解。泛素連接酶（MDM2）和人乳頭瘤病毒E6 相關(guān)蛋白（E6AP）也能促進(jìn)雌激素誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性。去泛素化酶（UPS）中的核心成員各種選擇性識別特定底物的F-BOX 蛋白廣泛存在于生殖細(xì)胞及胚胎中，而雌激素在一些生理過程中與F-BOX 蛋白共同發(fā)揮作用，其中17α-乙炔雌二醇（EE2）能夠不同程度地影響F-BOX 蛋白表達(dá)[12]。因此，適當(dāng)調(diào)控關(guān)鍵信號蛋白活性對妊娠有至關(guān)重要的作用。

3.2 泛素化與卵母細(xì)胞

卵母細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄水平的改變不顯著，UBS 是翻譯后修飾的重要途徑。F-BOX 蛋白通過泛素化過程調(diào)控上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、細(xì)胞周期及凋亡中的關(guān)鍵分子，進(jìn)而在卵母細(xì)胞中發(fā)揮重要功能[13]。DUB 可以水解泛素及結(jié)合的底物，與新的靶蛋白結(jié)合。此外，能修飾加工泛素前體，對蛋白酶體內(nèi)以及胞質(zhì)內(nèi)泛素鏈進(jìn)行水解，維持泛素分子在細(xì)胞內(nèi)的庫存和循環(huán)利用。泛素羧基末端水解酶（UCH）屬于是DUB 家族。對UCH 的研究中主要集中在UCHL1 和UCHL3。UCHL1 和UCHL3 在哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞中表達(dá)量最高[14]。在小鼠卵母細(xì)胞成熟過程中，UCHL1 和UCHL3 分別通過調(diào)節(jié)皮質(zhì)和減數(shù)分裂期紡錘體來影響卵母細(xì)胞的成熟[15]。在雌激素的作用下，UCHL1 也與卵細(xì)胞的凋亡相關(guān)[16]。減數(shù)分裂的卵母細(xì)胞作為雌性配子提供了一半的基因組及受精和胚胎早期發(fā)育的所有儲存。卵母細(xì)胞減數(shù)分裂缺乏從頭到尾的mRNA 轉(zhuǎn)錄。因此，蛋白水平的調(diào)控，尤其是UPS 的調(diào)控更為關(guān)鍵。F-box 蛋白的新成員Fbxo30 在小鼠卵母細(xì)胞中富集，表達(dá)水平在第一次減數(shù)分裂中期（MI）后顯著下降[17]。E2 酶UBE2C 能調(diào)控小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中APC/C 活性[18]。

3.3 泛素化與精子發(fā)生

受精是一個(gè)復(fù)雜的級聯(lián)過程，受精從精子在輸卵管精子庫中的獲能開始，從配子識別、精子-透明帶相互作用、精子-卵膜粘連和融合，到精子結(jié)合、卵母細(xì)胞活化、原核發(fā)育和胚胎分裂。泛素化系統(tǒng)在人類和動(dòng)物精子發(fā)生過程中對頂體和尾部的生物發(fā)生起著重要的調(diào)控作用，并參與許多精子相關(guān)過程。受精過程中配子結(jié)構(gòu)的正常功能、循環(huán)和重構(gòu)得益于整個(gè)泛素化系統(tǒng)[19]。UPS 的失調(diào)會導(dǎo)致精子畸形和精子活力下降，引起生殖系統(tǒng)疾病[20]。UBA1 抑制劑能在獲能期間改變頂體膜重塑。此外，在獲能后，頂體蛋白酶體促進(jìn)透明帶糖蛋白的降解，導(dǎo)致受精。UPS 通過泛素化調(diào)節(jié)DNA 修復(fù)酶參與精子發(fā)生中的DNA 修復(fù)，協(xié)助鑒定DNA 損傷位點(diǎn)，提高損傷修復(fù)相關(guān)蛋白，啟動(dòng)DNA 修復(fù)途徑，維持染色體穩(wěn)定性以確保正常精子形成[21-22]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，精子泛素化與遺傳DNA 缺陷相關(guān)[23]。USP24 是受雄激素受體（AR）調(diào)控的靶基因，蛋白在小鼠成熟精子上有表達(dá)，表達(dá)水平升高與小鼠的性發(fā)育相關(guān)。說明USP24 可能參與調(diào)控小鼠的精子發(fā)生過程[24]。泛素是男性精液的重要組分，有調(diào)查顯示在男性不育患者體內(nèi)泛素含量明顯增加，而伴隨著精液中泛素含量的增加，精子的形態(tài)、數(shù)量和活動(dòng)能力均有所下降。提示，泛素可以作為衡量精子質(zhì)量的一項(xiàng)指標(biāo)[25]。

3.4 泛素化與胚胎發(fā)育

胚胎發(fā)育不良是導(dǎo)致體外受精失敗的主要原因之一。植入前胚胎發(fā)育的第一個(gè)必要事件是在母體-合子轉(zhuǎn)變（MZT）期間發(fā)生的母體RNA/蛋白質(zhì)降解和合子基因組激活（ZGA）。UPS 在MZT 過程中對母體蛋白的清除起著至關(guān)重要的作用[26]。特別是UPS 通過多種方式調(diào)控轉(zhuǎn)錄，包括蛋白水解和非蛋白水解，從染色質(zhì)結(jié)構(gòu)水平到基因表達(dá)調(diào)控[27-28]。小鼠早期胚胎中，為了ZGA 和MZT 的正常進(jìn)展，UPS 需要對母體蛋白進(jìn)行順序降解。泛素化連接酶（HUWE1）是泛素化過程的關(guān)鍵酶類[29]。在早期胚胎發(fā)育中作用的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在植入前小鼠胚胎的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)以及配子中均有表達(dá)，而且表達(dá)量受氧化應(yīng)激的調(diào)控。HUWE1基因敲除組胚胎發(fā)育受到抑制，囊胚形成減少，凋亡細(xì)胞數(shù)量增加。進(jìn)一步檢驗(yàn)HUWE1 表達(dá)是否與人類胚胎發(fā)育相關(guān)后發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量較差的胚胎HUWE1 染色明顯減少，流產(chǎn)胚胎絨毛中HUWE1 的表達(dá)明顯減少[30]。綜上所述，HUWE1 蛋白可能參與著床前胚胎發(fā)育，而HUWE1 蛋白表達(dá)失調(diào)可能與體外移精-胚胎移植（IVF-ET）臨床胚胎發(fā)育不良及流產(chǎn)有關(guān)?？傮w看來，泛素化連接酶HUWE1 對于胚胎發(fā)育具有重要作用，HUWE1 異常調(diào)節(jié)可能會提高胚胎異常發(fā)育風(fēng)險(xiǎn)和臨床上IVF 的流產(chǎn)率[31]。

人類和小鼠的泛素蛋白連接酶Q1（UBE2Q1）具有98%的一致性，小鼠UBE2Q1 是一種活性E2 類UB結(jié)合酶。這種蛋白n 端末端對尿嘧啶核苷二磷酸半乳糖（UDPGal）的結(jié)合和內(nèi)化至關(guān)重要。UBE2Q1 在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM）和早期囊胚的滋養(yǎng)層細(xì)胞中均有表達(dá)，提示UBE2Q1 在女性生殖和胚胎植入過程中起著一定的作用，并且涉及到女性生育能力的不同方面[32]。泛素連接酶9（UBC9）是小泛素相關(guān)修飾蛋白（SUMO）循環(huán)通路中唯一的E2 結(jié)合酶，參與了有絲分裂中至關(guān)重要的過程，包含維持染色體的完整性及解離、細(xì)胞周期進(jìn)程、著絲點(diǎn)聚集及胞質(zhì)分裂[33]。UBC9 在早期發(fā)育階段極其重要，小鼠UBC9 缺失將導(dǎo)致著床早期胚胎致死，并導(dǎo)致胚囊內(nèi)細(xì)胞團(tuán)選擇性的凋亡。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)泛素化蛋白的基因編碼人泛素-52 氨基酸融合蛋白（UBA52）能調(diào)控細(xì)胞生命和胚胎發(fā)育。UBA52 的核糖體結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生核糖體蛋白復(fù)合體，同時(shí)UBA52 泛素結(jié)構(gòu)域同時(shí)產(chǎn)生核糖體復(fù)合體泛素化。因此，UBA52 是核糖體蛋白復(fù)合物的雙重調(diào)控因子。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)從分子角度進(jìn)一步解讀了泛素相關(guān)蛋白的合成和胚胎發(fā)育的關(guān)系[34]。

4 結(jié)語

泛素化在蛋白質(zhì)的定位、代謝、調(diào)節(jié)和降解等方面中都起至關(guān)重要的作用。同時(shí)也參與了細(xì)胞周期、增殖凋亡、基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、信號傳遞、損傷修復(fù)等有關(guān)生命活動(dòng)的調(diào)控。對泛素化與與腫瘤、心血管系統(tǒng)等疾病發(fā)病機(jī)制的研究逐漸成為開發(fā)新藥物的新靶點(diǎn)。隨著生物化學(xué)和遺傳生物學(xué)領(lǐng)域研究的不斷深入，泛素化與生殖領(lǐng)域的關(guān)系也取得了新的突破，多種E2、E3 家族的成員參與了哺乳動(dòng)物的精子獲能、卵母細(xì)胞成熟、胚胎發(fā)育等過程。由此我們可以推測，其與流產(chǎn)、不孕不育、少精子癥等生殖系統(tǒng)疾病具有相關(guān)性。然而，目前研究僅局限在動(dòng)物模型層面，缺少臨床研究，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上推導(dǎo)的結(jié)論及假說有待驗(yàn)證。