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天然產(chǎn)物中五環(huán)三萜類化合物檢測方法的研究進(jìn)展

2019-01-06 20:02孫燕葛斐林薛春苗曹俊嶺
中國現(xiàn)代中藥 2019年4期
關(guān)鍵詞:齊墩三萜果酸

孫燕,葛斐林,薛春苗,曹俊嶺,*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院,北京 100029;2.北京中醫(yī)藥大學(xué) 東直門醫(yī)院,北京 100700

五環(huán)三萜類(Pentacyclic Triterpenoids,PT)是一類分布廣泛的天然活性物質(zhì),有六個(gè)異戊二烯單元聯(lián)結(jié)而成,由5個(gè)閉合環(huán)作為母體,并以游離或苷類形式存在于自然界中,尤其是存在于一些中國的傳統(tǒng)天然藥物中[12-13]。PT按其核心結(jié)構(gòu)分為:齊墩果烷型、熊果烷型、羽扇豆烷型、何帕烷型和木栓烷型五大類;并根據(jù)它們的羥基和羧酸基團(tuán)的數(shù)目、位置進(jìn)一步分類為三萜單醇、三萜二醇、三萜酸等。這類化合物有著廣泛的藥理活性,包括抗炎、肝保護(hù)、抗腫瘤、抗病毒、抗微生物、抗真菌、胃保護(hù)和抗高血脂作用等,其抗腫瘤活性一直是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[1-11]。PT類化合物具有低揮發(fā)性和低極性,在早期的一些研究中,由于有限的檢測方法或?qū)φ掌?,這些化合物通常被檢測為復(fù)合物。而PT是一類具有相同骨架但取代基不同的類似物,不同取代基的生物活性會(huì)有很大差異,生物合成屬于同步合成但合成量不同,更難以檢測[14]。隨著分析技術(shù)日益發(fā)展,將這些技術(shù)應(yīng)用到PT的分離分析中是大勢(shì)所趨,不僅有利于更好地提取傳統(tǒng)中藥的活性物質(zhì),而且針對(duì)PT中含量少但生物活性較高的成分,發(fā)掘來源相對(duì)豐富的天然產(chǎn)物例如藥食同源產(chǎn)品,是理想、經(jīng)濟(jì)的解決途徑。所以一個(gè)高選擇分離和高靈敏檢測技術(shù)是藥食產(chǎn)品中PT準(zhǔn)確測定的關(guān)鍵點(diǎn)。為此本文在總結(jié)前人研究成果的基礎(chǔ)上,結(jié)合最新研究動(dòng)態(tài),對(duì)PT的檢測方法及其在天然產(chǎn)物分析中的應(yīng)用等方面進(jìn)行綜述。

1 PT的色譜分離方法

1.1 薄層色譜法(TLC)

Shiojima等[15]在最初進(jìn)行PT類化合物的分離時(shí),是先用硝酸銀浸漬硅膠柱,之后在制備過的硅膠柱上上樣。Martelanc等[16]則第一次使用C18反相高效薄層色譜板分離鑒定出ɑ-香樹脂醇、β-香樹脂醇、羽扇豆醇、羽扇豆醇乙酸酯、熊果酸、齊墩果酸等幾種常見PT異構(gòu)體化合物。因?yàn)闆]有樣品預(yù)處理,故植物提取物中PT的篩選分析快速、簡單。Sethiya等[17]在前人的基礎(chǔ)上,使用了高性能薄層色譜法(HPTLC),用于分析印度一種阿育吠陀藥用植物Shankhapushpi中熊果酸、白樺酸、豆甾醇和羽扇豆醇,可以將三萜酸和植物甾醇進(jìn)行分離,證明高性能薄層色譜法是分析大量復(fù)雜自然樣本的有效工具。

綜上TLC優(yōu)勢(shì):分離效率高,特別適用于各種復(fù)雜化合物的快速篩選;同時(shí)樣品純化步驟是最少的。缺陷:需要大量的樣品,在硅膠薄層色譜板的分離最低檢出限(LOD)在μg·mL-1水平;需要有毒的碘衍生和甲基化,耗時(shí)。

1.2 氣相色譜法(GC)

Macías等[18]早在研究清漆中的苔蘚樹脂時(shí),運(yùn)用裂解氣相色譜-質(zhì)譜法(GLC),提出用氯甲酸甲酯為衍生化試劑。建立了作為主要PT化合物的ɑ-香樹脂醇和β-香樹脂醇檢測方法,同時(shí)發(fā)現(xiàn),在樹脂中,何帕-22(29)-烯與兩個(gè)香樹脂醇一起存在。然而,何帕-22(29)-烯屬于何帕烷型五環(huán)三萜,是樹脂的標(biāo)記化合物。Pérez-Camino等[19]先用鍵合的氨丙基試劑提取植物油,提取液經(jīng)硅烷化后用固相法分離出酸性組分,后用GC分析,定量測定植物油中的痕量五環(huán)三萜酸:齊墩果酸、山楂酸和熊果酸,深入挖掘了植物油中的酸性組分。之后Janicsák 等[20]針對(duì)藥用植物中三萜酸:齊墩果酸和熊果酸,同樣使用GC進(jìn)行分離與含量測定。Sousa等[21]用氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)研究了整個(gè)工業(yè)過程軟木和軟木副產(chǎn)物中親脂性萃取物的化學(xué)組成。發(fā)現(xiàn)軟木提取物中除了有脂肪族、酚類,還有PT,主要包含木栓酮、樺木素、白樺脂醇、樺木酸,且工業(yè)副產(chǎn)物可被認(rèn)為是PT類或有望合成PT的中間體的來源。Silveira等[22]在藥用植物大葉錦雞兒葉、果、莖和樹皮提取物中發(fā)現(xiàn)PT次生物質(zhì),包括羽扇豆醇、羽扇豆酮、樺木酸、樺木素、木栓酮和木栓醇,并用GC-MS定量定性。先將干燥的己烷提取物懸浮在甲醇中,之后進(jìn)行衍生化:60 ℃下加入100 μL雙(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺試劑(BSTFA)反應(yīng)30 min,將衍生后的樣品注入氣相色譜儀,用Agilent HP 5-ms毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm)實(shí)現(xiàn)分析物的分離。Pereira等[23]用GC-MS同時(shí)定量定性海洋生物海參中幾類代謝產(chǎn)物,其中包含3種羽扇豆烷型三萜:白樺脂醇、羽扇豆醇、羽扇豆醇乙酸酯。Jemmali等[24]先用GC-MS對(duì)11種標(biāo)準(zhǔn)混合物:ɑ-香樹脂醇、β-香樹脂醇、羽扇豆醇、高根二醇、熊果醇、樺木素、齊墩果酸、樺木酸、熊果酸、山楂酸和科索羅酸進(jìn)行衍生化試驗(yàn),然后用于分析4種植物:蘋果、鼠尾草、沙棘和樹脂的提取物。混合物通過硅烷化或乙?;苌?,且PT化合物的衍生化只發(fā)生在母環(huán)上的一類或兩類官能團(tuán)結(jié)構(gòu),而不是全部。該衍生化方案僅適用于含羧酸PT:齊墩果酸、科索羅酸、樺木酸、山楂酸和熊果酸,以及二羥基衍生物:高根二醇和熊果醇;而含單羥基的PT類化合物:ɑ-香樹脂醇、β-香樹脂醇、樺木素、羽扇豆醇無需衍生。

綜上GC優(yōu)勢(shì):適用于非極性生物活性組分,也適用于分離位置異構(gòu)體。缺陷:由于PT的揮發(fā)性低,在上樣測定之前需要耗時(shí)的樣品預(yù)處理,即不可缺少的衍生化步驟,而衍生化過程是定量中潛在的不確定性因素;此外由于過長的保留時(shí)間,樣品可能降解。

1.3 液相色譜法(LC)

Martelanc等[25]用高效液相色譜法分離PT幾個(gè)三萜醇異構(gòu)體:羽扇豆醇、ɑ-香樹脂醇和β-香樹脂醇,方法是通過使用ODS柱,用乙腈-水(95∶5)在40 ℃下等溫洗脫32 min。Zhao等[26]用HPLC建立了白樺樹皮中樺木素和樺木酸同時(shí)提取和測定的方法。優(yōu)化了不同提取溶劑:二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷、甲醇和95%乙醇對(duì)樺木素和樺木酸提取率。結(jié)果表明,95%乙醇是一種較好的提取溶劑,可提取高含量的PT。通過在反相C18柱上用乙腈-水(86∶14)實(shí)現(xiàn)白樺脂素和白樺脂酸的分離,同時(shí)也比較了中國生長在不同地點(diǎn)的白樺樹皮中樺木素和樺木酸含量的顯著變化。Jin等[27]為了實(shí)現(xiàn)LC系統(tǒng)的最大靈敏度和選擇性,優(yōu)化了色譜條件。UPLC測定酸性化合物時(shí),流動(dòng)相經(jīng)常酸化,以改善色譜峰的形狀和保留時(shí)間。因此,對(duì)含有0.05%、0.1%、0.5%甲酸的水,或0.05%、1.5%、3%乙酸水溶液進(jìn)行評(píng)價(jià),結(jié)果表明,用0.05%乙酸酸化效果最好,可以觀察到色譜圖中山楂酸保留時(shí)間為20.9 min,并有良好的峰形和面積。相反,用較高濃度的乙酸時(shí),觀察到山楂酸沒有色譜峰。而沒有選擇甲酸,是因?yàn)樗鼘⑸介岬谋A魰r(shí)間延遲到29 min。此外對(duì)有機(jī)溶劑甲醇和乙腈進(jìn)行了評(píng)價(jià),因?yàn)榧状嫉淖贤馕盏陀?83 nm,不適合PT類化合物的紫外檢測,而且甲醇也總是觀察到遺留效應(yīng)。故有機(jī)溶劑采用乙腈。為獲得最佳提取效率對(duì)液-液萃取不同的提取溶劑進(jìn)行了評(píng)價(jià),在各種溶劑中,篩選出甲醇、乙醇、乙腈和乙酸乙酯。其中乙腈和乙醇回收率小于75%,甲醇回收率為(89.3±1.4)%,而乙酸乙酯回收率大于95%,并有較少的干擾峰,故選乙酸乙酯做萃取溶劑。

綜上LC優(yōu)勢(shì):比GC有更大的承載量,無需衍生化;對(duì)于定量來說,HPLC更具有可重復(fù)性,且UPLC與傳統(tǒng)HPLC相比分辨率更大、靈敏度提高、分析速度快。缺陷:因PT同分異構(gòu)體眾多,HPLC也不能實(shí)現(xiàn)完全分離。

1.4 毛細(xì)管電泳色譜法(CZE)

CZE分析PT早在幾年前被人們所研究利用。Qi等[28]用簡單的非水毛細(xì)管電泳(NACE)實(shí)現(xiàn)了中藥中3種PT化合物熊果酸、齊墩果酸和2ɑ,3β,24-三羥基-熊果-12-烯-28-羧酸的同時(shí)分離。采用甲醇-乙腈(65∶35)對(duì)混合物進(jìn)行電泳,獲得了良好的分離和相關(guān)系數(shù)。因NACE工作原理是基于電解質(zhì)溶液的使用,故有機(jī)溶劑的改變使它們?cè)谖锢砗突瘜W(xué)性質(zhì)上有很大不同(如黏度、介電常數(shù)、與水之間的導(dǎo)電性等),從而有利于PT在NACE中進(jìn)行選擇性分離。同時(shí),該方法用于5種中草藥:石楠葉、澤蘭、夏枯草、女貞子、馬鞭草提取物中這3種組分的分離和測定。膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法(MEKC)是最常用的,之前也有用MEKC對(duì)硅烷基化的PT進(jìn)行分離,但對(duì)于熊果酸和齊墩果酸,因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)非常相似,即使是MEKC也沒有獲得很好的分辨率。Cheung等[29]建立了環(huán)糊精修飾的CZE分離夏枯草中PT的3種三萜酸異構(gòu)體:熊果酸、齊墩果酸和樺木酸的方法。用硼砂緩沖液,包含40 mm硼砂、2 mm環(huán)糊精和4%甲醇,pH 9.4,在25 kV電壓、25 ℃溫度下運(yùn)行,20 min內(nèi)彼此很好地分離,遷移時(shí)間的RSD為0.16%~0.74%。期間為了改善CZE的分辨率,向背景緩沖液中加入添加劑環(huán)糊精(CD),原理是溶質(zhì)與CD、溶質(zhì)和毛細(xì)管壁、CD和毛細(xì)管壁的相互作用,特別是手性分子分離的相互作用,增加的分離效率可以歸因于降低手性分離中的相互作用。但由于修飾后對(duì)毛細(xì)管壁的吸附減少,且齊墩果酸和熊果酸的結(jié)構(gòu)相似,沒有像NACE和MEKC一樣獲得基線分離。Ren等[30]之后也用CZE方法來識(shí)別連翹中以上3個(gè)微量三萜酸組分,在背景電解質(zhì)丁基縮水甘油醚(BGE)中最終實(shí)現(xiàn)了CZE對(duì)3個(gè)三萜酸組分的基線分離。

綜上CZE優(yōu)勢(shì):具有分離效率高、樣品和溶劑消耗少等優(yōu)點(diǎn)。缺陷:需衍生化,分離時(shí)間長;由于存在非揮發(fā)性緩沖液,該方法不能與質(zhì)譜聯(lián)用。

1.5 超臨界流體色譜法(SFC)

Tavares等[31]最早用毛細(xì)管超臨界流體色譜法分離一些無需衍生的三萜酸:樺木酸、齊墩果酸、山楂酸和熊果酸。因之前SFC研究僅集中在PT餾分的表征上,沒有評(píng)價(jià)超臨界流體提取過程參數(shù)的影響,故Mossi等[32]用馬尾藤做了優(yōu)化提取。用高壓二氧化碳(CO2)萃取,從提取物的液體產(chǎn)量和化學(xué)成分來看,分析條件結(jié)果表明:CO2顆粒大小和流率不影響提取物產(chǎn)量,而萃取溫度和溶劑密度對(duì)提取物液體產(chǎn)率和化學(xué)性質(zhì)都有顯著影響。Lesellier 等[33]將超臨界流體色譜/蒸發(fā)光散射檢測器(SFC/ELSD)聯(lián)用,為快速分析PT類化合物提供了高分辨率和高響應(yīng)性,其優(yōu)化的分析條件:改性劑(10%~3%);背壓(12~18 MPa)和溫度(15~25 ℃),從而提高了分離,該方法檢測了蘋果渣中8種PT類化合物:齊墩果酸、高根二醇、β-香樹脂醇、熊果酸、熊果醇、樺木酸、樺木素、羽扇豆醇。在等度洗脫條件,不到20 min即可分離。然而,由于沒有質(zhì)譜定性,仍然有難以識(shí)別的同分異構(gòu)體存在。此外,因?yàn)榱鲃?dòng)相中沒有水,化合物與固定相的相互作用與反相液相相比,流體粘度低、流速大、效率高,使用SFC/ELSD能在相當(dāng)短的分析時(shí)間內(nèi)得到較滿意的分辨率。

綜上SFC優(yōu)勢(shì):CO2在食品和醫(yī)藥工業(yè)內(nèi)被用作超臨界萃取溶劑,因?yàn)樗鼰o毒,不易燃,非爆炸性,容易獲得,并具有低臨界溫度,可避免熱敏化合物的降解;SFC適用于中極性或低極性化合物中,且無需衍生化、分離時(shí)間短、分離效率高。缺陷:由于流動(dòng)相為氣體,與質(zhì)譜聯(lián)用的儀器貴且少,其余的檢測器對(duì)定性來說不夠精準(zhǔn)。

1.6 多孔石墨碳(PGC)

Rhourrifrih等[34]首次研究了PGC固定相分離PT異構(gòu)體??疾炝瞬煌瑓?shù):溫度、甲酸濃度及流動(dòng)相組成對(duì)保留率的影響。PGC工作原理是主要由石墨的可極化表面引起,具有高疏水性、極性和離子相互作用,特別適合分離異構(gòu)體。研究表明,隨著溫度的升高,PT的保留量降低,因此,在25 ℃下選擇乙腈-異丙醇混合物作為梯度洗脫的流動(dòng)相,進(jìn)行樹脂中PT的分離。Bérangère等[35]同樣使用PGC快速分析了幾種三萜酸:樺木酸、齊墩果酸、熊果酸、18ɑ-和18β-甘草次酸。

綜上PGC優(yōu)勢(shì):PGC具有平面結(jié)構(gòu),這對(duì)于分離結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)的分子非常有用,包括異構(gòu)體、微極性、極性和離子化合物,都得到了廣泛的應(yīng)用。缺陷:機(jī)械性能差,難以承受HPLC的高壓操作,實(shí)際應(yīng)用范圍窄。

2 PT的波譜檢測技術(shù)

2.1 紫外(UV)與熒光(FLD)檢測器

Zhao等[26]用HPLC-UV法同時(shí)測定樺木素、樺木酸,而這兩種PT分子具有相似的分子結(jié)構(gòu),且大多數(shù)PT類化合物缺乏發(fā)色團(tuán),通常在200 nm波長直接進(jìn)行UV檢測。故UV檢測器不利于低濃度的定量,而UV測定PT的前提是含量足,才能增強(qiáng)使用UV的檢測信號(hào)。Wu等[36]用HPLC-FLD測定了6種三萜酸:熊果酸、齊墩果酸、樺木酸、山楂酸、白樺脂酮酸和科羅索酸,三氯甲烷和丙酮做提取與分散溶劑。然而,因?yàn)槿狈线m的熒光部分,需采用柱前衍生來增強(qiáng)三萜酸分子的選擇性、靈敏度。

綜上UV與FLD優(yōu)勢(shì):價(jià)格相對(duì)便宜。缺陷:PT化合物缺乏發(fā)色團(tuán)和熒光部分,這限制了流動(dòng)相的選擇并減少了UV與FLD檢測的靈敏度;目前耦合UV/FLD檢測提供的LOD僅在μg·mL-1水平。

2.2 蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)

Tian等[37]用HPLC-ELSD測定紫菀中的三大類PT化合物:紫菀酮、木栓酮和表木栓酮并同時(shí)進(jìn)行定量,在反向C18柱上用乙腈梯度洗脫獲得最佳色譜條件,并在ELSD設(shè)定0.05%乙酸在40 ℃蒸發(fā)。同時(shí)比較了HPLC-UV和HPLC-ELSD下三大類PT化合物和樣品紫菀的色譜圖,發(fā)現(xiàn)UV檢測在200 nm處雖然可以檢測到紫菀酮和木栓酮,但信號(hào)比在相同濃度下由ELSD檢測產(chǎn)生的信號(hào)弱得多,所以HPLC-ELSD靈敏度比HPLC-UV大得多。

綜上ELSD優(yōu)勢(shì):避免衍生步驟而導(dǎo)致的樣品減少,ELSD也越來越多地被用于非發(fā)色物質(zhì)分析的通用檢測器;使用ELSD響應(yīng)顯著高于UV檢測所提供的響應(yīng)。缺陷:基線噪聲大,靈敏度低。

2.3 火焰離子化檢測器(FID)

Stiti等[38]使用GC結(jié)合FID分析了歐洲橄欖果實(shí)發(fā)育過程中PT的形成,并對(duì)PT定性和定量。從橄欖樹開花后的不同階段到果實(shí)發(fā)育,分析橄欖果實(shí)的游離甾醇和PT含量。甾醇和PT是通過乙酸/異戊二羥酸途徑合成的,由共同的前體氧化鯊烯形成。在果實(shí)發(fā)育開始時(shí),發(fā)現(xiàn)橄欖果含有大量的ɑ-香樹脂醇和β-香樹脂醇,以及更多的含氧化合物,如三萜二醇(高根二醇和熊果醇)和三萜酸(齊墩果酸、熊果酸和山楂酸)。當(dāng)橄欖果達(dá)到了最后成熟,開始從綠色變成紅色到紫色,ɑ-香樹脂醇和β-香樹脂醇不再存在。

綜上FID優(yōu)勢(shì):有利于分離鑒定PT的位置異構(gòu)體。缺陷:需要色譜衍生,化合物的非揮發(fā)性又延長了分析時(shí)間。

2.4 PT的質(zhì)譜檢測技術(shù)

質(zhì)譜作為一種重要的分析方法,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于化學(xué)、生物、食品科學(xué)、制藥行業(yè)等領(lǐng)域[39],特別適合于分析植物復(fù)雜基質(zhì)中的三萜成分,以克服基質(zhì)抑制效應(yīng)。由于PT化合物類似的結(jié)構(gòu),導(dǎo)致分離效果很差。而檢測器中光譜僅有一些峰相對(duì)強(qiáng)度的差異,無法很好地識(shí)別同分異構(gòu)體;質(zhì)譜卻可以在PT鑒定中可分析出位置異構(gòu)體,能夠很好地識(shí)別和量化實(shí)際樣品中的化合物,并有助于對(duì)未知化合物的結(jié)構(gòu)鑒定。這表明,良好的質(zhì)譜分析法對(duì)于明確鑒定含相同的分子量或碎片的PT類化合物是必需的。

2.4.1 飛行時(shí)間質(zhì)譜(QTOF) Mcghie等[40]研究了7個(gè)品種的蘋果皮中三萜酸組成,并測定其抑制脂肪酶的活性,利用高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜法(HPLC-QTOF-HRMS)獲得了43種化合物的準(zhǔn)確質(zhì)量信息,包括元素組成,片段質(zhì)量。這43種化合物被鑒定為三萜酸并初步鑒定為含有羥基、羧基的熊果酸(或齊墩果酸)及其衍生物。但這里質(zhì)譜給出的信息沒有確定羥基、羧基位置以及同分異構(gòu)體組的結(jié)構(gòu)(ɑ vsβ,順式vs反式)。研究表明,PT類化合物的質(zhì)譜碎裂為diels-alder反應(yīng),環(huán)C斷裂產(chǎn)生兩個(gè)雙環(huán)片段,這兩個(gè)片段的識(shí)別證實(shí)了PT類化合物19位羥基的位置可作為分子斷裂的識(shí)別點(diǎn)。而蘋果提取物中的三萜酸對(duì)于化學(xué)修飾,集中在C-3羥基,C-12、C-13雙鍵和C-28羧酸上,這些修飾可以產(chǎn)生更有效的化合物,或提高它們的生物利用度。

2.4.2 三重四極桿質(zhì)譜(QQQ) Sánchezavila等[41]在高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-QQQ-MS)的多重反應(yīng)監(jiān)測下,快速、選擇性地測定微波輔助提取后橄欖葉中PT類化合物:三萜酸(齊墩果酸、熊果酸和山楂酸);三萜二醇(熊果醇、高根二醇)。由于三萜酸和二醇為中等極性,使用乙醇作為微波輔助萃取劑在5 min內(nèi)完成了橄欖葉的提取。相比以往通常需要至少5 h的浸漬,在微波輔助下顯著縮短了浸出時(shí)間。萃取后,用HPLC-QQQ-MS,通過多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)證實(shí)了PT類的選擇性鑒定,在25 min內(nèi)完成成分表征。此外超聲波輔助浸出技術(shù)、加壓液體萃取和超臨界流體提取均可供浸出輔助應(yīng)用,可以大大減少提取體積和縮短加工時(shí)間。雖然QQQ適合于定性分析,對(duì)于定量不夠精確,但可以初步闡明每個(gè)PT類化合物的指紋特征。

2.4.3 四極桿-軌道質(zhì)譜(Orbitrap) Sánchez-González等[42]用高效液相色譜-四極桿軌道質(zhì)譜法(HPLC-Orbitrap-MS)鑒別橄欖內(nèi)山楂酸在大鼠血漿和尿液中的代謝,以更好地了解這種三萜酸化合物的生物效應(yīng)。因橄欖經(jīng)生物利用后,代謝物屬于生物體內(nèi)的微量小分子,故用高分辨質(zhì)譜法進(jìn)行定量分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),山楂酸在血漿(81.8%)和尿(73.9%)中均高濃度存在,這表明山楂酸代謝較低。而山楂酸已被評(píng)估為未來營養(yǎng)藥物,是可以在膳食干預(yù)中進(jìn)食的天然分子,能從可食用植物中分離出來,如新鮮蔬菜水果、豆類。為此,檢測山楂酸在體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化后的代謝產(chǎn)物,也有利于作為含PT成分植物的生物標(biāo)志物。

2.4.4 質(zhì)譜離子源比較

2.4.4.1 電子轟擊離子源(EI) Razbor?ek等[43]采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-EI)對(duì)唇形科不同藥用植物迷迭香、山茱萸、丹參等提取物中三萜酸進(jìn)行了分離、鑒別和定量,研究主要集中在齊墩果酸、樺木酸和熊果酸,都可以通過氣相色譜的洗脫順序和質(zhì)譜中碎片離子信號(hào)的強(qiáng)度得以區(qū)分,其中主要觀察到質(zhì)譜裂解行為中diels-alder反應(yīng)。

2.4.4.2 大氣壓化學(xué)電離(APCI) Martelanc等[16]用HPLC-MS首次發(fā)現(xiàn)并檢測出甘藍(lán)葉表蠟質(zhì)中3種三萜醇化合物:羽扇豆醇、ɑ-香樹脂醇、β-香樹脂醇。經(jīng)APCI電離后,質(zhì)譜圖上這3個(gè)同分異構(gòu)體給出了母離子峰及少量特征碎片離子峰的相對(duì)強(qiáng)度。因此,MS/MS質(zhì)譜應(yīng)用APCI離子源可以為色譜法分離的PT異構(gòu)體的母核鑒別提供可靠數(shù)據(jù)。

2.4.4.3 電噴霧電離源(ESI) Olmo-García等[44]用兩種不同電離源的探測器,對(duì)橄欖皮和樹葉提取物中PT次生植物代謝物進(jìn)行測定,包括:高二根醇、熊果醇、山楂酸、樺木酸、齊墩果酸和熊果酸。PT可以作為植物代謝保護(hù)劑,環(huán)繞在植物表面(葉、莖、花和果實(shí)),作為表皮蠟的一部分。研究使用ESI和APCI作為檢測系統(tǒng)的電離源對(duì)這些微量物質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確測定,并檢查這兩個(gè)電離源的結(jié)果吻合度。結(jié)果表明,ESI最低檢測極限:3~455 μg·L-1,其次為APCI:22~408 μg·L-1;ESI有最寬的動(dòng)態(tài)范圍,且這兩種探測器的定量結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4.4.4 大氣壓光學(xué)電離源(APPI) Rhourrifrih等[45]用APPI和APCI研究了天然樹脂材料中PT類化合物組成,因PT種類多,其中還存在大量的同分異構(gòu)體。故用軟電離APPI可防止化合物碎裂后碎片多、信息雜,有助于化合物鑒定。并研究了3種摻雜劑:甲苯、丙酮和茴香醚對(duì)APPI-MS(包括:MS譜的靈敏度和定性離子)的影響。在選定的離子監(jiān)測條件下,線性范圍在0.005~0.015 mg·L-1內(nèi)定量測定,而APPI和APCI檢測范圍均為0.002~0.84 mg·L-1,范圍的廣度是由所研究PT的種類決定的。結(jié)論是在正離子模式下,APPI比APCI更敏感,而APCI對(duì)酸性三萜的敏感性最高。

綜上幾個(gè)離子源的優(yōu)勢(shì):EI、APCI、APPI、ESI除了提供分子質(zhì)量信息外,也提供了關(guān)于分子中功能基團(tuán)的存在的結(jié)構(gòu)信息;研究證明APCI與APPI相比,APCI特別適用于非極性小分子的電離;APPI特別適合于中性小分子的電離。缺陷:EI硬電離使PT碎裂后碎片多、信息雜,不利于識(shí)別;LC-ESI/MS方法目前只涉及酸性三萜類化合物,而中性三萜類化合物,則不能很容易被ESI離子化。

3 結(jié)論

近年來,PT類功效成分研究已成為食品、藥品以及藥食同源產(chǎn)品研究的熱點(diǎn)。隨著檢測技術(shù)的不斷提高,色譜和波譜技術(shù)也越來越多地運(yùn)用到PT的分離分析中,各實(shí)驗(yàn)室采用不同的分析方法,如TLC-UV、GC-FID、GC-MS、HPLC-UV、HPLC-FLD、HPLC-MS、SFC-ELSD、SFC-UV、CZE-UV以及PGC-UV等對(duì)PT類化合物進(jìn)行確證分析。其中氣相、薄層法、光譜法操作簡單,但靈敏度低;液相法、超臨界流體、質(zhì)譜法靈敏度高,但由于PT五環(huán)不易碎裂,不能形成定性碎片離子。隨著科技的發(fā)展,色譜和質(zhì)譜檢測技術(shù)逐漸趨向成熟化,而質(zhì)譜聯(lián)用以及更換不同的電離源可以解決目標(biāo)物定性和定量問題,使檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠。PT類功效成分的檢測對(duì)人體健康至關(guān)重要,在今后的研究過程中還應(yīng)不斷開發(fā)新的色譜和波譜檢測法,以便盡可能快速、便捷檢測天然產(chǎn)物中PT成分,為今后充分開發(fā)營養(yǎng)藥物及膳食添加產(chǎn)品發(fā)揮重要作用。

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