張智剛 魏?jiǎn)⒊?范學(xué)偉

（1黑龍江省肇東市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，黑龍江肇東 151100；2哈爾濱中科基因技術(shù)有限公司，黑龍江哈爾濱150028；3黑龍江農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)職業(yè)學(xué)院，黑龍江牡丹江 157041）

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的豬的一種急性、高度傳播性的腸道疾病。不同年齡的動(dòng)物均容易感染PEDV，常引起新生仔豬嘔吐、嚴(yán)重水樣腹瀉和脫水，死亡率可達(dá)100%。近年來(lái)，雖然我國(guó)乃至全球許多豬群接種了CV777株相關(guān)疫苗，但哺乳仔豬依然感染PEDV，出現(xiàn)高死亡率。多項(xiàng)研究表明，造成PED疫情暴發(fā)流行的病因?yàn)楦叨玖EDV變異株，與經(jīng)典CV777株的原型株相比具有顯著遺傳差異。因此，從分子生物學(xué)角度對(duì)PEDV進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析顯得越來(lái)越重要。

PEDV為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，分別由S基因、E基因、M基因和N基因編碼的纖突蛋白（spike protein,S）、小包膜蛋白（envelope protein,E）、膜糖蛋白（membrane protein,M）、核衣殼蛋白（nucleocapsid protein,N）4種結(jié)構(gòu)蛋白，以及3個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（復(fù)制酶1a、1b和ORF3）構(gòu)成。目前研究該病毒遺傳變異多對(duì)其S基因、M基因和ORF3基因進(jìn)行分析比對(duì)。M基因編碼M蛋白，其能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)病毒的中和抗體，其作為膜糖蛋白，參與病毒粒子組裝和出芽，在此過(guò)程中發(fā)揮重要作用。M基因PEDV各毒株之間高度保守，經(jīng)常被研究者用來(lái)研究野生毒株的多樣性，并用來(lái)對(duì)臨床分離毒株之間的遺傳關(guān)系進(jìn)行分析比對(duì)，因此對(duì)PEDV M基因的檢測(cè)分析可以用來(lái)判定PEDV流行毒株的流行類型，同時(shí)M基因目前還可以作為PEDV分子分群的重要依據(jù)。S蛋白是纖突蛋白，也是病毒重要的膜蛋白之一，是PEDV所有蛋白中抗原性最強(qiáng)的，它可以與宿主細(xì)胞的受體分子相互作用，從而在病毒的入侵和中和抗體的誘導(dǎo)方面發(fā)揮重要作用。最新研究也表明，S基因是重要的毒力基因，也常被用來(lái)對(duì)PEDV的遺傳變異進(jìn)行研究。ORF3蛋白能夠形成離子通道，提高病毒的感染效率。ORF3基因與PEDV細(xì)胞適應(yīng)性和病毒毒力有關(guān)，細(xì)胞傳代致弱毒的ORF3基因會(huì)發(fā)生突變而喪失其離子通道功能，所以該基因除了用于PEDV遺傳變異分析外，也可用于鑒別PEDV強(qiáng)、弱毒株。

有研究者對(duì)我國(guó)華南地區(qū)PEDV流行株M基因進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果顯示，各流行株間M基因核苷酸序列與國(guó)內(nèi)參考株LJB/03的同源性為96.9%～97.5%，與國(guó)內(nèi)較早分離株CH/S和經(jīng)典毒株CV777的同源性分別為97.5%～98.1%、97.7%～98.2%，與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)參考株的同源性為96.9%～99.7%。結(jié)果表明華南PEDV流行株，尤其近年來(lái)的廣東PEDV流行株可能形成獨(dú)特進(jìn)化分支，廣東PEDV流行株與部分國(guó)外毒株以及華南地區(qū)分離株均屬于II、III群，但是親緣關(guān)系較近，處于同一分支；與大部分屬于I群的代表性毒株、疫苗株非同一系，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)[1]。而研究發(fā)現(xiàn)安徽省PEDV分離株M基因除AH1304外均在第13氨基酸位點(diǎn)出現(xiàn)E→Q突變；6個(gè)N的核苷酸與氨基酸均未出現(xiàn)片段的增多或者缺失的現(xiàn)象。同源性分析顯示：M基因與參考毒株的核苷酸序列同源性分別為97.5%～100%，氨基酸同源性分別為97.8%～100%，遺傳進(jìn)化樹(shù)分析表明分離株中AH1304株與弱毒株SD-M和attenuated DR13親緣性最近，其余安徽毒株與2013年美國(guó)流行毒株IA1和2012年中國(guó)流行毒株AH2012親緣關(guān)系更近；所有安徽PEDV毒株均與CV777標(biāo)準(zhǔn)毒株、中國(guó)LZC毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)[2]?？梢?jiàn)安徽省PEDV流行株也為變異株。

PEDV的S基因可分為S1基因和S2基因，其中S1基因更具遺傳變異性，通過(guò)分析PEDV分離株S1基因的遺傳變異性可以部分了解該毒株的變異情況，用于PEDV毒株變異和親緣關(guān)系等研究。對(duì)華北地區(qū)PEDV分離株的S1基因序列進(jìn)行擴(kuò)增與分析發(fā)現(xiàn)，PEDV分離株S1基因序列大小一致，其核苷酸和氨基酸序列同源性分別為97.3%～99.6%和91.4%～92.7%，但與CV777疫苗株同源性較低，而與國(guó)內(nèi)PEDV流行株的同源性較高，這與國(guó)內(nèi)多個(gè)研究報(bào)道基本一致。遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示，華北地區(qū)分離株位于G2b亞群，與中國(guó)流行的PEDV分離株相距較近，與疫苗株所屬分支相隔較遠(yuǎn)，說(shuō)明這些地區(qū)流行的PEDV毒株為變異株，可以部分解釋PEDV CV777弱毒疫苗對(duì)該地區(qū)流行的PEDV毒株防控效果較差的原因[3,4]。2015年黑龍江省分離株S1基因的核苷酸同源性分析發(fā)現(xiàn)其同源性為96.6%～100%，其中HLJ2015／DPI-1毒株與經(jīng)典毒株CV777相比，S1基因在1 130～1 141bp處有12個(gè)核苷酸的缺失；S1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示，PEDV S1基因分為GⅠ群和GⅡ群，此次試驗(yàn)鑒定的PEDV毒株屬于GⅡ群的nonS—INDEL型毒株[5]。對(duì)云南6株P(guān)EDV分離株S基因分析顯示，2018和2013年云南分離株親緣關(guān)系都較遠(yuǎn)，2013年的分離株主要為G2b亞群，而2018年的分離株主要為G2a和G2c亞群，并且在216位氨基酸上預(yù)測(cè)的N-糖基化位點(diǎn)出現(xiàn)NSSI→NSSF突變，尤其是中和抗原表位COE結(jié)構(gòu)域中的絲氨酸取代而導(dǎo)致其可預(yù)測(cè)磷酸化，這些變異很可能會(huì)影響其抗原性和疫苗效果，導(dǎo)致PEDV控制效果不好[6]。這些研究結(jié)果將有利于相應(yīng)地區(qū)PED科學(xué)防控措施的制定與實(shí)施，從而保障生豬養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

ORF3基因也被用于對(duì)PEDV的遺傳進(jìn)化分析。王恩雨等[5]利用RT-PCR方法對(duì)2015年在黑龍江省采集的35份PEDV陽(yáng)性病料進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示ORF3基因核苷酸同源性為98.8%～100%，結(jié)合S1基因檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)該試驗(yàn)鑒定的PEDV毒株屬于GⅡ群的nonSINDEL型毒株。南文金等[7]2015年對(duì)粵北地區(qū)新生仔豬腹瀉樣品中分離的5株P(guān)EDV流行毒株ORF3基因進(jìn)行測(cè)序分析顯示，5個(gè)流行毒株ORF3基因全長(zhǎng)均為675 bp，相互間核苷酸同源性為98.7%～100.0%，與參考序列同源性為94.5%～100.0%，多個(gè)核苷酸位點(diǎn)發(fā)生了共同突變。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明，PEDV可分為2個(gè)基因群，粵北地區(qū)流行的PEDV與2013—2015年間在中國(guó)部分地區(qū)、東南亞、北美洲和歐洲流行的PEDV遺傳關(guān)系較近，位于基因1群中的同一個(gè)亞群，而2011—2012年中國(guó)流行的PEDV主要毒株及疫苗毒株則歸類于另外2個(gè)基因亞群。結(jié)果表明，粵北地區(qū)新生仔豬腹瀉主要是由PEDV感染引起的，PEDV基因隨著時(shí)間推移呈現(xiàn)不斷進(jìn)化和變異趨勢(shì)。有研究者對(duì)6株安徽PEDV毒株的ORF3進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果顯示其全長(zhǎng)675 bp，編碼224個(gè)氨基酸，均比attenuated DR13弱毒株多17個(gè)氨基酸；與CV777標(biāo)準(zhǔn)株相比，有2個(gè)ORF3分別出現(xiàn)了1個(gè)新變異氨基酸；同源性分析顯示ORF3與參考毒株的核苷酸序列同源性為98.8%～100%，結(jié)合其他基因遺傳變異分析這些分離株為變異株[2]。另外，現(xiàn)有的PEDV弱毒疫苗株均為ORF3基因缺失毒株，而能引起自然感染發(fā)病的毒株ORF3基因沒(méi)有缺失，基于ORF3基因鑒別疫苗免疫和野毒感染的檢測(cè)方法對(duì)于該病的診斷具有明顯優(yōu)勢(shì)。

目前常見(jiàn)研究人員在對(duì)PEDV分析時(shí)把S1、M和ORF3基因序列測(cè)定后，結(jié)合起來(lái)進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，這樣更加準(zhǔn)確。國(guó)內(nèi)很多研究已證實(shí)國(guó)內(nèi)各地流行株與經(jīng)典毒株和疫苗株相比，其M基因和ORF3基因發(fā)生了變異，且臨床出現(xiàn)或與疫苗株相似或與變異株相似的流行毒株，這也許是我國(guó)近年來(lái)PEDV免疫失敗或保護(hù)率不佳的主要原因。所以從分子生物學(xué)角度對(duì)PEDV進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，對(duì)該病的防治、疫苗研制以及流行病學(xué)研究都有極其重要的意義。