胡 靜 李章華

1.武漢體育學(xué)院研究生院，湖北武漢 430079；2.武漢大學(xué)同仁醫(yī)院（武漢市第三醫(yī)院）骨科，湖北武漢 430074

閉合性不完全肌腱損傷在運(yùn)動(dòng)和生活中都十分常見(jiàn)，因解剖結(jié)構(gòu)特異和無(wú)法自我腱性修復(fù)（只能瘢痕愈合）而留有后遺癥，給患者及其家庭帶來(lái)壓力[1]。近年來(lái)，隨著組織工程和基因工程的發(fā)展，給肌腱修復(fù)帶來(lái)了希望[2]。干細(xì)胞是具有自我復(fù)制功能的細(xì)胞，一定條件下可分化為多種功能細(xì)胞，目前，用于肌腱修復(fù)較成熟的有：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）、肌腱干細(xì)胞（TDSCs）和胚胎干細(xì)胞（ESCs）[3]。BMSCs 從骨髓中分離出來(lái)，具有自我增殖和多向分化能力，特定條件下可向肌腱、骨、軟骨等組織分化，是肌腱組織修復(fù)的重要種子細(xì)胞來(lái)源[4]。TDSCs 與肌腱細(xì)胞類似，經(jīng)TDSCs 修復(fù)的肌腱很大程度上滿足了肌腱的力學(xué)要求，是很多高水平運(yùn)動(dòng)員的首選[5]。ESCs 是分化肌腱組織的原始細(xì)胞，其“再生記憶功能”能夠在植入的個(gè)體環(huán)境中增殖、分化，為具有完全生理結(jié)構(gòu)和正常功能的肌腱組織[6]。

生長(zhǎng)因子是通過(guò)與高親和的特異細(xì)胞膜受體結(jié)合，調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)周期的多肽類物質(zhì)。其作用時(shí)幾乎都存在時(shí)間、劑量依賴和生物活性衰退等問(wèn)題，通過(guò)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將生長(zhǎng)因子轉(zhuǎn)染到組織或細(xì)胞，能增強(qiáng)表達(dá)特定蛋白，達(dá)到緩慢持續(xù)釋放的效果[7]。常見(jiàn)肌腱愈合的生長(zhǎng)因子包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、骨形成蛋白和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等，被廣泛用于肌腱損傷的基因治療[8-9]。目前，應(yīng)用干細(xì)胞和基因技術(shù)治療多種疾病，但專題報(bào)道促進(jìn)閉合性不完全肌腱損傷修復(fù)的文獻(xiàn)較少。本文綜合近年臨床和實(shí)驗(yàn)研究，為干細(xì)胞和基因技術(shù)促進(jìn)閉合性不完全肌腱損傷修復(fù)做一綜述。

1 肌腱損傷概述

1.1 肌腱的解剖結(jié)構(gòu)及損傷后愈合過(guò)程

肌腱由分布散亂的梭形腱和縱行排列的膠原纖維構(gòu)成。膠原纖維呈螺旋形、線形和交叉走形，由纖維細(xì)胞基質(zhì)分隔成束，其腱鞘被覆于淺層，同時(shí)融合了肌腱腱系膜和血管系膜，在腱系膜中有動(dòng)脈[10]。肌腱來(lái)自血管的營(yíng)養(yǎng)較少，自身的修復(fù)愈合能力十分有限，僅通過(guò)瘢痕形成來(lái)愈合，愈合后容易出現(xiàn)瘢痕及鈣化等并發(fā)癥[11]。肌腱愈合大體概括為3 個(gè)階段：炎性反應(yīng)期、增殖修復(fù)期和重塑期，這3 個(gè)階段互有重疊。在第一階段，中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞伴隨紅細(xì)胞移動(dòng)到受損處，傷后最初1 d 內(nèi)巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞也同樣被動(dòng)員，到損傷局部吞噬壞死組織。釋放一系列如化學(xué)趨化因子等激活血管生成和腱細(xì)胞增殖。炎癥通常只持續(xù)1 周左右，隨即是增殖修復(fù)期，此過(guò)程持續(xù)1 個(gè)月左右。損傷局部的腱細(xì)胞參與合成大量蛋白聚糖和膠原，黏多糖和水分聚集較多后開(kāi)始肌腱的重塑，此過(guò)程可分為強(qiáng)化期和成熟期[12]。

1.2 運(yùn)動(dòng)員肌腱損傷特點(diǎn)

從外觀來(lái)看，肌腱損傷分閉合性損傷和開(kāi)放性損傷；從組織連續(xù)性來(lái)看，分完全斷裂和不完全斷裂損傷；還有夾雜在一起的混合性損傷。不同類型，治療方法不同[13]。專業(yè)運(yùn)動(dòng)員多因其專項(xiàng)動(dòng)作的反復(fù)練習(xí)形成肌腱勞損和部分?jǐn)嗔褤p傷，如田徑運(yùn)動(dòng)員以快速跑、跳類訓(xùn)練居多，爆發(fā)性運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致髕腱重復(fù)應(yīng)力增加，損傷概率大。維多利亞體育評(píng)估研究所對(duì)近幾年的髕骨肌腱病調(diào)查發(fā)現(xiàn)，除了病理因素外，因運(yùn)動(dòng)相關(guān)工作造成肌腱病占69%[14]；速度、對(duì)抗型運(yùn)動(dòng)員要求快速的移動(dòng)能力和強(qiáng)勁的爆發(fā)力，肌腱負(fù)荷的強(qiáng)度、方向和時(shí)間快速改變，肌腱損傷的概率會(huì)大大增加，如羽毛球運(yùn)動(dòng)員跟腱部分?jǐn)嗔褌鸞15]。業(yè)余健身愛(ài)好者大多集中在周末或節(jié)假日鍛煉，因缺乏平時(shí)訓(xùn)練和對(duì)運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度不敏感，極易出現(xiàn)肌腱牽拉傷，Xu 等[16]在兔模型上證實(shí)了這個(gè)現(xiàn)象。

1.3 肌腱損傷治療現(xiàn)狀

閉合性不完全肌腱損傷臨床上常出現(xiàn)疼痛、滲出、紅腫和功能障礙等癥狀，在病理學(xué)上最直接的表現(xiàn)就是肌腱炎和腱鞘炎[17]。目前，國(guó)內(nèi)外臨床治療肌腱損傷的方法有口服非甾體類消炎止痛藥、應(yīng)用傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的中藥熏洗和針灸理療、現(xiàn)代聲光電康復(fù)治療等[18]。運(yùn)動(dòng)過(guò)程中急性肌腱損傷大多需要制動(dòng)，石膏或者繃帶固定只能阻止肌腱二次損傷，并不能使肌腱自然愈合，如果恢復(fù)不好常常有攣縮或異位鈣化等后遺癥。慢性勞損和肌腱病常采取休息、口服非甾體類消炎藥和物理治療，同樣只能緩解部分癥狀，不能促進(jìn)肌腱的自然愈合[19]，其反復(fù)疼痛嚴(yán)重影響運(yùn)動(dòng)員的訓(xùn)練和比賽成績(jī)，中國(guó)飛人劉翔就是因肌腱病最終影響了他的成績(jī)和運(yùn)動(dòng)壽命。鑒于此，一是專業(yè)運(yùn)動(dòng)員及廣大運(yùn)動(dòng)愛(ài)好者要高度重視此??；二是急需找到肌腱損傷更好的新型療法。

2 干細(xì)胞促進(jìn)肌腱愈合的研究進(jìn)展

2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

BMSCs 是從骨髓中分離得到的非造血基質(zhì)干細(xì)胞，具有多向分化潛能，能夠分化為成骨細(xì)胞、肌腱細(xì)胞等。BMSCs 容易分離和體外培養(yǎng)，幾乎無(wú)免疫原性，易于外源基因轉(zhuǎn)染和表達(dá)[4]。外源目的基因通過(guò)病毒載體整合至BMSCs 基因組中更容易自我更新并分化為特定肌腱組織細(xì)胞[7]。因取材簡(jiǎn)便、來(lái)源廣泛等優(yōu)點(diǎn)，BMSCs 已成為組織工程領(lǐng)域中多種組織再生重要的種子細(xì)胞來(lái)源[20]。近年來(lái)，干細(xì)胞治療成為臨床和科研的一個(gè)新熱點(diǎn)。BMSCs 已成熟應(yīng)用在骨和軟骨的修復(fù)，臨床試驗(yàn)中也可發(fā)現(xiàn)這種新的治療方法，但是用于肌腱的修復(fù)及再生，BMSCs 的研究才走出第一步。Wang 等[21]研究揭示，VEGF 轉(zhuǎn)染64 只雞的128 個(gè)指伸肌腱，組織轉(zhuǎn)染效率達(dá)到100%，并在轉(zhuǎn)染后2、4、6、8 周檢測(cè)肌腱愈合相關(guān)指標(biāo)，結(jié)果證實(shí)轉(zhuǎn)染的基因可在損傷部位維持較長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)，并且可以顯著提高肌腱愈合，不會(huì)加重肌腱愈合后的黏連。該研究證實(shí)BMSCs 可作為修復(fù)閉合性不完全肌腱損傷的種子細(xì)胞。BMSCs 具有克隆形成、自我增殖和多向分化的能力，在特定條件下可向肌腱、骨、軟骨、脂肪等分化[4]。因具有這些特性，BMSCs 被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和臨床治療[22]。近年來(lái)，BMSCs 的應(yīng)用被引入運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，用于修復(fù)運(yùn)動(dòng)過(guò)程中產(chǎn)生的急性或慢性不完全肌腱損傷。Bi 等[23]用手術(shù)方法造成大鼠髕腱不完全斷裂模型，然后將BMSCs 和VEGF 轉(zhuǎn)染后的BMSCs 分別注入髕腱缺損處，同時(shí)以普通生物材料修補(bǔ)和完全空白為對(duì)照組。術(shù)后第4、8、12 周取材進(jìn)行檢測(cè)，比較各組之間肌腱修復(fù)標(biāo)志物的表達(dá)。經(jīng)組織形態(tài)學(xué)和生物力學(xué)綜合分析，VEGF 轉(zhuǎn)染后BMSCs 可縮短愈合時(shí)間、促進(jìn)肌腱愈合，同時(shí)對(duì)肌腱的生物學(xué)特性也有改善作用，且效果明顯優(yōu)于普通生物材料修補(bǔ)和單純的BMSCs 組。Liu 等[24]用新西蘭大白兔建立跟腱損傷模型，設(shè)置BMSCs 組、自體肌腱移植組和空白對(duì)照組，8 周后取材觀察肌腱愈合情況。結(jié)果顯示，新西蘭大白兔BMSCs 組可促進(jìn)跟腱損傷愈合，其療效優(yōu)于其他兩組。上述可知，BMSCs 應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域組織的修復(fù)已有一定基礎(chǔ)，為后續(xù)研究奠定了基石。

2.2 肌腱干細(xì)胞

TDSCs 又叫肌腱祖細(xì)胞，2007 年Zhang 等[25]成功從人腘繩肌和小鼠髕腱提取出來(lái)。TDSCs 不僅具有自我更新、克隆形成以及多向分化的潛能，還具有干細(xì)胞特性，其與肌腱細(xì)胞相關(guān)基因和蛋白表達(dá)較高[26]。隨后研究者從人、大鼠、小鼠、馬等不同部位肌腱中也成功地將TDSCs 分離出來(lái)，用于進(jìn)行肌腱修復(fù)和肌腱生理病理的研究[27]。Tian 等[28]研究提示，植入自體TDSCS 修復(fù)有窗口樣缺損的大鼠髕腱損傷進(jìn)行觀察，1 個(gè)月后膠原蛋白表達(dá)水平升高，纖維束和肌腱細(xì)胞有更加規(guī)則有序的排列。接受TDSCS 治療者肌腱生物力學(xué)性能顯著高于未接受TDSCS 治療者。結(jié)論顯示，在肌腱損傷修復(fù)過(guò)程中TDSCS 起關(guān)鍵作用。相對(duì)于BMSCs 而言，TDSCs 具備更好的增殖潛能，能夠形成較多細(xì)胞集落，還能表達(dá)更多的肌腱標(biāo)志相關(guān)基因，如scleraxix、tenomodulin 等；此外，TDSCs 還可以有更多肌腱細(xì)胞的胞外基質(zhì)產(chǎn)生，如核心蛋白聚糖，Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白等。因此，TDSCs 可作為理想的細(xì)胞來(lái)修復(fù)肌腱損傷[29]，但調(diào)控TDSCs 的因素非常多，常見(jiàn)因素有氧分壓、細(xì)胞外基質(zhì)、機(jī)械負(fù)荷和生物因素等，作用機(jī)制復(fù)雜、特性尚不完全清楚[30]，其在研究和臨床中的應(yīng)用仍受到很大限制，需進(jìn)一步研究。

2.3 胚胎干細(xì)胞

ESCs 是來(lái)源于胚胎的多能干細(xì)胞，具有分化為不同類型細(xì)胞和無(wú)限增殖的潛能。研究[31]提示，人和部分動(dòng)物皮膚破損之后，能夠無(wú)瘢痕、功能性愈合，但是成體組織不行，這說(shuō)明ESCs 可能存在某些“再生記憶功能”，能夠在植入的個(gè)體環(huán)境中增殖、誘導(dǎo)分化為具有完全生理結(jié)構(gòu)和功能的正常組織。研究[32]發(fā)現(xiàn)ESCs 修復(fù)肌腱損傷的可行性并探討其相應(yīng)機(jī)制，通過(guò)肌腱特殊基因和結(jié)構(gòu)表達(dá)證實(shí)了肌腱組織模型中ESCs 再生的肌腱組織。Tang 等[33]用ESCs 修復(fù)肌腱比對(duì)照組有更好的結(jié)構(gòu)和力學(xué)特性，而且其活性可以在肌腱損傷處保持更長(zhǎng)時(shí)間。此外，ESCs 可以通過(guò)分泌一些肌腱特殊基質(zhì)和分化因子，使肌腱內(nèi)源性再生程序被進(jìn)一步喚醒。前述可知，ESCs 具有某些特殊“記憶功能”，對(duì)具有完全生理結(jié)構(gòu)和正常功能的肌腱組織有再生能力。在肌腱損傷處分泌的人胚胎特異基質(zhì)和分化因子促進(jìn)了肌腱再生，為肌腱修復(fù)提供了新方案和理論基礎(chǔ)。

2.4 BMSCs、TDSCs、ESCs 三者間比較

BMSCs、TDSCs、ESCs 在不同的條件下都能向肌腱分化，但具有各自的特點(diǎn)。BMSCs 是肌腱組織工程中應(yīng)用廣泛的種子細(xì)胞，從目前報(bào)道來(lái)看其完全再生肌腱還不成熟，且有一定程度的異位骨化，基因轉(zhuǎn)染濃度和時(shí)間等都還需進(jìn)一步探索[34]；TDSCs 被鑒定為一個(gè)獨(dú)特的干細(xì)胞群體后廣泛用于肌腱修復(fù)，但其來(lái)源有限，一定程度上限制了其發(fā)展[26]；ESCs 再生記憶功能能實(shí)現(xiàn)向受損組織完全復(fù)制，只是從胎兒提取用以科研和臨床不現(xiàn)實(shí)，大多用ESCs 來(lái)源的MSCs 構(gòu)建出肌腱組織[31]。

3 生長(zhǎng)因子促進(jìn)損傷肌腱修復(fù)的研究進(jìn)展

3.1 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

VEGF 是一種內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂原，通過(guò)激活一氧化氮合酶增加毛細(xì)血管的通透性，促進(jìn)血管生成[34]。人體組織損傷修復(fù)主要依靠神經(jīng)和血管參與，肌腱修復(fù)過(guò)程中最關(guān)鍵的是產(chǎn)生和維持有功能的微血管網(wǎng)絡(luò)，為肌腱生長(zhǎng)、分化和功能化提供氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[9,35]。VEGF 可以激活內(nèi)皮細(xì)胞，刺激使其以因子在受損部位以濃度梯度募集，促進(jìn)細(xì)胞整合，血管形成和成熟[36]，上調(diào)的成血管生長(zhǎng)因子包括VEGF、FGF 和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，其都對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞向肌腱分化起到促進(jìn)作用。研究[37]提示，BMSCs 向肌腱細(xì)胞分化過(guò)程中，VEGF 通過(guò)促進(jìn)相關(guān)基因表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和改善微環(huán)境，使腱細(xì)胞凋亡和腱細(xì)胞生成達(dá)到一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，進(jìn)而修復(fù)受損的肌腱組織[38]。

3.2 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor-β，TGF-β）是一類多功能蛋白多肽，有調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、調(diào)控細(xì)胞增殖、促進(jìn)基質(zhì)合成的功能，在肌腱愈合過(guò)程中較為活躍，對(duì)肌腱黏連修復(fù)影響較大[39]。Tuzmen 等[40]在兔模型中對(duì)TGF-β mRNA 的激活進(jìn)行了研究，TGF-β存在于正常肌腱和腱鞘細(xì)胞，它可在肌腱損傷時(shí)被活化，mRNA 上調(diào)明顯。同時(shí)肌腱細(xì)胞、腱鞘細(xì)胞和炎性細(xì)胞中表達(dá)均上調(diào)，對(duì)肌腱的修復(fù)提供了一個(gè)雙重機(jī)制，該實(shí)驗(yàn)顯示，TGF-β 在一定程度上限制損傷肌腱的黏連，阻止肌腱畸形愈合。TGF-β 轉(zhuǎn)染MSCs 成肌腱特性較強(qiáng)，從而達(dá)到修復(fù)肌腱的目的。

3.3 骨形成蛋白

骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）具備成骨誘導(dǎo)活性已廣為人知，研究[41]提示，其在成肌腱分化對(duì)肌腱損傷愈合中亦有不可忽視的作用。有報(bào)道[12]BMP-12 具有誘導(dǎo)BMSCs 成肌腱分化的潛能，還可促進(jìn)肌腱細(xì)胞增殖與分化，使組織工程化肌腱的體外構(gòu)建打下基礎(chǔ)。通過(guò)BMP-12 與大鼠BMSCs 共培養(yǎng)，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SCX 和Tnmd 呈陽(yáng)性表達(dá)，并且隨著時(shí)間推移其表達(dá)量逐漸增多，在14 d 時(shí)趨于穩(wěn)定。該實(shí)驗(yàn)顯示BMP-12 可能在早期誘導(dǎo)肌腱再生中起主導(dǎo)作用。BMP-14 基因治療可顯著促進(jìn)鼠跟腱撕裂傷模型的愈合，基因轉(zhuǎn)染后經(jīng)生物力學(xué)測(cè)試肌腱拉伸強(qiáng)度顯著高于對(duì)照組[42]。

3.4 其他生長(zhǎng)因子

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）已被證實(shí)具有促進(jìn)肌腱組織愈合的作用，并已被用于基因治療。FGF 是一類可通過(guò)與細(xì)胞膜上特異受體相結(jié)合而發(fā)揮多種生物學(xué)作用的多肽分子，它對(duì)細(xì)胞的增殖、新血管形成和細(xì)胞有絲分裂都有促進(jìn)作用，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于各種組織修復(fù)的研究。研究[43]提示，F(xiàn)GF 可促進(jìn)分化中肌腱細(xì)胞發(fā)生遷移和集落形成，促進(jìn)軟骨細(xì)胞和腱細(xì)胞增殖和成熟，可應(yīng)用于跟腱修復(fù)，促進(jìn)機(jī)體愈合。胰島素樣生長(zhǎng)因子（insulinlike growth factors，IGF-1）通過(guò)刺激細(xì)胞分化、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和誘導(dǎo)肌腱標(biāo)志物的表達(dá)可調(diào)節(jié)MSCs 的成肌腱分化。部分學(xué)者認(rèn)為IGF-1 和TGF-β 在成肌腱分化的過(guò)程是相互獨(dú)立而效應(yīng)是相互疊加的[44]。此外，血小板源性生長(zhǎng)因子、低氧誘導(dǎo)因子、甲狀旁腺素等在成肌腱分化過(guò)程中也起著重要作用[45]。運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)@些生長(zhǎng)因子的研究進(jìn)展一直呈持續(xù)關(guān)注狀態(tài)。

4 展望

以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的基因治療促進(jìn)肌腱損傷修復(fù)近年來(lái)被提到一個(gè)新的高度，這種治療方式打破了傳統(tǒng)的醫(yī)藥康復(fù)觀念，隨著研究的深入和完善，有望建立一種全新的治療方法，給廣大肌腱損傷的患者帶來(lái)福音[46]。然而，干細(xì)胞的應(yīng)用目前主要停留在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上，應(yīng)用于患者還需進(jìn)一步的研究。首先，腺病毒和生長(zhǎng)因子雖然能夠增強(qiáng)干細(xì)胞向肌腱組織的轉(zhuǎn)化，但其時(shí)間、濃度依賴性和突變、腫瘤等問(wèn)題還沒(méi)完全解決，無(wú)法進(jìn)行人體實(shí)驗(yàn)；其次，應(yīng)用條件、技術(shù)和倫理等問(wèn)題還有待探索[47]。植入的干細(xì)胞在停泊、生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化、與受體組織的融合、功能發(fā)揮、神經(jīng)體液調(diào)節(jié)等方面的基礎(chǔ)研究還需要繼續(xù)[48]。綜上所述，干細(xì)胞為基礎(chǔ)的基因治療有許多其他藥物無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)，但也存在不少未解決的問(wèn)題，使用于臨床，還需進(jìn)一步的研究和探索。