張大龍 柳玉平 李 洋 馮改利 李清明 魏 珉

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院， 泰安 271018； 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃淮海設(shè)施農(nóng)業(yè)工程科學(xué)觀測實驗站， 泰安 271018；3.山東藍(lán)奧生物技術(shù)有限公司， 濟(jì)南 250001)

0 引言

灌溉制度是作物生理生態(tài)、作物栽培和農(nóng)田水利等學(xué)科的重要研究內(nèi)容，通過優(yōu)化灌溉頻率、灌水時間和灌溉定額可以挖掘作物生產(chǎn)潛力，提高水資源利用效率[1]。光合作用是作物生長的基本驅(qū)動力，土壤水分與植物個體及組織細(xì)胞的水分平衡密切相關(guān)，決定葉片解剖結(jié)構(gòu)和保衛(wèi)細(xì)胞行為，進(jìn)而決定CO2的吸收、運(yùn)輸與同化進(jìn)程。因此，解析土壤水分調(diào)控光合作用的機(jī)理是優(yōu)化灌溉設(shè)計和高效栽培的理論基礎(chǔ)。在植物光合作用過程中，底物CO2首先從外界大氣擴(kuò)散到葉片表層，然后穿過氣孔到達(dá)氣孔下腔，克服葉肉阻力到達(dá)葉綠體羧化位點，由羧化酶進(jìn)行同化。每克服一個阻力，細(xì)胞內(nèi)的CO2濃度都會相應(yīng)降低[2]。番茄是重要的蔬菜作物，設(shè)施及露地栽培廣泛。番茄為C3植物，CO2傳輸阻力較大，其葉綠體內(nèi)有效CO2濃度顯著低于胞間，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足葉綠體內(nèi)羧化反應(yīng)的需求，是提高光合CO2同化能力和挖掘產(chǎn)量潛力的重要限制因子[3]。

CO2需要克服阻力從大氣傳輸?shù)紧然稽c，構(gòu)成“源-流-庫”模式[4]。氣孔僅為CO2由大氣傳輸至葉綠體羧化位點的第一步。早期的光合作用研究中，由氣孔傳輸至葉綠體羧化位點的葉肉阻力對光合作用的限制一般忽略不計?；谧魑锷杷畔⒌奶澣惫喔?、分根交替灌溉等節(jié)水理論與技術(shù)不斷發(fā)展，在大田作物與設(shè)施栽培中得到廣泛應(yīng)用，但傳統(tǒng)節(jié)水理論仍以氣孔作為光合CO2吸收傳輸唯一限速節(jié)點[5-6]。大量研究集中于以氣孔功能為契點，從水分動力傳輸和水分平衡角度解析了氣孔保衛(wèi)細(xì)胞響應(yīng)土壤水分的前饋和反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，揭示土壤水分調(diào)控番茄光合CO2吸收的第一道“門戶”的機(jī)制，為全面定量解析CO2傳輸“源-流-庫”的阻力構(gòu)成及分布奠定了基礎(chǔ)，但對CO2傳輸過程缺乏系統(tǒng)和全面認(rèn)知。隨著碳同位素測量和熒光技術(shù)的發(fā)展，葉肉阻力已被證明是CO2傳輸總阻力的重要組成部分，是除氣孔阻力和羧化反應(yīng)之外的第3個光合效率限制因素，葉肉阻力與氣孔阻力相當(dāng)甚至要大于氣孔阻力，是光合CO2傳輸同化的重要限制因子[7-10]。氣孔限制和非氣孔限制已經(jīng)很難精準(zhǔn)描述土壤水分調(diào)控番茄光合CO2吸收同化機(jī)理，而需要從氣孔阻力、葉肉阻力和羧化反應(yīng)限制3個限制因素解析，但相關(guān)研究鮮見報道。不同土壤水分梯度下番茄光合CO2吸收與傳輸?shù)淖枇Ψ植?、關(guān)鍵限速位點和調(diào)控機(jī)制仍不清晰。

本研究基于葉綠素?zé)晒狻怏w交換和響應(yīng)曲線相結(jié)合的方法，解析不同土壤水分梯度下番茄光合CO2傳輸?shù)母髦Ф巫枇皺?quán)重，量化各支段阻力抑制光合CO2吸收的相對貢獻(xiàn)率，基于“源-流-庫”總路徑闡明土壤水分脅迫限制番茄CO2傳輸與供應(yīng)的關(guān)鍵步驟及位點。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

試驗于2018年5—7月在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝試驗站進(jìn)行(北緯36°09′，東經(jīng)117°09′，海拔126 m)。該試驗區(qū)屬黃淮海平原，溫帶大陸性濕潤季風(fēng)氣候區(qū)。全年平均氣溫12.9℃，平均日照時數(shù)2 627.1 h，平均降水量697 mm。選用番茄品種為圣羅蘭，于四葉一心期定植到塑料盆內(nèi)(高40 cm，直徑30 cm)。栽培基質(zhì)由菜園土與有機(jī)肥按照2∶1(體積比)配制而成，每盆裝基質(zhì)10 kg?；|(zhì)容重為1.37 g/cm3，田間持水率為25.8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。盆內(nèi)表面用地膜覆蓋防止土面蒸發(fā)。根據(jù)水量平衡原理和稱量法[11]將土壤相對含水率控制到40%、50%、60%、70%、80%和90% 6個水平。試驗于日光溫室內(nèi)進(jìn)行，長度43 m，跨度10 m，全鍍鋅鋼管桁架結(jié)構(gòu)。

1.2 原理

CO2“源-流-庫”傳輸模式及阻力分布如圖1所示。圖中，Ca、Cb、Ci、Cc分別表示大氣、葉面、胞間和羧化基的CO2濃度，rb、rs、rm分別表示邊界層、氣孔和葉肉阻力。CO2在不同位點分壓梯度的驅(qū)動下，由高分壓位點克服阻抗向低分壓位點擴(kuò)散。根據(jù)物理學(xué)中表征流體及物質(zhì)擴(kuò)散的一般法則，阻力(R)為分壓差ΔP與通量的比值。

圖1 葉片CO2“源-流-庫”擴(kuò)散過程梯度驅(qū)動力及阻力分布Fig.1 Distribution of driving force and resistance for CO2transport through “source-path-sink”

1.3 氣孔CO2傳輸導(dǎo)度及光合參數(shù)測量

根據(jù)葉綠素?zé)晒?、氣體交換和響應(yīng)曲線擬合相結(jié)合的方法測定并估算不同水分梯度下“源-流-庫”的CO2分壓梯度，根據(jù)氣體擴(kuò)散定律計算氣孔和葉肉導(dǎo)度。在環(huán)境控制良好的室內(nèi)測定，環(huán)境溫度設(shè)30℃，相對濕度70%，光強(qiáng)1 000 μmol/(m2·s)，CO2濃度400 μmol/mol。光合氣體交換及葉綠素?zé)晒獠捎肔i-Cor6400XT型光合作用測量系統(tǒng)所配置的葉室測定。CO2初始濃度設(shè)為400 μmol/mol。待系統(tǒng)穩(wěn)定后，調(diào)用自動程序測定熒光Pn/Ci曲線。測定過程中CO2濃度依次設(shè)定為400、300、200、150、50、400、600、800、1 000、1 500 μmol/mol。葉綠素?zé)晒鉁y定設(shè)定為多閃飽和脈沖模式。待測定完成后，將系統(tǒng)接入低氧環(huán)境，并將光強(qiáng)調(diào)成2 000 μmol/(m2·s)，測定低氧光合熒光響應(yīng)曲線以校正電子傳遞效率。氣孔對CO2的傳輸導(dǎo)度(gsc)根據(jù)氣體交換測量的對水汽傳輸?shù)臍饪讓?dǎo)度(gsH2O)進(jìn)行換算，由于H2O在空氣中的傳播能力為CO2的1.6倍，gsc=gsH2O/1.6[12]。最大羧化速率Vc,max以及最大電子傳遞速率Jmax根據(jù)CO2響應(yīng)曲線及FvCB模型進(jìn)行估算[13]，羧化效率CE為初始階段CO2濃度小于200 μmol/mol時曲線的斜率[14]。

1.4 葉肉CO2傳輸導(dǎo)度計算

根據(jù)氣體擴(kuò)散定律，葉肉導(dǎo)度gm可以由光合CO2同化速率(Pn)與胞間至葉綠體內(nèi)CO2分壓梯度(Ci-Cc)計算[15]，即

(1)

胞間CO2濃度Ci和凈光合速率Pn由氣體交換測得，由于CO2同化的能量可以通過電子傳遞速率進(jìn)行量化，從而可以反推得到Rubisco酶(1,5-二磷酸核酮糖羧化酶)羧化反應(yīng)底物葉綠體內(nèi)CO2濃度

(2)

其中

J=ΦPSⅡPαβ

(3)

式中J——電子傳遞速率

Rd——光照下線粒體呼吸速率(光照下暗呼吸速率)

Γ*——無線粒體呼吸時葉綠體CO2補(bǔ)償點

P——光合光量子通量密度

α——葉片對光量子的吸收效率

β——光量子在光系統(tǒng)間的分配比例

ΦPSⅡ——光系統(tǒng)Ⅱ的光量子效率

Fs——穩(wěn)態(tài)熒光值

1.5 阻力權(quán)重和光合限速分析

類比電流，CO2通過氣孔傳輸至羧化位點“源-流-庫”動力傳輸路徑為串聯(lián)電路，因此總傳輸阻力(1/gtot)可計算為氣孔阻力(1/gsc)與葉肉阻力(1/gm)之和：1/gtot=1/gsc+1/gm。因此，CO2總傳輸導(dǎo)度可計算為

(4)

依據(jù)光合經(jīng)典理論，將光合限速步驟劃分為氣孔限制(Ls)、葉肉限制(Lm)和羧化反應(yīng)限制(Lb)，可通過權(quán)重分析確定關(guān)鍵限速位點和步驟[16]為

(5)

?A/?Cc根據(jù)光合速率-葉綠體內(nèi)CO2濃度響應(yīng)曲線(Pn-Cc，Cc=4×10-5～1.1×10-4)的斜率進(jìn)行估算[17]。

2 結(jié)果分析

2.1 土壤水分對光合參數(shù)的影響及模擬

番茄光合參數(shù)對土壤水分的響應(yīng)呈現(xiàn)相似趨勢：光合速率(Pn)、最大羧化速率(Vc,max)、最大電子傳遞速率(Jmax)及初始羧化效率(CE)在土壤水分充足時達(dá)到最大值，在土壤相對含水率80%～90%范圍內(nèi)波動較為平緩，隨著土壤水分脅迫的增大，光合參數(shù)迅速下降，在重度土壤水分脅迫狀況下(40%～50%)，光合參數(shù)最小，且變化趨勢趨于平穩(wěn)(圖2)。光合參數(shù)隨土壤水分變化整體呈現(xiàn)出“S”形變化曲線，初期緩慢增長，中期迅速增長，末期達(dá)到最大值并趨于穩(wěn)定，可用logistic模型模擬為

(6)

式中a——增長極限，表征土壤水分充足時光合的極限速率

b——截距系數(shù)，為基礎(chǔ)狀態(tài)參數(shù)

c——增長率系數(shù)，表征系統(tǒng)狀態(tài)趨近于頂級的速度

模型均通過顯著性檢驗，光合速率(Pn)、最大羧化速率(Vc,max)、最大電子傳遞速率(Jmax)及初始羧化效率(CE)的模型參數(shù)如表1所示。

圖2 土壤水分對光合速率(Pn)、最大羧化速率(Vc，max)、最大電子傳遞速率(Jmax)及初始羧化效率(CE)的影響Fig.2 Effect of soil moisture on photosynthesis rate(Pn), rubisco carboxylation capacity (Vc，max), maximum electron transport capacity (Jmax) and carboxylation efficiency (CE)

變量模型參數(shù)abcPR2光合速率Pn31.723.860.070.00160.98最大羧化速率Vc,max92.544.720.070.00300.98最大電子傳遞速率Jmax97.124.740.070.00170.98初始羧化效率CE0.415.720.080.00440.97氣孔導(dǎo)度gsc0.839.800.160.00020.99葉肉導(dǎo)度gm0.8412.510.220.00030.99總傳輸導(dǎo)度gtot0.4210.650.180.00030.99

2.2 土壤水分對CO2傳輸導(dǎo)度的影響及模擬

氣孔、葉肉對CO2的傳輸導(dǎo)度及總傳輸導(dǎo)度與光合參數(shù)的響應(yīng)規(guī)律相似，隨土壤水分變化均呈現(xiàn)明顯的“S”形變化曲線(圖3)，氣孔導(dǎo)度、葉肉導(dǎo)度及總CO2傳輸導(dǎo)度隨水分脅迫加重而逐漸減小，這種下降趨勢在土壤相對含水率由70%降到50%時表現(xiàn)最為明顯；當(dāng)土壤水分飽和時，氣孔和葉肉對CO2的傳輸導(dǎo)度為最大值，且趨于穩(wěn)定。

圖3 土壤水分對氣孔導(dǎo)度(gsc)、葉肉導(dǎo)度(gm)及總CO2傳輸導(dǎo)度(gtot)的影響Fig.3 Effect of soil moisture on stomatal conductance (gsc), mesophyll conductance (gm) and total conductance (gtot) for CO2 transport

圖4 氣孔阻力、葉肉阻力和羧化反應(yīng)限速光合速率的相對貢獻(xiàn)率隨土壤水分的變化趨勢Fig.4 Effect of soil moisture on proportion of stomatal limitation, mesophyll limitation and biochemical limitation on photosynthesis

2.3 光合限速步驟解析

在番茄光合CO2吸收與傳輸過程中，各支段阻力及限速光合速率的權(quán)重與土壤水分狀態(tài)密切相關(guān)。如圖4所示，氣孔阻力與葉肉阻力對光合速率限制的相對貢獻(xiàn)率變化趨勢相似，隨著水分脅迫的加重，其貢獻(xiàn)率逐漸增大，可以用指數(shù)函數(shù)模擬(Ls=0.871 8e-0.02x，P<0.01;Lm=0.791e-0.021x，P<0.01)。羧化反應(yīng)對光合速率限制的相對貢獻(xiàn)率與氣孔和葉肉導(dǎo)度相反，隨著水分脅迫的加重，其貢獻(xiàn)率逐漸減小，可以用對數(shù)函數(shù)模擬(Lb=0.698 7lnx-2.378 8，P<0.01)。因此，在土壤水分充足時，羧化反應(yīng)限速光合的相對貢獻(xiàn)率最大，是光合速率的關(guān)鍵限制因子；在水分脅迫狀況下，氣孔阻力和葉肉阻力對光合速率的限制作用占主導(dǎo)地位，羧化反應(yīng)的相對貢獻(xiàn)率較低。

2.4 氣孔與葉肉阻力的影響因素

氣孔由保衛(wèi)細(xì)胞構(gòu)成，葉片水分狀況通過調(diào)控膨壓決定氣孔開放程度，進(jìn)而決定CO2傳輸阻力。本研究中，氣孔對CO2的傳輸導(dǎo)度與葉水勢呈正相關(guān)，隨葉水勢的下降，氣孔導(dǎo)度也呈線性下降趨勢 (圖5a)。葉水勢與土壤含水率關(guān)系密切，葉水勢隨著土壤含水率的下降而下降；氣孔開度受植物水分狀況影響，與葉水勢變化趨勢一致，隨水分脅迫加重，氣孔開度逐漸變小(圖5b)，是導(dǎo)致氣孔CO2傳輸導(dǎo)度下降的重要原因。比葉重是葉片重要經(jīng)濟(jì)性狀，在本研究中與葉肉導(dǎo)度密切相關(guān)，是土壤水分影響葉肉導(dǎo)度的重要途徑。葉肉導(dǎo)度與比葉重呈線性負(fù)相關(guān)關(guān)系，葉肉導(dǎo)度隨比葉重的增大而線性減小(圖6a)；比葉重隨土壤水分脅迫程度的加劇而逐漸增大(圖6b)。

3 討論

圖5 葉水勢與氣孔導(dǎo)度的關(guān)系及對土壤水分的響應(yīng)Fig.5 Response of leaf water potential to soil moisture and relationship with stomatal conductance

圖6 比葉重對土壤水分的響應(yīng)及與葉肉導(dǎo)度的關(guān)系Fig.6 Response of leaf mass area to soil moisture and relationship with mesophyll conductance

基于氣體擴(kuò)散理論全面解析CO2“源-流-庫”傳輸總路徑阻力構(gòu)成及各支段阻力權(quán)重，量化了氣孔限制、葉肉限制和羧化反應(yīng)限制的相對貢獻(xiàn)率，揭示了不同土壤水分梯度下番茄光合CO2傳輸?shù)年P(guān)鍵限速位點，突破了設(shè)施栽培研究中將氣孔作為光合CO2吸收傳輸唯一限速節(jié)點的局限性，拓展并豐富了光合理論，對番茄節(jié)水高效栽培具有重要意義。本研究表明，除氣孔行為以外，葉肉阻力對番茄葉綠體內(nèi)光合底物CO2的供應(yīng)同樣有重要影響；氣孔、葉肉和羧化反應(yīng)對光合限速的相對貢獻(xiàn)率在不同水分狀況下亦有所不同。在土壤水分脅迫狀況下，氣孔和葉肉阻力限制是光合的關(guān)鍵限制因子，而且其相對貢獻(xiàn)率隨土壤水分脅迫的加劇而增大，葉綠體基質(zhì)的羧化反應(yīng)限制對光合的抑制作用較小。在土壤水分充足時，氣孔和葉肉阻力限制對光合速率的抑制作用較小，羧化反應(yīng)限制則成為光合抑制的主導(dǎo)因子。

氣孔控制水流和CO2流，與溶質(zhì)流和能量流以及營養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)有著密切聯(lián)系。氣孔運(yùn)動受植物生理和環(huán)境要素變化的共同影響，氣孔的調(diào)控存在兩個機(jī)理，即保衛(wèi)細(xì)胞膨壓的前饋和反饋調(diào)節(jié)[18]。氣孔能對環(huán)境波動迅速響應(yīng)，進(jìn)而調(diào)控CO2的吸收阻力，氣孔運(yùn)動的直接原因是保衛(wèi)細(xì)胞的膨壓變化，當(dāng)保衛(wèi)細(xì)胞膨壓增大時，保衛(wèi)細(xì)胞膨脹，氣孔開度增大，氣孔對CO2吸收傳輸?shù)膶?dǎo)度亦隨之增大[19]。在土壤水分脅迫狀況下，根系吸水與供水能力不足，葉片水勢和細(xì)胞膨壓低，氣孔關(guān)閉，氣孔對CO2的傳輸導(dǎo)度低，因此，土壤水分脅迫情況下，氣孔限制對光合抑制的相對貢獻(xiàn)率較大。隨著土壤含水率增加，脅迫逐漸緩解，葉片水勢和膨壓逐漸升高，氣孔開度增大，氣孔對CO2的傳輸導(dǎo)度亦隨之增大，氣孔限制對光合抑制的相對貢獻(xiàn)率較小，此時葉綠體內(nèi)CO2濃度較高，光合速率主要受葉綠體基質(zhì)的羧化反應(yīng)限制。

CO2由氣孔下腔傳輸至葉綠體羧化位點的過程，雖然路徑較短，但葉肉阻力對光合抑制的相對貢獻(xiàn)率較大，對CO2吸收傳輸具有重要調(diào)控作用。葉肉導(dǎo)度的變化及相對貢獻(xiàn)率與氣孔相似，均呈“S”形變化曲線，在土壤水分虧缺時，葉肉導(dǎo)度較小，CO2傳輸阻力大，對光合抑制的相對貢獻(xiàn)率較大，是光合速率提高的限制因子。當(dāng)土壤水分充足時，葉肉導(dǎo)度大，對CO2傳輸?shù)南拗谱饔幂^小。與氣孔迅速響應(yīng)環(huán)境變化的膨壓調(diào)控機(jī)制不同，葉片解剖結(jié)構(gòu)是影響葉肉導(dǎo)度的重要因子[20]。在結(jié)構(gòu)層面上影響葉肉導(dǎo)度的依次是葉片厚度、葉肉細(xì)胞孔隙度、細(xì)胞壁厚度、細(xì)胞膜通透性等[21]。葉片厚度增加是植物適應(yīng)干旱脅迫的響應(yīng)機(jī)制之一，可以有效防止過度水分散失[22]。比葉重是表征葉片厚度的重要指標(biāo)，比葉重較大的葉片可能具有較多細(xì)胞或單個細(xì)胞具有較大生物量，葉片較厚，細(xì)胞組織間隙較為緊密，不利于水分散失[23]。雖然比葉重可以保持水分抵御干旱脅迫，但CO2吸收傳輸?shù)淖枇ο鄳?yīng)增大，葉肉對CO2的傳輸導(dǎo)度降低。因此，在本研究中，水分虧缺時，葉片比葉重大，葉片厚度大，CO2吸收傳輸阻力大，對光合速率的抑制作用明顯。隨著土壤含水率的增大，葉片比葉重降低，葉面積大而薄，葉肉組織分化程度低，氣腔和通氣組織發(fā)達(dá)，葉肉組織間隙疏松。CO2在葉肉組織中的傳輸阻力較小，因而在水分充足時對光合速率的限制作用較小。CO2以被動運(yùn)輸方式跨越細(xì)胞膜和葉綠體膜，水通道蛋白在CO2跨膜運(yùn)輸過程中顯得尤為重要[24-25]。目前已發(fā)現(xiàn)，水通道蛋白能夠促進(jìn)跨膜快速CO2傳輸，主要由質(zhì)膜水通道蛋白PIP1s小家族負(fù)責(zé)，其表達(dá)量與葉肉阻力和光合速率密切相關(guān)[25-26]。解析質(zhì)膜通道蛋白在不同水分梯度下的活性以及對葉肉導(dǎo)度的調(diào)控機(jī)理仍需深入探討，將是本研究的下一步工作。

4 結(jié)論

(1)番茄光合速率(Pn)、最大羧化速率(Vc,max)、最大電子傳遞速率(Jmax)及初始羧化效率(CE)隨土壤含水率變化呈“S”形變化曲線，初期緩慢增長，中期迅速增長，末期達(dá)到最大值并趨于穩(wěn)定，可用logistic函數(shù)模擬。

(2)氣孔、葉肉對CO2的傳輸導(dǎo)度及總傳輸導(dǎo)度隨土壤含水率變化均呈明顯的“S”形變化曲線，氣孔導(dǎo)度、葉肉導(dǎo)度及總CO2傳輸導(dǎo)度在土壤水分充足時趨于穩(wěn)定并達(dá)到最大值；隨著土壤水分脅迫的加重，各支段導(dǎo)度及總CO2傳輸導(dǎo)度逐漸降低，并在重度土壤水分脅迫狀況下達(dá)到最低，可用logistic函數(shù)模擬。

(3)氣孔導(dǎo)度與葉肉導(dǎo)度對光合速率限制的相對貢獻(xiàn)率變化趨勢相似，隨著水分脅迫的加重，其貢獻(xiàn)率逐漸增大，可以用指數(shù)函數(shù)模擬；羧化反應(yīng)對光合速率限制的相對貢獻(xiàn)率與氣孔和葉肉導(dǎo)度相反，隨著水分脅迫的增大，其貢獻(xiàn)率逐漸減小，可以用對數(shù)函數(shù)模擬；在土壤水分充足時，葉綠體內(nèi)CO2濃度充足，羧化反應(yīng)限速光合速率的相對貢獻(xiàn)率最大，是關(guān)鍵限制因子；在水分脅迫狀況下，氣孔限制和葉肉限制占主導(dǎo)地位，羧化反應(yīng)的相對貢獻(xiàn)率較低。

(4)氣孔對CO2的傳輸導(dǎo)度與葉水勢呈正相關(guān)，隨葉水勢的下降，氣孔導(dǎo)度也呈線性下降趨勢；葉肉導(dǎo)度與比葉重呈線性負(fù)相關(guān)關(guān)系，葉肉導(dǎo)度隨比葉重的增大而線性減小，比葉重隨土壤水分脅迫程度的加劇而逐漸增大。