牛飛 馮晶 夏平

（1湖北省武漢市江漢大學醫(yī)學院 湖北 武漢 430000）

（2湖北省武漢市第一醫(yī)院骨脊柱外科 湖北 武漢 430022）

BJTB是肺外結核的常見類型，可占全部結核的3.0%～5.0%，占肺外結核的11.3%～34.5%盡管其發(fā)生率僅次于胸膜和淋巴結核，但主要好發(fā)于30歲以下青年和兒童，并由于骨質破壞導致肢體畸形、神經(jīng)受壓等并發(fā)癥，嚴重影響患者的生活質量，常需要手術干預治療[1-2]。BJTB的臨床診斷常依據(jù)病史、臨床癥狀，并結合影像學、實驗室檢查如血沉和C反應蛋白初步診斷；解剖或外科手術取材的病理學和細菌學培養(yǎng)予以證實診斷[3]。在中國，骨與關節(jié)結核患者從最初出現(xiàn)臨床癥狀到明確診斷，平均需要的時間長達13.16月[4]，反映嚴重缺乏快速有效的診斷方法。因此，研究更敏感、快速和特異的方法，快速準確的診斷BJTB，對防治該病具有重要意義。

1.資料與方法

1.1 質粒

重組原核表達質粒（pETHBHA）和重組分枝桿菌表達質粒（pMVHBHA）均由同濟醫(yī)學院病原生物學系保存。

1.2 研究對象

倫理經(jīng)武漢市第一醫(yī)院倫理委員會批準。所有參與研究的患者均提供知情同意書。

BJTB組：來自本院住院病例，共收集30病例。

TB組：來自本院住院病例，共收集30病例。

健康對照組：來自本院健康體檢人群，共收集30例。

1.3 標本采集

三組病例均無菌采集外周抗凝血10ml；標本保存在4℃，6h之內(nèi)送檢。

1.4 主要試劑

蛋白質Maker購自華美公司。7h9、7H11和ADC增菌培養(yǎng)液購自Difco公司。

1.5 重組大腸桿菌來源的HBHA的制備

將重組質粒pETHBHA轉化的E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細菌接種于LB培養(yǎng)液中(含卡那霉素50μg/mL)，37℃培養(yǎng)16h。按照1∶20的比例放大培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)2h(振蕩速度200r/min)后，加入IPTG 至終濃度為1mmol/L，37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4h，以誘導目的蛋白表達。

1.6 重組恥垢分枝桿菌來源的HBHA的制備

將重組質粒pMVHBHA轉化的M.smegmatis細菌，接種含卡那霉素的7H11瓊脂平板，并培養(yǎng)5d。挑取單克隆，接種于含卡那霉素的7H9液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)5d。離心收集細菌，PBS洗滌兩次。超聲破碎細菌。

1.7 ELISA法檢測HBHA抗原刺激產(chǎn)生的IFN-γ含量

將每例標本的外周血5ml，加入24孔板中，0.5ml/孔。分別加入HBHA抗原（5～20μg/ml）混勻。放置37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)20～24h。然后，收集每孔上清，-20℃保存。ELISA法檢測上清的IFN-γ的含量。

2.結果

ELISA法檢測結果表明，BJTB組患者的外周血經(jīng)過規(guī)模化純化的HBHA刺激后，分泌的IFN-γ的含量，明顯高于其他兩組。差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3.討論

近年來，雖然經(jīng)濟發(fā)展快速、居住環(huán)境改善、結核檢測和治療方法不斷進步，但結核的發(fā)病率卻居高不下，肺外結核的發(fā)病率也隨之升高。骨與關節(jié)結核作為肺外結核的重要組成部分，因其進展緩慢、臨床表現(xiàn)無特異性，且常導致患者的骨關節(jié)被實質性破壞、預后差，給臨床診斷和治療帶來極大的挑戰(zhàn)，如何早期診斷骨結核則成為了臨床棘手的問題。

4.結論

以HBHA-IGRA為基礎的技術，可用于快速輔助診斷BJTB，在臨床上具有重要的指導意義。