楊 敏綜述，冀林華審校

(1.青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心，西寧 810001；2.青海省高原醫(yī)學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810001；3.青海大學(xué)附屬醫(yī)院血液科，西寧 810001)

DNA甲基化、組蛋白的化學(xué)修飾及染色質(zhì)重構(gòu)是表觀(guān)遺傳學(xué)最主要的三種機(jī)制。迄今為止研究最深最廣的表觀(guān)遺傳學(xué)機(jī)制為DNA甲基化，即胞嘧啶上的C5原子在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)的催化作用下添加一個(gè)甲基基團(tuán)，生成5-甲基胞嘧啶，它通常發(fā)生在位于基因啟動(dòng)子區(qū)中胞嘧啶與鳥(niǎo)嘌呤高度聚集所形成的CpG序列，也稱(chēng)CpG島。通常來(lái)講，DNA高甲基化可通過(guò)改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)來(lái)抑制基因的表達(dá)，相反，低甲基化則在一定程度上促進(jìn)基因的表達(dá)[1]。

低氧可以影響人體的功能及能量代謝過(guò)程，并使之發(fā)生一系列生理甚至病理變化。但高原世居者通過(guò)漫長(zhǎng)的自然選擇過(guò)程，機(jī)體已經(jīng)發(fā)生了一系列特異的適應(yīng)于高原低氧環(huán)境的生理改變，具備相應(yīng)的遺傳學(xué)特性。目前已明確地證實(shí)了世界四大高原世居者具有明顯區(qū)別于平原人的獨(dú)特生理適應(yīng)能力。同時(shí)，也有部分高原世居者或移居高原者在長(zhǎng)期暴露于高原低氧環(huán)境后機(jī)體出現(xiàn)了一系列病理改變，也稱(chēng)為“高原適應(yīng)不全”。過(guò)去的十余年，對(duì)于高原低氧的適應(yīng)及適應(yīng)不全的研究重點(diǎn)主要集中于以DNA序列改變?yōu)榛A(chǔ)的基因多態(tài)性等遺傳學(xué)機(jī)制上[2]。目前發(fā)現(xiàn)表觀(guān)遺傳學(xué)參與人類(lèi)對(duì)高原低氧適應(yīng)及適應(yīng)不全的過(guò)程，它是銜接環(huán)境與基因組改變的核心。本文將對(duì)DNA甲基化與高原低氧的生理適應(yīng)及適應(yīng)不全的相關(guān)實(shí)驗(yàn)證據(jù)及機(jī)制分別進(jìn)行綜述。

1 DNA甲基化與高海拔慢性低氧適應(yīng)

喜馬拉雅山的藏族是全球高原居住歷史最長(zhǎng)的民族，其在青藏高原居住了大約3～5萬(wàn)年[3]。顯然這些高原世居者已經(jīng)具有了遺傳學(xué)適應(yīng)能力，人們對(duì)高原低氧適應(yīng)的遺傳學(xué)機(jī)理從深度及廣度方面做了進(jìn)一步研究并取得了大量的成果，提出這種獨(dú)特的耐缺氧生理特征與正選擇的遺傳機(jī)制相關(guān)[4，5]。然而，高原世居人群最終體現(xiàn)出的適應(yīng)表型并非僅僅由遺傳變異單獨(dú)決定，而環(huán)境與基因組可能共同決定著生物體最終的表現(xiàn)型[6]。表觀(guān)遺傳學(xué)可能代表了一種整合遺傳和環(huán)境刺激并將其轉(zhuǎn)化為表型結(jié)果的機(jī)制，它對(duì)協(xié)調(diào)機(jī)體適應(yīng)環(huán)境的相關(guān)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)至關(guān)重要。DNA甲基化可能通過(guò)改變?nèi)毖鯒l件下基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程從而參與形成人類(lèi)高海拔適應(yīng)模式。

當(dāng)機(jī)體暴露于高原慢性缺氧環(huán)境，則啟動(dòng)各種代償反應(yīng)，如增加紅細(xì)胞的數(shù)量以提高血液含氧量，增加新血管生成以加強(qiáng)含氧血液向組織的輸送，改變細(xì)胞代謝的方式以減少氧氣消耗，最終維持氧穩(wěn)態(tài)[7]。低氧誘導(dǎo)因子(HIFs)是依賴(lài)于氧含量的轉(zhuǎn)錄激活因子，在低氧反應(yīng)中參與調(diào)控氧穩(wěn)態(tài)的基因轉(zhuǎn)錄。有研究者對(duì)高原藏豬和平原約克夏豬的心臟組織進(jìn)行全基因組DNA甲基化測(cè)序，發(fā)現(xiàn)甲基化差異基因主要集中在HIF信號(hào)通路和參與腫瘤發(fā)生過(guò)程的通路中[8]。Xiong等[9]對(duì)藏牦牛和平原牛的HIF-1α和HIF-2α基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)藏牦牛腎臟組織中HIF-1α和HIF-2α啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度明顯低于平原牛，且HIF-1α、HIF-2α mRNA的表達(dá)均高于平原牛，提出藏牦牛該位點(diǎn)的低甲基化狀態(tài)可能是其對(duì)高海拔低氧環(huán)境的適應(yīng)調(diào)控機(jī)制之一。

HIF可與低氧反應(yīng)元件(HRE)上的位點(diǎn)結(jié)合，誘導(dǎo)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)[10]。這些靶基因的表達(dá)能夠促進(jìn)紅細(xì)胞、毛細(xì)血管的生成，加速糖酵解。最新研究表明表觀(guān)遺傳學(xué)與HIF協(xié)同參與低氧轉(zhuǎn)錄反應(yīng)[11]。研究發(fā)現(xiàn)大量的CpG二核苷酸存在于HRE序列中與HIF-1結(jié)合位點(diǎn)處，若該位點(diǎn)發(fā)生甲基化改變，則會(huì)抑制DNA與各類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，這表明HIF與核心HRE的結(jié)合位點(diǎn)可被5-甲基胞嘧啶阻斷，同時(shí)也提示HIF-1依賴(lài)的HRE相關(guān)的基因調(diào)控對(duì)甲基化反應(yīng)具有敏感性[12]。促紅細(xì)胞生成素(EPO)基因被普遍認(rèn)為是HIF介導(dǎo)的低氧轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中最具代表性的下游靶基因之一，EPO刺激紅細(xì)胞生成的機(jī)制一方面為促進(jìn)紅系祖細(xì)胞增殖及分化，另一方面為抑制其凋亡[13]。適量紅細(xì)胞生成可有效增加外周血含氧量，有利人類(lèi)對(duì)于低氧的適應(yīng)。EPO基因啟動(dòng)子區(qū)密集地分布著CpG二核苷酸，這些位點(diǎn)一旦發(fā)生甲基化，既能阻礙HIF與該位點(diǎn)的結(jié)合過(guò)程，又激活報(bào)告基因，而且發(fā)現(xiàn)EPO表達(dá)水平與該基因啟動(dòng)子區(qū)CpG甲基化程度呈負(fù)相關(guān)[14]。

HIF-2由EPAS1基因編碼而成，它也是調(diào)控低氧轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的重要因子。Lachance等[15]研究發(fā)現(xiàn)EPAS1基因啟動(dòng)子區(qū)富含的CpG二核苷酸，可被DNMT3a催化誘導(dǎo)而發(fā)生甲基化，導(dǎo)致HIF-2 mRNA及下游靶分子表達(dá)減少。Childebayeva等[16]為了驗(yàn)證表觀(guān)遺傳學(xué)是否參與安第斯高原世居人群對(duì)高原低氧的適應(yīng)，對(duì)來(lái)自高海拔(4388米)和低海拔(0米)的572例克丘亞人的EPAS1基因啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行了甲基化分析，發(fā)現(xiàn)居住于海拔4 388米人群的EPAS1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平明顯低于平原人，且移居高原者在高原的居住年限與EPAS1甲基化水平呈負(fù)相關(guān)，并指出無(wú)論短期或終身暴露于高海拔缺氧環(huán)境中都會(huì)對(duì)安第斯人的EPAS1甲基化產(chǎn)生影響，最后提出表觀(guān)遺傳修飾可能在高海拔適應(yīng)的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

COX1是合成各類(lèi)前列腺素的主要催化酶之一，慢性低氧情況下，COX1表達(dá)量將逐漸下降[17]。Zhen等[18]指出COX1基因與EPAS1、EGLN1等基因在對(duì)高海拔低氧適應(yīng)性上具有趨同性。張嶧橋[19]對(duì)高原和平原同種族人外周血基因組進(jìn)行高原適應(yīng)相關(guān)性甲基化片段的篩選，發(fā)現(xiàn)編碼COX1和NADH脫氫酶的基因序列為兩組的差異甲基化片段，適應(yīng)于長(zhǎng)期低氧的高原人群線(xiàn)粒體COX1位點(diǎn)存在甲基化并抑制基因的表達(dá)，因此由COX1介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)程度降低，這種降低可能與高原低氧適應(yīng)有關(guān)。NADH脫氫酶通常存在于線(xiàn)粒體內(nèi)膜上，它在細(xì)胞氧化磷酸化反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，該基因位點(diǎn)在高原人與平原人中存在甲基化差異，提示這種提高氧利用率以代償?shù)脱醯纳碜饔每赡苁歉咴藢?duì)慢性低氧的適應(yīng)性機(jī)制。

這些在慢性低氧環(huán)境中的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，是維持機(jī)體組織代謝和功能的必要條件，而這些轉(zhuǎn)錄反應(yīng)大多受到DNA甲基化的調(diào)控[11，12]。因此，DNA甲基化改變可能在高原低氧適應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。此外，具有遺傳性是DNA甲基化作為高原低氧適應(yīng)機(jī)制的基本條件，現(xiàn)已明確地驗(yàn)證了由環(huán)境改變而誘導(dǎo)的DNA甲基化可以通過(guò)生殖細(xì)胞及體細(xì)胞等不同途徑遺傳給子代[20，21]。綜上所述，DNA甲基化通過(guò)影響低氧條件下基因轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參與人類(lèi)對(duì)高原慢性低氧的適應(yīng)過(guò)程。

2 DNA甲基化與高海拔慢性低氧適應(yīng)不全

在長(zhǎng)期低氧環(huán)境中，高原世居者或移居高原者的機(jī)體通過(guò)各種調(diào)節(jié)機(jī)制以代償機(jī)體缺氧，然而仍有一部分人難以適應(yīng)高原低氧環(huán)境，因而出現(xiàn)一系列代謝紊亂、功能失調(diào)甚至病理結(jié)構(gòu)的改變，統(tǒng)稱(chēng)“高原適應(yīng)不全”(maladaptation to high altitude)。高原適應(yīng)不全在不同的人中表現(xiàn)各異，如紅細(xì)胞過(guò)度增生、肺水腫、心功能異常等。但這些疾病的發(fā)病機(jī)理尚未完全闡明。而表觀(guān)遺傳學(xué)，尤其是DNA甲基化可能為揭示急、慢性高原病的發(fā)病機(jī)理研究提供新的方向。

目前認(rèn)為慢性高原病(chronic mountain sickness，CMS)的發(fā)生與人體對(duì)高原低氧逐漸失代償有關(guān)。隨著缺氧時(shí)間的推移，機(jī)體會(huì)繼發(fā)紅細(xì)胞過(guò)度增殖及肺小血管痙攣及重構(gòu)，嚴(yán)重者可出現(xiàn)全身臟器功能的紊亂。其中紅細(xì)胞增多癥發(fā)病率最高且危害極大[22]。在低氧條件下，紅細(xì)胞適量增多可增加外周血含氧量，然而，過(guò)量的紅細(xì)胞生成則會(huì)導(dǎo)致血液粘稠，致毛細(xì)血管血流阻力增大，加重組織缺氧，最終可導(dǎo)致心肌重構(gòu)及心功能受損等。隨著研究者對(duì)高原紅細(xì)胞增多癥機(jī)制的深入探討，發(fā)現(xiàn)DNA甲基化可能參與該病的發(fā)病過(guò)程及病情進(jìn)展。

有研究者以安第斯高原發(fā)病的男性青年紅細(xì)胞增多癥患者為研究對(duì)象，對(duì)其外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行全基因組甲基化測(cè)序，發(fā)現(xiàn)這些患者的EGLN1基因處于超甲基化狀態(tài)[6]。PHD2由EGLN1基因編碼而成，它是調(diào)節(jié)HIF穩(wěn)定性的一種重要酶類(lèi)。在常氧下，依賴(lài)于氧含量變化的負(fù)性調(diào)節(jié)因子PHD可加速催化HIF-1α亞基脯氨酸的羥基化過(guò)程，羥基化的HIF-1α可被腫瘤抑癌蛋白(pVHL)特異地識(shí)別并與之迅速結(jié)合，最終促進(jìn)HIF-1α的降解[23]。與此相反，低氧時(shí)HIF-1α并不能被PHD羥基化，使α亞基逃避了pVHL的識(shí)別。HIF-1α大量累積會(huì)促使HIF-1復(fù)合物與HRE及相關(guān)輔助因子的結(jié)合，最終調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)低氧的適應(yīng)[24]。所以當(dāng)EGLN1基因發(fā)生甲基化時(shí)，PHD2表達(dá)水平減低，HIF穩(wěn)定性增高，最終導(dǎo)致HIF介導(dǎo)的低氧轉(zhuǎn)錄反應(yīng)增加、過(guò)量的紅細(xì)胞生成，高原紅細(xì)胞增多癥由此發(fā)生。Minamishima Y等[25]將大鼠EGLN1基因失活，發(fā)現(xiàn)大鼠紅細(xì)胞數(shù)量明顯增加。Percy M 等[26]發(fā)現(xiàn)家族聚集性發(fā)病的紅細(xì)胞增多癥患者的EGLN1基因發(fā)生了突變，證明了由此導(dǎo)致的PHD2酶活性顯著降低與該病的發(fā)生有關(guān)。這兩項(xiàng)研究從側(cè)面反映了EGLN1基因表達(dá)異常與紅細(xì)胞增多癥的關(guān)系。

pVHL蛋白表達(dá)水平異常也可能參與紅細(xì)胞增多癥的發(fā)病。丘氏紅細(xì)胞增多癥是常染色體遺傳病，其發(fā)病機(jī)制為 VHL基因中的C、T錯(cuò)義突變，導(dǎo)致pVHL蛋白表達(dá)下降、抑制HIF-1α降解并使其在細(xì)胞中累積，加速EPO等靶基因表達(dá)，導(dǎo)致紅細(xì)胞過(guò)度增殖。馬曉燕等[27]對(duì)高原地區(qū)紅細(xì)胞增多癥患者外周血基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)VHL基因的拷貝數(shù)減少，且與該疾病的發(fā)生、發(fā)展顯著相關(guān)。鑒于此，筆者猜測(cè)慢性低氧環(huán)境導(dǎo)致的紅細(xì)胞增多癥的發(fā)病與VHL基因的甲基化有關(guān)。

高原肺水腫(HAPE)是一種嚴(yán)重的高原地區(qū)特發(fā)疾病，主要是低氧引起肺小動(dòng)脈痙攣及毛細(xì)血管壁通透性增高，最終導(dǎo)致肺間質(zhì)等組織發(fā)生水腫。apelin是一種與高海拔生理相關(guān)的氧穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)因子，它在血管內(nèi)皮生理反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用[28]。將apelin基因敲除的小鼠置于長(zhǎng)期低氧環(huán)境中，發(fā)現(xiàn)一氧化氮表達(dá)水平下降，最終導(dǎo)致血管收縮[29]。有研究者[30]對(duì)HAPE患者和同海拔健康人群進(jìn)行了一項(xiàng)全基因組差異甲基化片段測(cè)序的研究，發(fā)現(xiàn)HAPE患者組中apelin基因CpG島的甲基化率為11.92%，顯著高于同海拔健康人群，同時(shí)apelin表達(dá)下調(diào)，提示apelin基因的甲基水平與HAPE發(fā)病相關(guān)。這些結(jié)果表明DNA甲基化可能是高原低氧適應(yīng)不全相關(guān)疾病的重要發(fā)病機(jī)制。

3 總結(jié)及展望

人類(lèi)對(duì)高原慢性低氧的適應(yīng)及適應(yīng)不全是多種機(jī)制互相作用的結(jié)果，而表觀(guān)遺傳學(xué)被認(rèn)為是連接環(huán)境因素及基因組學(xué)的中心樞紐[6]。本綜述認(rèn)為DNA甲基化是人類(lèi)對(duì)慢性高原低氧的適應(yīng)及適應(yīng)不全的重要分子機(jī)制之一。目前DNA甲基化在高原慢性低氧條件下的相關(guān)研究較少，研究起來(lái)也存在諸多困難。首先，DNA甲基化具有組織及細(xì)胞特異性，通常獲得目的組織或器官的純化細(xì)胞較困難，而且，所選擇的組織或細(xì)胞并不能完全地反映靶器官的表觀(guān)遺傳學(xué)變化。此外，生活在高海拔地區(qū)的人們除了經(jīng)歷慢性低氧外，還會(huì)受到強(qiáng)紫外線(xiàn)輻射和傳染性病原體及污染物的影響，而表觀(guān)遺傳學(xué)對(duì)環(huán)境因素的改變具有敏感性，因此這也增加了描述高海拔人群DNA甲基化變化與低氧關(guān)系的困難程度。盡管高原低氧條件下表觀(guān)遺傳學(xué)的研究存在諸多困難，但是表觀(guān)遺傳學(xué)作為基因組及環(huán)境之間的一個(gè)重要銜接點(diǎn)，可以靈活地將基因組的遺傳信息轉(zhuǎn)化為對(duì)特定環(huán)境條件下的生理反應(yīng)。因此，在慢性高原低氧環(huán)境下，對(duì)DNA甲基化等表觀(guān)遺傳學(xué)進(jìn)行深入研究，有助于明確低氧及基因組學(xué)之間互相作用的關(guān)系，也加深了人類(lèi)對(duì)慢性低氧環(huán)境適應(yīng)機(jī)制的理解。