余 貞，孫 靜，王 妍，孫 輝

近幾十年，非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)的患病率在全世界范圍內(nèi)快速增長，尤其是在亞太地區(qū)，已接近西方水平，因此，NAFLD逐漸成為研究的熱點(diǎn)。近年來，關(guān)于非編碼RNA與NAFLD的研究越來越多，絕大多數(shù)研究集中于微小RNA(microRNA，miRNA)和長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)對于NAFLD的發(fā)生發(fā)展的影響。隨著對環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)circRNA參與了許多人類疾病，包括腫瘤，神經(jīng)系統(tǒng)疾病，糖尿病，動脈粥樣硬化，朊病毒病，而circRNA與NAFLD的研究報道較少，作者對circRNA與NAFLD關(guān)系研究進(jìn)展作一綜述。

1 NAFLD

NAFLD定義為無繼發(fā)性原因，如使用致脂藥物或飲酒過量(男性>30 g/d，女性>20 g/d)等，而影響肝細(xì)胞>5%的脂肪變性。目前，NAFLD在美國的患病率為10%～40%，在亞太地區(qū)的患病率為7%～40%，已成為導(dǎo)致慢性肝臟疾病的主要原因，有逐漸超過酒精性肝病和病毒性肝炎發(fā)病率的趨勢[1]。NAFLD是由肝臟脂肪特異性堆積進(jìn)而引起肝臟脂肪變性的一種臨床綜合征，與高血壓、糖尿病、胰島素抵抗(insulin resistance，IR)、脂代謝異常和肥胖等因素密切相關(guān)。因此，NAFLD的治療也是在糾正糖尿病、肥胖、代謝綜合征等病因的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，而目前所研究的各種藥理學(xué)方法都不太有效，了解NAFLD的發(fā)病機(jī)制對其臨床研究及治療的進(jìn)展變得尤為重要。已有研究表明，miRNA、lncRNA在NAFLD的發(fā)病機(jī)制、篩查、診斷和分期中都起著至關(guān)重要的作用。Nie等[2]通過微陣列發(fā)現(xiàn)在NAFLD小鼠肝臟組織中有10個miRNA差異性表達(dá)(5個上升，5個下降)，通過基因本體論數(shù)據(jù)庫分析和京都基因和基因組百科全書數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的miRNA主要參與“胃酸分泌”、“心臟腎上腺素能信號通路”、“癌癥”、“MAPK信號通路”、“緊密連接”、“恰加斯氏病”、“細(xì)胞粘附分子”、“鞘脂質(zhì)信號通路”、“神經(jīng)營養(yǎng)蛋白信號通路”、“丙肝”，說明miRNA參與多種過程，包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、應(yīng)激反應(yīng)、增殖、分化和癌癥。孫傳政等[3]采用lncRNA-mRNA基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)，與正常樣本相比，NAFLD肝樣本內(nèi)共有1 735個lncRNAs和1 485個mRNAs異常表達(dá)，其中535個lncRNAs和760個mRNAs上調(diào)，1 200個lncRNAs和725個mRNAs下調(diào)，這些差異表達(dá)的lncRNA可能參與了NAFLD的發(fā)生過程。

2 CircRNA

CircRNA是一類主要由一個以上外顯子構(gòu)成的環(huán)形RNA分子，大量存在于真核細(xì)胞，具有一定的組織、時序和疾病特異性。近年來，隨著生物信息學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，circRNA這一古老且具有保守特征分子的神秘面紗逐漸被揭開[4]。Jeck等[5]在人類成纖維細(xì)胞中檢測到了高達(dá)25 000多種circRNA。Salzman等[6]發(fā)現(xiàn)了數(shù)以百計(jì)的與人類基因表達(dá)相關(guān)聯(lián)的circRNA。Memczak等[7]則從RNA測序數(shù)據(jù)中鑒定出1 950種人類circRNA、1 903種小鼠circRNA和724種線蟲circRNA。Guo等[8]發(fā)現(xiàn)了人類細(xì)胞系相關(guān)的39種生物樣本中的7 112種circRNA。目前發(fā)現(xiàn)的circRNA根據(jù)其在基因組中的來源及其構(gòu)成序列的不同，可以分為3類：外顯子來源的環(huán)形RNA分子(exonic circRNA)，內(nèi)含子來源的環(huán)形RNA分子(intronis circRNA)和由外顯子和內(nèi)含子共同組成的環(huán)形RNA分子(exon-intron circRNA)。與線性環(huán)狀RNA相比，circRNA具有更穩(wěn)定的分子結(jié)構(gòu)，其中一些外顯子的3′端反向連接其他上游外顯子的5′端形成封閉分子，由于缺乏游離末端，這些分子能夠抵抗核糖核酸外切酶[9]。CircRNA分子功能包括miRNA海綿、調(diào)控轉(zhuǎn)錄基因、作為翻譯模板等，在基因調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，circRNA參與了多種疾病包括多種肝臟疾病。在異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥大小鼠中強(qiáng)制表達(dá)心臟相關(guān)circRNA可緩解心肌肥大；circRNA Cdrlas會影響胰島素分泌和胰島B細(xì)胞的更新；has-circ-001988在癌組織中減少，與腫瘤細(xì)胞分化的程度及預(yù)后相關(guān)[10]；另外，circRNA還被發(fā)現(xiàn)參與了非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)、肝再生、肝細(xì)胞肝癌等肝臟疾病，而circRNA參與NAFLD卻鮮有報導(dǎo)。

3 CircRNA參與NAFLD的發(fā)生過程

NAFLD的發(fā)病機(jī)制還尚不明確，目前受青睞的“二次打擊理論”較好地闡述了其發(fā)病過程。代謝的失衡和非酯化脂肪酸流入肝臟增加，是導(dǎo)致NAFLD的主要原因。三酰甘油的積累誘發(fā)第二階段的發(fā)生，包括氧化應(yīng)激、前炎性因子的釋放和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)而引發(fā)肝臟的炎性反應(yīng)，導(dǎo)致內(nèi)皮一氧化氮功能紊亂，誘發(fā)IR，而IR和高胰島素血癥又是NAFLD的始動因素[10]。無可置疑，其發(fā)生過程中必然有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變，而circRNA作為內(nèi)源競爭RNA和miRNA海綿等參與其中。Li等[11]研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD組織中CircScd1表達(dá)明顯低于對照組，此外，過表達(dá)CircScd1可顯著抑制脂滴的形成，通過Western Blot分析最后總結(jié)出了CircScd1的異常表達(dá)影響NAFLD肝細(xì)胞脂質(zhì)增多的程度，并通過JAK2/STAT5通路促進(jìn)脂肪肝的發(fā)生，結(jié)果顯示CircScd1參與了NAFLD的發(fā)生過程。

3.1 CircRNA與IR IR是導(dǎo)致NAFLD發(fā)生及發(fā)展的根本原因。外周IR導(dǎo)致高胰島素血癥和脂質(zhì)分解增多，產(chǎn)生和提供更多的游離脂肪酸(free fat acid，F(xiàn)FA)到肝細(xì)胞，以重新脂化和進(jìn)行β氧化，促使FFA及甘油三酯在肝細(xì)胞的蓄積，并可能誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化，另外FFA本身可以進(jìn)一步阻礙胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，因此加重IR。而我們已知，CDRlas(CiRS-7)在糖尿病的診療過程中具有重要作用。胰島B細(xì)胞受損，胰島素分泌絕對或相對不足(IR)，會使血糖升高，從而引發(fā)糖尿病[12]。Wang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，miR-7能夠負(fù)調(diào)節(jié)胰島B細(xì)胞增殖，其在胰島B細(xì)胞中的過表達(dá)會損傷胰島B細(xì)胞的去分化功能，并導(dǎo)致胰島素分泌的下調(diào)，從而引起糖尿病。另外，miR-7通過雷帕霉素靶蛋白信號通路抑制胰島B細(xì)胞增殖，而CDRlas(CiRS-7)能夠抑制miR-7功能，從而刺激胰島B細(xì)胞擴(kuò)增。因此，CDRlas(CiRS-7)可能影響胰島B細(xì)胞的更新，同時也是糖尿病的潛在作用靶點(diǎn)。

3.2 CircRNA與肝臟脂肪變性 Guo等[14]通過微陣列分析評估，將正常組與肝脂肪變性組進(jìn)行比較得到肝臟脂肪變性與357個circRNA有關(guān)，包括154個上調(diào)和203個下調(diào)的circRNA。Guo等[15]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，高脂誘導(dǎo)下circRNA-021412的表達(dá)減少，從而對miR-1972的競爭性抑制作用減弱，重新激活的miR-1972誘導(dǎo)LPIN1表達(dá)減少，最后破壞脂肪生成和催化分離的平衡導(dǎo)致肝臟脂肪變性。LPIN1已被證實(shí)在肝細(xì)胞中分別作為磷脂酸磷酸酶和轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮雙重作用。首先，它通過催化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中甘油三酯生成的倒數(shù)第二步來抑制脂肪生成，其次，LPIN1與轉(zhuǎn)錄因子(PPAR-α，PGC-1α)的直接作用，在脂質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)中放大了肝臟PGC-1α/PPAR信號。與此相關(guān)，miR-34a對PPAR的抑制作用表明其是肝細(xì)胞脂肪生成的重要誘導(dǎo)因子。Guo等[16]又發(fā)現(xiàn)circRNA-0046367作為miR-34a海綿和內(nèi)源競爭RNA作用于PPAR，circRNA-0046366則被認(rèn)為是miR-34a的5種miRNA的拮抗劑。當(dāng)circRNA-0046367或circRNA-0046366缺失時，miR-34a激活，發(fā)生PPAR抑制，最后導(dǎo)致肝臟脂肪變性和脂質(zhì)過氧化。

4 CircRNA參與NAFLD的進(jìn)展

NAFLD進(jìn)展較為緩慢，一般情況下，NAFLD無臨床癥狀，多是在健康體檢或檢查其他疾病時發(fā)現(xiàn)肝功能異?；蛑靖?。但隨著病情進(jìn)展，會出現(xiàn)單純性脂肪肝(肝脂肪堆積)、NASH、肝纖維化、肝硬化和肝細(xì)胞癌等一系列疾病[17-19]。

4.1 CircRNA與NASH NASH是NAFLD的重要分期。Jin等[20]使用基因芯片檢測NASH小鼠circRNA和mRNA表達(dá)譜的變化，發(fā)現(xiàn)了69個上調(diào)和63個下調(diào)的circRNA以及2 760個上調(diào)和2 465個下調(diào)的mRNA，并預(yù)測了4條經(jīng)qRT-PCR驗(yàn)證的circRNA-miRNA-mRNA通路。因此，circRNA與NASH的發(fā)生和發(fā)展存在一定關(guān)聯(lián)。周玉平等[21]采用高通量circRNA芯片技術(shù)比較正常組與肝纖維化小鼠組的circRNA表達(dá)譜變化，顯示共有69個circRNA差異表達(dá)(表達(dá)差異兩倍以上，P<0.05)，qRT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)其中4個差異表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示circRNA可能與肝纖維化進(jìn)展有關(guān)。

4.2 CircRNA與肝再生 對于大多數(shù)NAFLD患者而言，NAFLD除了會發(fā)展成肝硬化、肝細(xì)胞癌，另一個重要的威脅就是肝再生能力受損。臨床及實(shí)驗(yàn)研究都發(fā)現(xiàn)脂肪變性肝臟在損傷、手術(shù)、移植后再生功能受損、再生時間延長，甚至可能誘發(fā)肝功能衰竭及機(jī)體死亡[22]。Li等[23]通過RNA測序技術(shù)和生物信息學(xué)分析獲取了在大鼠70%肝切除術(shù)后肝再生初始階段中差異表達(dá)的circRNA及其親本基因，并構(gòu)建了circRNA-miRNA網(wǎng)絡(luò)，其中包括了159個差異表達(dá)的circRNA及116個相應(yīng)的親本基因。通過集中驗(yàn)證，確定了6個具有關(guān)鍵調(diào)控作用的circRNA。以上研究提示，circRNA在肝再生的機(jī)制中扮演著重要角色。

4.3 CircRNA與肝細(xì)胞癌 目前，臨床上缺乏除了甲胎蛋白以外的更加有效的肝細(xì)胞癌診斷和預(yù)后標(biāo)志物。與線狀RNA不同，circRNA通過特定的剪接方式形成共價閉合連續(xù)環(huán)路結(jié)構(gòu)，高度保守且性質(zhì)穩(wěn)定，在人體某些組織的表達(dá)水平超過其線性異構(gòu)體的10倍[6]。Shang等[24]檢測了肝癌變組織中3個circRNA(hsa-circ-0000520、has-circ-0005075、has-circ-0066444)的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)has-circ-0005075是一個潛在的肝癌標(biāo)志物。Li等[25]在研究中首次發(fā)現(xiàn)大量肝細(xì)胞癌來源的exonic-circRNA，經(jīng)RNA檢測后，篩選出超過1 000種exonic circRNA,揭示了circRNA在肝細(xì)胞癌檢測與診斷方面的應(yīng)用前景。周英利等[26]在研究中發(fā)現(xiàn)，circRNA有可能通過與Lin28B相互結(jié)合從而抑制Lin28B蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制Lin28B作為癌基因的功能，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

5 小結(jié)

目前，對circRNA的研究還只是剛剛起步的階段，尤其是對circRNA參與NAFLD作用機(jī)制的研究少之又少。相信隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，未來會有大量與NAFLD相關(guān)的circRNA及其功能被發(fā)現(xiàn)證實(shí)，并應(yīng)用于NAFLD的發(fā)病機(jī)制與臨床治療之中。