郭愛(ài)葉，李 泮，高 嵐

(河南省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 鄭州 450003)

人體每天都會(huì)有大量的DNA損傷，導(dǎo)致DNA損傷的原因主要是細(xì)胞內(nèi)DNA受到如紫外線、活性氧、化學(xué)試劑和電離輻射等外界因素或機(jī)體內(nèi)源性DNA復(fù)制時(shí)的應(yīng)激反應(yīng)的影響，導(dǎo)致DNA的化學(xué)結(jié)構(gòu)或編碼特性出現(xiàn)異常，進(jìn)而引起基因組改變[1-2]。這種損傷若不能及時(shí)修復(fù)，就會(huì)對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重的健康威脅，甚至?xí)?dǎo)致腫瘤的發(fā)生。常見(jiàn)的2種細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶(checkpoint kniase，Chk)是Chk1和Chk2，兩者在DNA損傷修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用，其缺失或過(guò)度表達(dá)都有可能引起一些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，影響腫瘤患者的預(yù)后。隨著Chk1和Chk2成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，Chk及其與腫瘤關(guān)系的研究也有了很大的進(jìn)展，本文就近年來(lái)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述如下。

1 Chk概述

1.1 Chk基本結(jié)構(gòu)和功能Chk主要包括Chk1和Chk2，均屬蛋白激酶，具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)和重合的底物譜[3]，但是在不同的腫瘤組織中這2種激酶卻有著不同的表達(dá)。

1.1.1 Chk1基本結(jié)構(gòu)和功能 Chk1最初在裂殖酵母菌中被發(fā)現(xiàn)，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的一員，相對(duì)分子質(zhì)量約54 000[4]。人類Chk1基因在染色體11q24上被發(fā)現(xiàn)，其cDNA長(zhǎng)度為1 891 bp左右，目前主要有7種轉(zhuǎn)錄變異體。Chk1蛋白由476個(gè)氨基酸組成，主要包括一個(gè)可催化底物磷酸化的N-末端激酶結(jié)構(gòu)域和一個(gè)可接受磷酸化調(diào)節(jié)的C-末端抑制性結(jié)構(gòu)域[5]。

Chk1是一種在進(jìn)化上具有高度保守性的蛋白激酶，主要在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用，在人和多種動(dòng)物的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中都能發(fā)現(xiàn)其存在。Zachos等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，正常表達(dá)的Chk1基本不會(huì)影響體細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，但是當(dāng)Chk1受到外界或內(nèi)部因素的影響發(fā)生基因突變或表達(dá)異常時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和DNA復(fù)制不完全，影響DNA的損傷修復(fù)，甚至可能由于Chk1表達(dá)異常，子代細(xì)胞攜帶不完全的基因并躲過(guò)了細(xì)胞自身的檢查，繼續(xù)增殖發(fā)育形成惡性增殖的細(xì)胞，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

Chk1能夠影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和胚胎發(fā)生，細(xì)胞內(nèi)紡錘體和染色體的裝配過(guò)程也與Chk1有關(guān)。此外，Chk1蛋白激酶還能直接影響細(xì)胞的凋亡和DNA的修復(fù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的熱休克反應(yīng)和細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊、人類免疫缺陷病毒感染等的應(yīng)激反應(yīng)[7-9]。

1.1.2 Chk2基本結(jié)構(gòu)和功能 Chk2是一種多功能蛋白激酶，屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量約60 000，人類Chk2基因在染色體22q12.1上被發(fā)現(xiàn)，cDNA全長(zhǎng)約2 061 bp，目前主要有8種轉(zhuǎn)錄變異體。Chk2蛋白由543個(gè)氨基酸組成，主要包括3個(gè)區(qū)域，分別為氨基酸對(duì)富含區(qū)、叉頭相關(guān)結(jié)構(gòu)域和近C末端的蛋白激酶結(jié)構(gòu)域。

Chk2在正常組織細(xì)胞中廣泛存在，在細(xì)胞周期的各個(gè)階段都發(fā)現(xiàn)了Chk2蛋白激酶，并且Chk2蛋白激酶具有顯著的組織特異性。與Chk1一樣，Chk2也能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，從而參與到DNA損傷修復(fù)過(guò)程中，維持染色體的穩(wěn)定。有研究[10]表明，在正常生長(zhǎng)期間，Chk2通常在細(xì)胞核內(nèi)以無(wú)活性單體的形式存在，在沒(méi)有DNA損傷時(shí)，Chk2可以將乳腺癌易感性基因1(BRCA1)磷酸化，這有利于保持染色體的穩(wěn)定性和有絲分裂紡錘體組裝的正確性。當(dāng)外界一些因素導(dǎo)致DNA損傷斷裂時(shí)，Chk2通過(guò)ATM依賴途徑中蘇氨酸68的磷酸化被激活[11-12]。

1.2 Chk與DNA的損傷反應(yīng)DNA損傷反應(yīng)是指當(dāng)DNA大面積損傷并且不容易修復(fù)時(shí)，損傷感應(yīng)器能觸發(fā)更為廣泛的反應(yīng)，使細(xì)胞免受高水平DNA的持續(xù)損害，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路被激活，傳遞損傷信號(hào)到各種效應(yīng)蛋白。當(dāng)細(xì)胞DNA損傷發(fā)生時(shí)細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)被激活，阻滯細(xì)胞周期并進(jìn)行DNA的修復(fù)以及修復(fù)后的細(xì)胞周期重啟，主要涉及到四種蛋白激酶：Chk1、Chk2、毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)突變蛋白(ataxia telangiectasia mutated,ATM)和ATM/Rad3相關(guān)蛋白(TAR)[13-14]。

1.2.1 Chk1與DNA損傷修復(fù) 在分子水平上，ATR-Chk1途徑能識(shí)別出包括離子輻射、DNA復(fù)制壓力、DNA單鏈的斷裂、病毒感染和DSB末端切除等多種DNA損傷[15]。在應(yīng)對(duì)離子輻射或復(fù)制壓力引起的DNA損傷時(shí)，最主要的通路是TAR-Chk1-細(xì)胞分裂周期因子25(cell division cycle protein 25，Cdc25)通路，在此通路中，ATM和ATR作為DNA損傷應(yīng)答反應(yīng)中的重要感受器，能把DNA受損信號(hào)通過(guò)中介因子準(zhǔn)確快速傳遞至Chk1，Chk1被激活后將DNA復(fù)制起始因子Cdc25磷酸化，使Cdc25加速泛素化降解，最終引起細(xì)胞周期停滯，為DNA損傷修復(fù)提供時(shí)間。Lu等[16]發(fā)現(xiàn)ATM也可以通過(guò)磷酸化Chk1的Ser317位點(diǎn)激活整個(gè)通路發(fā)揮DNA損傷修復(fù)作用。不僅如此，在雙鏈DNA斷裂反應(yīng)中，Chk1激酶通過(guò)磷酸化TLK的Ser695位點(diǎn)參與到DNA的復(fù)制和損傷修復(fù)過(guò)程中[17]。

1.2.2 Chk2與DNA損傷修復(fù) Chk2通過(guò)負(fù)調(diào)控機(jī)制在細(xì)胞周期的調(diào)控中發(fā)揮作用，當(dāng)DNA受損尤其是DNA雙鏈斷裂時(shí)，可通過(guò)ATM-Chk2-Cdc25信號(hào)通路激活相應(yīng)檢查點(diǎn)阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，進(jìn)行DNA損傷修復(fù)。在人類細(xì)胞中，Chk2通過(guò)特異性磷酸化BRCA1的Ser988位點(diǎn)使BRCA1從細(xì)胞核移動(dòng)到細(xì)胞質(zhì)中，即改變BRCA1的核定位，被活化的BRCA1再參與到同源重組DNA修復(fù)通路中，同時(shí)抑制非同源末端連接。當(dāng)DNA損傷由于某些原因無(wú)法被有效修復(fù)時(shí)，Chk2會(huì)通過(guò)P53依賴型和P53非依賴型2種途徑誘導(dǎo)含有受損DNA的細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡，從而清除這些細(xì)胞[18]。

2 Chk與腫瘤

2.1 Chk1與腫瘤Chk1是重要的細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)的調(diào)節(jié)蛋白之一，其穩(wěn)定表達(dá)有利于DNA損傷修復(fù)機(jī)制的正常進(jìn)行，有助于維持基因組的完整和穩(wěn)定[19]。當(dāng)Chk1基因失活或表達(dá)異常時(shí)，DNA損傷修復(fù)不能正常進(jìn)行，導(dǎo)致DNA損傷由于不斷進(jìn)行復(fù)制而增加積累，這就使某些本應(yīng)該生理性凋亡或正常生長(zhǎng)增殖的細(xì)胞不斷進(jìn)入細(xì)胞周期，最終形成惡性增殖的細(xì)胞，甚至導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[20]。有研究[9,21-24]發(fā)現(xiàn)，在正常細(xì)胞中Chk1蛋白激酶的表達(dá)較低，但是在人類肺癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌和結(jié)腸癌等腫瘤細(xì)胞中有較高的表達(dá)，這提示Chk1蛋白激酶的高表達(dá)可能與這些腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。衛(wèi)茹等[25]在對(duì)Chk1和Rad51蛋白在食管胃結(jié)合部腺癌組織中的表達(dá)及意義的研究中發(fā)現(xiàn)，Chk1蛋白的表達(dá)水平越高，患者的預(yù)后越差，2種蛋白具有協(xié)同促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用。

Chk1蛋白激酶能夠介導(dǎo)細(xì)胞DNA的損傷修復(fù)，對(duì)于正常的細(xì)胞來(lái)說(shuō)這的確降低了由DNA突變引起的細(xì)胞惡性增殖的風(fēng)險(xiǎn)，但對(duì)于腫瘤細(xì)胞來(lái)說(shuō)，Chk1蛋白激酶同樣也能修復(fù)由抗腫瘤藥物引起的DNA損傷，這令腫瘤細(xì)胞降低了對(duì)DNA損傷劑的敏感性，削弱了放、化療的療效。許多研究也間接證實(shí)了這一說(shuō)法。學(xué)者們發(fā)現(xiàn)Chk1表達(dá)缺失的腫瘤細(xì)胞通常會(huì)表現(xiàn)出對(duì)DNA損傷劑的敏感性增加、細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)的阻滯作用消失和細(xì)胞增殖緩慢等缺陷[26-27]，而Chk1高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞相較于Chk1低表達(dá)的腫瘤細(xì)胞在嚴(yán)酷的腫瘤微環(huán)境或DNA損傷的情況下有更強(qiáng)的適應(yīng)能力。目前也有證據(jù)表明，Chk1基因缺失可能與乳腺癌相關(guān)基因及細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為有關(guān)[28]。

2.2 Chk2與腫瘤目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為Chk2基因?qū)儆谝职┗颍祟惙伟?、卵巢癌等許多腫瘤細(xì)胞中Chk1蛋白水平有較高表達(dá)，與Chk1不同的是，Chk2激酶蛋白在許多腫瘤組織中表現(xiàn)為表達(dá)缺失，這影響了細(xì)胞周期的停滯或受損DNA的修復(fù)，可能導(dǎo)致無(wú)法阻滯突變的基因復(fù)制，并使腫瘤易感性提高，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的異?；虻姆e累可能會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。王一然等[29]在對(duì)Chk2基因突變與乳腺癌的關(guān)系研究中發(fā)現(xiàn)，Chk2基因是乳腺癌重要的易感基因之一。Jiang等[30]也在對(duì)乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)Chk2基因座丟失。殷子然[31]在對(duì)25例卵巢癌患者的研究中發(fā)現(xiàn)，Chk2蛋白的異常表達(dá)可能與卵巢癌的形成密切相關(guān)。這說(shuō)明Chk2的表達(dá)缺失與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。但是，在另一些研究中發(fā)現(xiàn)Chk2在某些原發(fā)性食管癌、胃癌、卵巢癌等惡性腫瘤中卻表現(xiàn)為高表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，這使得Chk2可能屬于抑癌基因的結(jié)論受到挑戰(zhàn)[32-33]。

3 Chk抑制劑與腫瘤治療

3.1 Chk1抑制劑與腫瘤治療Chk1蛋白激酶抑制劑根據(jù)其作用機(jī)制可分為ATP競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑和非ATP競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，如AZD7762是一種有效的ATP競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，在腫瘤細(xì)胞DNA損傷時(shí)，其可以阻滯細(xì)胞周期停滯和DNA修復(fù)，引起細(xì)胞凋亡。根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同可將Chk1蛋白激酶抑制劑分為7類：喹啉酮類、脲類、吡咯并咔唑酮類、苗并吡唑類、吲哚類、含硫化合物和一些其他類型[34]。Chk1蛋白激酶抑制劑在臨床上的應(yīng)用主要作為敏化劑，與一些放、化療藥物聯(lián)合使用，通過(guò)抑制Chk1蛋白激酶的功能來(lái)增加腫瘤細(xì)胞對(duì)放、化療藥物的敏感性，增強(qiáng)放、化療的療效。

Chk1蛋白激酶抑制劑還可以與其他一些藥物聯(lián)合使用通過(guò)產(chǎn)生“合成致死”效應(yīng)來(lái)殺死腫瘤細(xì)胞，不僅如此，目前已有許多Chk1抑制劑單藥抗腫瘤的研究報(bào)道[35]，其中LY2606368已進(jìn)入多種腫瘤治療Ⅱ期臨床試驗(yàn)階段，有待進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)。由于第1代Chk1蛋白激酶抑制劑給藥途徑具有爭(zhēng)議，而且細(xì)胞毒性較強(qiáng)，所以其在臨床上的試驗(yàn)被終止。

3.2 Chk2抑制劑與腫瘤治療與Chk1類似，Chk2蛋白激酶也能夠修復(fù)損傷的DNA，而Chk2蛋白激酶抑制劑則能夠抑制Chk2的表達(dá)，減弱Chk2對(duì)DNA損傷的腫瘤細(xì)胞的修復(fù)，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)DNA損傷劑的敏感性，因此，Chk2蛋白激酶抑制劑可以與放、化療藥物聯(lián)合使用以增加放、化療對(duì)腫瘤細(xì)胞的損傷，不僅如此，其還能保護(hù)正常細(xì)胞，減弱放、化療對(duì)正常細(xì)胞的損傷。有研究[36]發(fā)現(xiàn)，Chk2抑制劑使具有P53缺陷的腫瘤細(xì)胞對(duì)基因毒性劑生物敏感性更強(qiáng)，這是由于同時(shí)缺少Chk2和P53會(huì)使G1/S、G2/M檢查點(diǎn)失效。主要的Chk2抑制劑包括VRX0466617、AZD 7762、AB C3742、PV1019、NCS10955、CCT241533、XL9844等[37]。其中AZD7762、NSC109555、小分子抑制劑C3742等已經(jīng)進(jìn)入Ⅰ期臨床研究。值得一提的是，有學(xué)者指出，多數(shù)Chk2蛋白抑制劑不具有特異性，通常對(duì)Chk1蛋白激酶也有活性，這非但不能增加抗腫瘤藥物的效果，反而表現(xiàn)出對(duì)放、化療的抵抗作用[5]。

4 小結(jié)與展望

近年來(lái)，對(duì)Chk的研究取得了一定的進(jìn)展，許多研究都表明，Chk1和Chk2是最常見(jiàn)的Chk，在細(xì)胞周期檢測(cè)機(jī)制中也發(fā)揮著十分重要的作用，兩者的基因或蛋白表達(dá)的異?？赡軙?huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。90%已知腫瘤的組織中能夠同時(shí)檢測(cè)到Chk1和Chk2，但這2種蛋白激酶在不同腫瘤組織中表達(dá)情況并不完全相同，而且兩者是否與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)也尚無(wú)定論。由于Chk1抑制劑的特異性要優(yōu)于Chk2抑制劑，所以大量學(xué)者更傾向于對(duì)Chk1蛋白激酶抑制劑的研究。Chk1抑制劑和Chk2抑制劑都能夠起到提高腫瘤細(xì)胞對(duì)放、化療藥物的敏感性的作用，因此Chk與放、化療聯(lián)合應(yīng)用于腫瘤的治療已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。但Chk抑制劑應(yīng)用于臨床之前還要進(jìn)行大量的研究。