張利平

（浙江省柑橘研究所 臺州 318026）

柑橘屬蕓香科植物，是世界上第一大水果，我國南方最重要的果樹之一[1]。2017年全國柑橘種植面積2.53×106hm2，產(chǎn)量3816×104t，近年來柑橘黃龍病給柑橘產(chǎn)業(yè)帶來了嚴(yán)重打擊，柑橘感染黃龍病之后除了挖除燒毀幾乎沒有方法可以根除。黃龍病病原菌是一種韌皮部難養(yǎng)革蘭氏陰性桿狀菌，屬于變形細(xì)菌門(Proteobacteria)，α– 變形細(xì)菌亞綱(Alpha-Proteobacteria)，根瘤菌目(Rhizobiales)，根瘤菌科(Rhizobiaceae)。根據(jù)16SrDNA序列不同可將CandidatusLiberibacter分為亞洲種（Candidatus Liberibacter asiaticus，CLas）、非洲種（Ca.L.africanus，CLaf）和美洲種（Ca.L.americanus，CLam）3 個種，我國存在的是亞洲種。柑橘黃龍病菌由嫁接和木虱傳播，植物寄主除了柑橘屬及其蕓香科柑橘亞科近緣屬植物外，有報道指出枳、金柑、黃皮、九里香、澳指檬、木蘋果、酒餅簕等近緣屬植物上都有黃龍病菌檢出[2～5]。柑橘不抽稍期間木虱主要取食柑橘亞科中的九里香，九里香可以連續(xù)抽發(fā)新梢，因而木虱種群得以維持[6]，但九里香中的黃龍病細(xì)菌只可以維持2個月，3～5個月后的滴度就低到檢測不到[7,8]。本文綜述了柑橘在感染黃龍病之后外觀、微觀結(jié)構(gòu)、微生態(tài)環(huán)境、代謝及微生物菌群的變化。

1 外觀變化

1.1 葉片和組織表現(xiàn)

柑橘感染黃龍病之后不會馬上表現(xiàn)出癥狀，外觀和健康植株沒有差異。吳柳等[9]通過葉圓片嫁接傳毒方式研究發(fā)現(xiàn)，病原菌在嫁接的近端主脈中積累最快，其次是遠(yuǎn)端主脈、葉柄和緣周葉組織，在為期1～84d的嫁接葉片中菌量檢測中發(fā)現(xiàn)，Clas的早期運動可分為潛伏期（1～42d）、指數(shù)期（43～70d）和穩(wěn)定期（71～84d），植株表現(xiàn)癥狀是在葉片嫁接Clas180d后，表現(xiàn)出葉片斑駁黃化、葉脈爆突木質(zhì)化等癥狀；待病菌散播到全樹后，新梢抽生的葉片一般為均勻黃化。

病根表皮易脫離、腐爛[10]。甜橙感染黃龍病后根發(fā)生了明顯異常，幾乎找不到次生根，根中存貯的淀粉也被耗盡；而健康的植株有大量的次生根，且根中有大量淀粉存貯。苗期染病的幼樹表現(xiàn)為全株黃化，肥水條件差時最為明顯。

1.2 果實表現(xiàn)

柑橘黃龍病果實的典型癥狀是“紅鼻子果”，果實著色異常，黃綠不均，比正常果實小，畸形，因蠟質(zhì)形成受阻而無光澤，果臍常偏離一邊，果實中心柱不正，種子變扁、質(zhì)量減輕，多敗育且萌發(fā)率降低[11]。寬皮柑橘的果實常表現(xiàn)為果蒂和果肩周圍先褪綠轉(zhuǎn)色，其它部位仍然為青綠色，但染病甜橙樹的果實常表現(xiàn)為青果。

1.3 品種間表現(xiàn)差異

因柑橘品種不同，植株感染黃龍病后出現(xiàn)的癥狀嚴(yán)重程度也不同，有些品種對柑橘黃龍病極其敏感，如甜橙和葡萄柚，表現(xiàn)出嚴(yán)重的幼葉黃化和生長受阻現(xiàn)象并最終死亡。有些柑橘品種對黃龍病很敏感，如蘇坦檸檬，感病后會出現(xiàn)黃化、葉脈爆裂并很快死樹。有些則中度耐病，如阿力檬、墨西哥來檬等只有散發(fā)性的成團黃化病葉，酸橙只在連續(xù)高光照條件下發(fā)生葉片黃化，施文格枳柚、巴勒斯坦甜來檬只在老葉上有黃化，枸櫞在老葉上有明顯的黃化，四季橘和小花大翼橙在老葉上有比較溫和的癥狀；有些品種耐病，如尤力克檸檬在觀察期內(nèi)沒有出現(xiàn)癥狀，波斯來檬無癥狀或癥狀輕微，卡里佐枳橙少有或沒有黃化，酒餅簕沒有癥狀。枳和卡西大翼橙在觀察期內(nèi)有時顯癥有時不顯癥[12]。

2 微觀結(jié)構(gòu)變化

Folimonova&Achor等[12]發(fā)現(xiàn)感染黃龍病病原后的植株篩管分子細(xì)胞壁胞間層腫大。Fan等[13]比較了黃龍病敏感的甜橙和不敏感（較耐?。┐謾幟试诟胁『蟮奈⒂^結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)這兩個品種的發(fā)病葉柄中均有韌皮部細(xì)胞塌陷、篩管阻塞、淀粉積累現(xiàn)象。易龍等[14]通過電鏡掃描、石蠟切片等技術(shù)觀測到感病的臍橙葉片厚度變薄、氣孔萎縮、孔周圍組織變得粗糙不平整，柵欄組織細(xì)胞由長條形變?yōu)闄E圓形、細(xì)胞間隙增大、排列松散，果蒂的韌皮部部分維管束堵塞。甜橙根在發(fā)病過程中韌皮部纖維被明顯降解。

3 樹體代謝和生理變化

3.1 代謝變化

由于病原菌的侵入導(dǎo)致柑橘代謝發(fā)生變化，代謝途徑顯著變化的有：糖代謝、脂肪酸代謝、細(xì)胞壁轉(zhuǎn)錄因子、激素代謝、脅迫應(yīng)答和光合作用等。甜橙染病后，在無癥狀的葉中，葉片和葉中脈的蔗糖和果糖都有顯著增加，葡萄糖在葉中脈中水平升高，而麥芽糖含量在葉片和葉中脈中明顯降低；在有癥狀的葉中，蔗糖和葡萄糖水平顯著升高，麥芽糖含量降低，果糖含量沒有顯著變化[15]，淀粉在地上部出現(xiàn)積累，地下部分則發(fā)生淀粉欠缺[16]，兩個與淀粉分解代謝相關(guān)的基因DPE2和MEX1被下調(diào)表達[15]。

感病的哈姆林甜橙、葡萄柚及溫州蜜柑中長鏈脂肪酸棕櫚油酸（POA）、油酸（OA）、亞麻酸（ALA）、花生四烯酸（ARA）顯著降低，而脂肪酸與植物的防御反應(yīng)有關(guān)[17]。

3.2 相關(guān)酶的變化

細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶是一種具有高度多態(tài)性的糖蛋白，通常在庫器官如根和嫩葉中有較高的活性，伴隨著韌皮部的蔗糖卸載過程，不僅在糖分配的生理過程中扮演重要角色，而且還參與對病原菌侵染的防御反應(yīng)。細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性在感病甜橙的葉中顯著升高，但在葉中脈沒有明顯改變，在健康和感病的甜橙植株中，可溶性酸性（液泡）與堿性（細(xì)胞質(zhì)）蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性都沒有檢測到[18]。

感病的甜橙植株中與脅迫或防御反應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)在無癥狀和有癥狀的葉中都被上調(diào)表達，特別是幾丁質(zhì)酶、Cu/Zn超氧化物歧化酶、脂氧合酶和miraculin類似蛋白等在甜橙葉片樣品中表達提高了3.6～13.7倍[15]，半胱氨酸蛋白酶的蛋白含量在有癥狀的葉中顯著升高，而無癥狀葉中變化不顯著，半胱氨酸蛋白酶在植物的各種生物進程中起著重要作用，如生長發(fā)育、脅迫應(yīng)答、衰老和細(xì)胞凋亡等。紐荷爾臍橙感病后，葉片的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量分別是健康葉片的19.87%、22.13%和47.71%，MDA含量增加了120.39%，POD、CAT和SOD酶活性顯著提升[14]。感病柑橘樹中礦質(zhì)元素含量有明顯的變化，葉片中N、Ca、Mg、Zn、Fe、B等礦質(zhì)元素含量減少[19,20]。

3.3 基因表達變化

據(jù)樊晶[15]報道基因芯片分析顯示在黃龍病接種后27周的粗檸檬中，有1053個基因發(fā)生了差異表達；在甜橙中，366個基因的表達水平被顯著改變。感染黃龍病的粗檸檬和甜橙與照相比，光合作用相關(guān)的代謝途徑如光反應(yīng)和光呼吸過程被下調(diào)。光合作用相關(guān)基因在帶病根、莖、葉中均下調(diào)表達，而在帶病果實中卻上調(diào)表達。

與蔗糖降解相關(guān)的基因（如蔗糖合成酶和轉(zhuǎn)化酶基因）在粗檸檬感病后27周和甜橙染病后5周被上調(diào)表達。感病的粗檸檬和甜橙中，轉(zhuǎn)錄因子和脅迫應(yīng)答基因的表達模式都受到了明顯影響。MYB-related轉(zhuǎn)錄因子的表達被抑制，其中有4個MYB-related轉(zhuǎn)錄因子基因在粗檸檬和甜橙數(shù)據(jù)中都被下調(diào)表達；尤其是LHY、EPR1和 RVE1的轉(zhuǎn)錄水平在接種后17和/或27周與對照相比降低了2～5倍。CCA1-like轉(zhuǎn)錄因子的表達也有所下降。而LHY,EPR1，RVE1和 CCA1-like轉(zhuǎn)錄因子具有調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律的作用，這類基因的表達水平發(fā)生改變將導(dǎo)致不規(guī)則的晝夜節(jié)律，從而使相關(guān)的代謝發(fā)生紊亂，如光合作用、糖類的運輸和淀粉代謝等。

3.4 激素的變化

柑橘植株感染黃龍病后激素的代謝發(fā)生異常，Rosales&Burns[21]報道，在橘樹開花7個月和12個月后收獲的果實中，花柱端、中段或莖端去除的果肉中乙烯含量明顯低于正常果實，而乙酸（IAA）和脫落酸（ABA）含量卻高于正常果實4倍。激素信號至少在一定程度上調(diào)節(jié)水果的生長和發(fā)育。

4 根際土壤微生物群落變化

Sagaram等[22]發(fā)現(xiàn)在未顯癥的柑橘葉片中脈中有大量的內(nèi)生細(xì)菌，而黃龍病菌豐度很低，顯癥后黃龍病菌豐度升高200倍以上，細(xì)菌種類芯片分析和測序分析結(jié)果均證明顯癥葉片中脈中的優(yōu)勢菌種是黃龍病菌亞洲種。鄭雪芳等[23]發(fā)現(xiàn)柑橘黃龍病株不同健康狀態(tài)葉片的磷脂脂肪酸組成及含量不同,但它們之間的差異均未達到顯著水平。含有黃龍病原葉片的細(xì)菌、真菌、放線菌、G菌PLFAs含量均大于健康葉片。而健康葉片的G菌PLFAs含量及真菌/細(xì)菌值均高于黃龍病葉片。王愛華等[24]發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、考克氏菌屬為廣西無癥健株的優(yōu)勢菌群；微桿菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬和考克氏菌屬為黃龍病罹病植株的優(yōu)勢菌群。

柑橘感染黃龍病后對土壤微生物群落也有一定的影響，管冠等[25]研究發(fā)現(xiàn)與健康晚棱臍橙土壤相比，黃龍病感染初期細(xì)菌和真菌數(shù)量變化不明顯，感染后期細(xì)菌和真菌數(shù)量顯著減少，放線菌在整個感染過程中有小幅減少，但統(tǒng)計分析上看差異不顯著。

5 對木虱吸引力的變化

黃龍病病原感染砂糖橘后，病株會產(chǎn)生一些特殊的揮發(fā)性物質(zhì)如β-水芹烯，從而使其對木虱比健康植株更有吸引力。對比健康和帶病砂糖橘嫩梢的揮發(fā)性物質(zhì)成分，發(fā)現(xiàn)兩者釋放的揮發(fā)性物質(zhì)不僅種類不同，且同種物質(zhì)的含量差異也很大。在帶病砂糖橘嫩梢釋放的揮發(fā)性物質(zhì)中，β–水芹烯的含量最高，該物質(zhì)在對木虱具有強吸引力的九里香釋放的揮發(fā)物中含量也是最高的[26]。此外，感病植株還會釋放另一種特異的揮發(fā)性物質(zhì)——水楊酸甲酯，該物質(zhì)同樣能夠增強帶病植株對木虱的吸引力[27]。

6 展望

柑橘黃龍病是柑橘產(chǎn)業(yè)上的頑癥，雖然圍繞黃龍病開展了很多的研究，做了很多工作，但對于感病植株還是束手無策，沒有有效的藥劑能夠使感病植株恢復(fù)健康。在將來的研究中，黃龍病菌體外培養(yǎng)研究急需解決，若培養(yǎng)成功，相信黃龍病的防治也會得到解決。