蔣 劍，靳艷玲，馬 麗

（1廣電計量檢測（成都）有限公司，成都610045；2中國科學院成都生物研究所，成都610041；3四川出入境檢驗檢疫局，成都610041）

0 引言

2004年，Waters公司推出了全球第一臺超高效液相色譜儀(Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC)。近年來，由于儀器儀表、檢測器設計、數(shù)據(jù)處理和小顆粒填料領域的重大進步和創(chuàng)新，UPLC法得到了快速發(fā)展[1]。UPLC采用低擴散、低交叉污染的進樣器，將樣品注入不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相中，再由具有精確梯度的超高壓色譜泵泵入裝有小粒徑固定相的色譜柱內，在柱內由于被測不同物質與固定相的相互作用不同，順序離開色譜柱，而使各成分被分離，根據(jù)待測物質的特征采用相應的高采樣速度的靈敏檢測器進行檢測，從而實現(xiàn)對試樣的分析[2]。進樣器、色譜泵、色譜柱、檢測器的升級使UPLC的分析速度較HPLC提高了9倍，分辨率提高了2倍，靈敏度提高了3倍[3]，且因分析速度的提升縮短了分析時間，還同時通過減少溶劑用量降低了分析成本。

串聯(lián)質譜(tandem mass spectrometry，MS/MS)由2個質譜串聯(lián)而成，第一級質譜(MS 1)使試樣中各組分在離子源中發(fā)生電離，生成不同荷質比的帶電荷的離子，經(jīng)過氮氣、氬氣等碰撞氣碰撞活化，再經(jīng)過第二級質譜(MS 2)進行質量分析[4]，分析這些離子可獲得化合物的分子量、化學結構、裂解規(guī)律和由單分子分解形成的某些離子間存在的某種相互關系等信息。

超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法(UPLC-MS/MS)則結合了超高效液相色譜儀有效分離熱不穩(wěn)定性及高沸點化合物的分離能力與質譜儀的組分鑒定能力，能確保對超痕量物質的低檢測限，具有高性能和可靠性標準，是一種分離分析復雜有機混合物的有效手段，已成為很多領域高性能定量和鑒別檢測的“金標準”[5-8]。

根據(jù)Web of Science的檢索，自2004年第一臺UPLC問世起至2018年這15年間，以UPLC-MS/MS檢測農藥殘留為主題的文獻共209篇，并有逐年增加的趨勢，僅近5年的文獻數(shù)量就占了一半以上，表明UPLC-MS/MS在農藥殘留檢測方面的科研和應用正逐漸成為該領域的研究熱點。農藥殘留的檢測樣本多為生物樣品，成分復雜，內源性物質的絕對量常高于待測物質數(shù)倍，不同類型基質樣品的檢測方法有其各自的特點。因此，筆者對近年來國內外UPLC-MS/MS在不同基質中農藥殘留檢測的有關研究做綜述，以期為食品安全和環(huán)境分析中農藥殘留的檢測實踐及科學研究提供參考。

1 蔬菜、水果

蔬菜和水果是人們日常最可能接觸的農藥殘留的來源，因此，國內外很多學者都建立了相應的UPLCMS/MS檢測方法。在建立UPLC-MS/MS檢測農藥的方法時，除要選擇合適的超高效液相色譜柱、確定離子源電離模式、優(yōu)化色譜分離條件和質譜分析條件外，最重要的環(huán)節(jié)在于樣品的前處理[9]，通過前處理工藝提高目標農藥的提取、凈化程度[10]。蔬菜和水果為含水量大、含脂肪少的固體樣品，在農藥殘留分析中，其前處理過程比一般液體樣品復雜，也要消耗更多時間[11]。Chen等[12]建立了檢測蔬菜（黃瓜、番茄和胡椒）和水果（葡萄、蘋果）中氟唑菌酰胺及3種具有毒理學意義的代謝物3-(二氟甲基)-1H-吡唑-4-羧酸，3-(二氟甲基)-N-三氟聯(lián)苯-1H-吡唑-4-羧胺和3-(二氟甲基)-1-β-D-吡喃葡萄糖基-N-三氟聯(lián)苯-1H-吡唑-4-羧胺的超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質譜法，樣品用甲酸-乙腈提取后，用十八烷基硅烷吸附劑凈化，經(jīng)1.8 μm的T3色譜柱分離，離子源采用電噴霧負離子模式(ESI-)，檢測限0.14 μg/kg，定量限0.47 μg/kg。

為簡化吸附、凈化工藝，有一些成套的前處理流程被公開并應用于UPLC-MS/MS檢測，如歐盟農藥殘留參考實驗室Anastassiades等[13]開發(fā)的QuEChERS(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)法。由于QuEChERS方法簡便、快捷、經(jīng)濟、高效、安全等特點，自發(fā)布以來，獲得了美國分析化學家協(xié)會(Association of Official Analytical Chemists，AOAC)、歐盟等多個國際機構認可，廣泛應用于食品中農藥殘留分析[14]。魯紅等[15]利用QuEChERS前處理技術結合超高效液相色譜-高分辨飛行時間質譜，同時檢測了蔬菜中敵敵畏、毒死蜱、樂果、氧樂果4種有機磷農藥殘留，檢測限為0.25～0.40 μg/kg，定量限為0.73～1.00 μg/kg，加標回收率為80%～98%。郭虹等[16]建立了蔬菜中噻苯隆、2，4-二氯苯氧乙酸、赤霉素、4-氯苯氧乙酸、氯吡脲、多效唑和烯效唑等7種植物生長調節(jié)劑的超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質譜檢測方法，樣品用ProElut QuEChERS萃取鹽包鹽析分層后過C18凈化柱，為提高檢測的靈敏度和準確度，同時采用正、負雙離子掃描MRM監(jiān)控模式，檢出限為0.17～0.53 μg/kg，定量限為0.55～1.9 μg/kg，回收率為80.1%～118.3%。另外，歐盟農藥殘留參考實驗室在2011年制訂了極性農藥的快速分析方法QuPPe(Quick Polar Pesticides)，并分別針對植物源[17]和動物源農藥[18]檢測公布了操作流程。吳延燦等[19]應用QuPPe前處理技術結合超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質譜建立了檢測黃瓜、番茄、甘藍、馬鈴薯中呋蟲胺及其代謝物的方法，前處理后的樣品，經(jīng)1.7 μm的C18色譜柱進行分離，采用電噴霧正離子(ESI+)模式，多反應監(jiān)測模式(MRM)檢測，檢出限為0.04～0.66 μg/L，定量限為 0.13～2.20 μg/L，回收率為72.0%～109.1%。

為提高目標農藥的萃取工作效率，一些與UPLCMS/MS配套使用的前處理儀器得以開發(fā)上市。紀律等[20]建立了竹筍中百草枯殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質譜檢測方法。為了提高百草枯的萃取工作效率，結合了快速溶劑萃取和固相萃取技術，以甲醇-鹽酸作為萃取溶劑，利用快速溶劑萃取儀提取竹筍中的百草枯，再經(jīng)Oasis WCX固相萃取柱萃取。質譜電離方式為ESI+，檢出限為2 μg/kg，定量限為5 μg/kg，回收率為80.9%～95.6%。

當檢測物質不容易被檢測時，如無紫外吸收等，為增強檢測器對目的物的響應，需要進行衍生化處理[21]，這點與氣相色譜(GC)和液相色譜(LC)的前處理方法是一致的。針對仲丁胺分子量小、結構上沒有生色基團用于最終檢測、常用的柱前衍生劑2，4-二硝基氟苯的毒性較大這些問題，王永蓮等[22]建立了葡萄、白菜和青椒中仲丁胺的超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質譜檢測方法，采用丹磺酰氯在pH 9.0的碳酸鹽體系下進行衍生反應，經(jīng)1.8 μm的C18色譜柱分離，ESI+模式，檢出限為 2.0 μg/kg，定量限為 5.0 μg/kg，加標回收率為81.0%～97.3%。

2 糧油作物

糧油作物具有低含水量、高淀粉、高蛋白、高脂肪等特點。針對這些特點，陳曉英等[23]建立了糧谷中噻蟲胺、乙氧氟草醚、殺蟲脒、異丙隆、異稻瘟凈、抑霉唑、三唑磷、氧樂果等18種農藥的超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質譜檢測方法，樣品經(jīng)乙腈提取后中性氧化鋁柱凈化，用1.7 μm的C18色譜柱分離，ESI+模式，檢測限0.001～0.477 μg/kg，定量限0.01～1.59 μg/kg，其中有13種農藥加標回收率為80%～104%，另5種回收率為62%～84%。戶江濤等[24]采用超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質法，建立了快速檢測大豆中草甘膦(PMG)及其在植物中的主要代謝物氨甲基膦酸(APMA)殘留量的分析方法。針對大豆為高蛋白、高脂肪含量的特殊基質這一特性，采用二氯甲烷前處理去除脂肪；針對PMG和APMA極性均較強、不易揮發(fā)、無紫外吸收、常規(guī)方法分析檢測較困難的問題，采用9-芴甲氧羰酰氯進行柱前衍生，定量限為0.01 mg/kg，回收率為77.7%～91.5%。針對向日葵種子這類高脂肪、高蛋白類基質，Shi等[25]合成了甲胺改性石墨烯，并將其作為固相萃取劑用于噻蟲嗪、吡蟲啉、啶蟲脒等新煙堿類殺蟲劑的超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質譜法測定，檢出限0.05～5.7 ng/kg，定量限 0.2～19.1 ng/kg，加標回收率74.3%～119.1%。

3 其他固體基質

Lehmann等建立了頭發(fā)中乙草胺、溴氰菊酯、甲氧滴滴涕等28種農藥的超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質譜檢測法，采用Z-SEP分散固相吸附劑前處理樣品，經(jīng)1.8 μm的T3色譜柱分離，檢測限0.5～6.3 μg/kg，其中擬除蟲菊酯類農藥受基質效應的影響最大，所以定量限值較高，而莠去津、阿特拉津、吡蟲啉檢出限低于1 μg/kg，達到了較高的靈敏度[26]。

水產(chǎn)品相比于植物、水及土壤具有高脂肪、高蛋白、基質復雜的特點，為此，劉慧慧等[27]建立了鯉魚、南美白對蝦、中華絨鰲蟹、文蛤和海參等水產(chǎn)品中氟胺磺隆、甲磺隆、苯磺隆、煙嘧磺隆等13種磺酰脲類除草劑的固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質譜檢測分析方法。樣品經(jīng)乙酸乙酯提取，考察對比了MAX固相萃取柱、C18固相萃取柱、HLB固相萃取柱和GPC凝膠色譜對提取液的凈化效果，確定樣品采用MAX固相萃取柱凈化，ESI+模式電離，檢出限為1.0 μg/kg，定量限為2.0 μg/kg，加標回收率75.4%～118.3%。張樂等[28]建立了水產(chǎn)品中磺胺吡啶、磺胺嘧啶等62種藥物殘留的超高效液相色譜-四級桿-靜電場軌道阱高分辨質譜方法。采用正離子掃描，質譜Fullms-dd（一級全掃描+自動觸發(fā)二級質譜掃描）模式進行采集分析，檢出限為10 μg/kg，加標回收率48.3%～105.8%。

茶葉基質含有多種復雜成分，包括多酚、生物堿、色素和酚酸，為降低基質效應，Hou等[29]用聚乙烯醇聚吡咯烷酮(PVPP)從茶基質中去除多酚，PSA和GCB固相萃取，建立二硝基呋喃類、尼群吡侖、氯噻嘧啶等8種新煙堿類殺蟲劑的超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質譜檢測法，經(jīng)1.8 μm的C18色譜柱分離，ESI+模式，方法定量限0.01 mg/kg。Zhao等[30]用Cleanert TPT茶葉專用固相萃取小柱凈化樣品，建立了同時檢測茚蟲威、醚菌酯、啶氧菌酯等18種農藥殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質譜檢測法，經(jīng)1.8 μm的C18色譜柱分離，ESI+模式，檢測限0.03～1.5 μg/kg，加標回收率70%～110%。

對于淀粉來說，雖然本身雜質很少，但是前處理過程也不能直接參考其他基質的樣品，因為淀粉在乙腈等有機溶液中會產(chǎn)生溶脹現(xiàn)象，導致提取液無法完全回收，從而影響方法的定量。為準確測定淀粉中的多農藥殘留，余巍等[31]將液液萃取前處理方法與超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜(Q Excative)結合，采取在淀粉中加水后用乙腈溶液提取的方法，經(jīng)1.9 μm的Hypersil Gold aQ色譜柱分離，一級質譜ESI+模式全掃描配合數(shù)據(jù)依賴二級子離子全掃描模式，在14 min內快速篩查淀粉類產(chǎn)品中的224種農藥殘留，有208種農藥的檢出限達到1 μg/kg，224種農藥的定量限均小于或等于10 μg/kg。

針對中草藥復雜成分帶來的基質效應，Mao等[32]采用改進的QuECHESS程序提取農藥，用凝膠滲透色譜(GPC)和分子印跡固相萃取(MISPE)凈化樣品，建立了草凈津、敵草凈等三嗪類化合物的超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質譜法，檢測限低于3 μg/kg，回收率60%～100%。Chen等[33]建立了貝母、板藍根、板藍根、桃仁、金銀花等中草藥中滅克磷、仲丁威、馬拉氧磷等53種農藥的超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質譜法，凈化過程采用了伯仲胺、石墨化炭黑和十八烷基硅烷的分散固相萃取，比較了電噴霧電離(ESI)和大氣壓化學電離(APCI)模式的靈敏度及準確性，結果表明，雖然APCI受樣品基質組分產(chǎn)生的電離抑制影響較小，但是對于大多數(shù)農藥來說，ESI的檢測限比APCI低。這一結果也是絕大多數(shù)UPLC-MS/MS檢測農藥時采用ESI電離模式的原因。

4 液體基質

飲用水具有基質比較干凈的特點，陳永艷[34]、莊乾坤[35]等分別建立了直接進樣-超高效液相色譜串聯(lián)質譜法，樣品經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后直接進樣檢測莠去津及其代謝產(chǎn)物、三唑類殺菌劑。陳永艷等比較了50 mm 和 100 mm 的 1.7 μm UPLC BEH C18柱以 及1.8 μm UPLC HSS T3色譜柱分別以乙腈-純水、甲醇-純水、乙腈-0.1%甲酸水為流動相進行洗脫的效果，結果莠去津及其代謝產(chǎn)物在BEH C18色譜柱上以乙腈-水為流動相，在4 min內完全分離，檢出限為0.0005～0.04 μg/L，回收率74.7%～104.3%。莊乾坤等考察了甲醇-0.15%甲酸溶液、甲醇-10 mmol/L乙酸銨溶液、乙腈-0.15%甲酸溶液和乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液對三唑類殺菌劑分子的離子化效率，最終選擇乙腈-0.15%甲酸溶液作為流動相，三唑醇、亞胺唑、腈菌唑、戊菌唑、氟硅唑和丙環(huán)唑等6種三唑類殺菌劑的檢出限為0.017～0.035 μg/L，定量限為0.058～0.115 μg/L，回收率為89.5%～104.5%。

針對農藥在一般水環(huán)境中痕量的特點，Lu等[36]建立了金屬有機框架(MOF)材料作為吸附劑用于輔助微量固相萃取的前處理方法，用于甲硝唑、二甲硝咪唑、替硝唑等5-硝基咪唑類的超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法檢測檢測限0.03～0.06 μg/L，定量限0.09～0.20 μg/L，回收率75.2%～98.8%。金晶等[37]建立磁性固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質譜法，測定水樣中滅草隆、異丙隆、綠麥隆、敵草隆等4種苯脲類除草劑含量的方法。前處理采用二乙烯基苯（疏水基）和吡咯烷酮（親水基）修飾的磁性納米材料，利用疏水基團阻止磁性材料進一步溶解在水中，利用親水基團吸附水溶性較好的苯脲類除草劑，且將水樣調節(jié)pH 3.0時目標物的回收率最高，經(jīng)1.8 μm的反向C18色譜柱分離，檢出限12.5～16.4 ng/L，回收率為83.7%～107%。Quinete等[38]利用自動固相萃取儀對水樣中的硫丹進行提取，利用超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質譜檢測硫丹異構體和硫丹鹽，離子源為大氣壓化學電離負離子模式(APCI-)，硫丹硫酸鹽、α-硫丹和β-硫丹的檢出限分別低至3、10、7 ng/L。

血液中干擾測定的主要是蛋白，因此Singh等[39]建立了大鼠血漿中氰戊菊酯、甲氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、氟氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯等7種擬除蟲菊酯類農藥的蛋白質沉淀-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜檢測法。該方法的特點在于樣本體積小，僅100 μL，而且總色譜運行時間僅5 min。而腐敗血液中成分更為復雜，可能含有大分子蛋白質、脂肪、多糖的降解產(chǎn)物、活體微生物，小分子胺類、醛酸等，因此，郭震等[40]按照QuEChERS方法使用水-乙腈(1:4)作為提取溶劑配合超聲作為輔助手段，避免了有機溶劑使腐敗血液轉為粘稠血塊而導致回收率偏低的情況，采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜檢測24種常見投毒農藥，考察了5種色譜柱對目標物的色譜分離效果，最終選擇母離子提取色譜圖峰形好、無拖尾的UPLC HSS C18色譜柱，質譜為ESI+模式，采用全信息串聯(lián)質譜掃描(MSE)，檢出限0.43～10.0 μg/L。

5 展望

超高效液相色譜-串聯(lián)質譜的應用范圍非常廣泛，尤其在復雜基質中混合目標物的檢測方面有很好的應用前景。為了使如此貴重的設備更好地服務于檢測實踐，筆者系統(tǒng)梳理了近年來UPLC-MS/MS在農藥殘留檢測方面的國內外文獻，總結了建立UPLC-MS/MS方法時需要考慮的主要因素。相信隨著儀器的不斷升級和檢測方法的不斷改進，超高效液相色譜-串聯(lián)質譜將在農藥殘留檢測，尤其是痕量多農藥殘留檢測方面發(fā)揮越來越重要的作用。

5.1 串聯(lián)質譜類型

目前，很多檢測實驗室都已配備或計劃購置UPLC-MS/MS。根據(jù)質量分析器不同，一般采用的為串聯(lián)三重四極桿質譜(Quadrupole Quadrapde Quadrupole Mass Spectrometry，QqQ MS)，QqQ因為具有毋庸置疑的定量能力，加上相對較低的價格得以廣泛應用于科研、質檢和商檢機構，但是其分辨力和掃描速度一般都低于飛行時間質譜(Time of Flight Mass Spectrometry，ToF-MS)、軌道離子阱質譜(Orbitrap MS)和線性離子阱(Linear Ion Trap)等使用脈沖采樣方式的質譜儀，而ToF和離子阱質譜相對較高的價格又在一定程度上限制了其應用。因此，有些國外的實驗室采用裝備數(shù)臺QqQ并配備一臺離子阱或者ToF的方式來彌補定性方面的不足。

根據(jù)離子源不同，與UPLC串聯(lián)的質譜可用電噴霧電離(ESI)、大氣壓化學電離(APCI)、大氣壓光電離(APPI)以及基質輔助光解吸離子化(MALDI)。ESI適合極性比較大的化合物和大分子化合物，且適于熱不穩(wěn)定化合物，這也是其在農藥檢測方面應用最為廣泛的主要原因；APCI適用于中等極性或弱極性化合物的檢測，不適用于熱不穩(wěn)定化合物；APPI使用得比較少，適于非極性和弱極性化合物的分析；MALDI常用于ToF質譜檢測。

5.2 前處理條件

歐盟農藥殘留參考實驗室制定QuEChERS和QuPPe對于不同類型的樣品提出了成套的前處理流程，具有簡便、快速、高效的特點，在國內已獲得一定的認可。但在具體應用時，還應根據(jù)實際檢測效果進行適當調整，如超聲輔助提高回收率、調節(jié)pH值提高回收率、更換鹽的種類以避免板結等。一般來說，增加前處理步驟可以減少基質效應的干擾，但也會造成回收率降低；而減少前處理步驟可以避免回收率的損失和引入其他影響分析的因素，但基質效率的去除效果往往較差。在建立方法時，應首先考慮如何降低回收率的損失，如果在此條件下無法兼顧基質效率的消除，則可采用相應空白基質溶液配制標準溶液繪制校正曲線以獲得更準確的結果，有條件的實驗室也可嘗試加入同位素內標。

5.3 超高效液相色譜條件

對于極性不同的混合目標檢測物來說，色譜柱對各待測物的響應值至關重要。一般來說C18柱對中弱極性農藥均有良好的分離和保留作用，而有些色譜柱如Hypersil Gold aQ柱同時還對極性物質具有較好的分離和保留作用，可以根據(jù)待測物的特點在比較檢測效果的基礎上做出選擇。當樣品溶液與初始流動相差別較大時，出峰時間較早的化合物的色譜峰會出現(xiàn)分叉或變寬的現(xiàn)象，為避免這種溶劑效應，對于梯度洗脫，采用初始的流動相比例；對于在流動相中溶解度小，必須用強溶劑的時候，減少進樣體積以消除溶劑效應的影響。

5.4 質譜條件

對于質譜檢測來說，待測物只有被離子化后才能被檢測到，需要根據(jù)待測化合物的性質選擇正負離子模式，化合物結構不同，生成的離子帶的電荷就不一樣。堿性化合物易帶正電荷，加和質子或其他正電荷離子；酸性化合物易帶負電荷，失去質子或加和其他負電荷離子。因此，需要在充分掌握待測化合物性質的基礎上加以選擇。