董輝輝， 韓 萃， 沈 陽， 孫 躍， 朱麗巖， 王 騰， 戴玲靈

(中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003)

TBBPA(Tetrabromobisphenol A， TBBPA)是目前全球應(yīng)用最廣泛、使用量最高的溴系阻燃劑(Brominated Flame Retardant， BFRs)之一。TBBPA具有半揮發(fā)性，會從產(chǎn)品釋放到環(huán)境中，并利用高親脂性在生物體內(nèi)蓄積，隨著TBBPA在生活生產(chǎn)過程中的廣泛使用，其在各類環(huán)境介質(zhì)和生物體中的含量不斷增加[1]，在空氣、土壤、底泥和水生生物體內(nèi)均已檢測出TBBPA，甚至在人體血液和母乳中也有檢出報(bào)道[2-4]。而且近些年來TBBPA被認(rèn)為是八溴聯(lián)苯醚和五溴聯(lián)苯醚的替代品，其使用量仍在持續(xù)增長[5]。TBBPA 的大量使用，帶來了相應(yīng)的環(huán)境問題，因此近年來國內(nèi)外研究者越來越重視對TBBPA生態(tài)毒理效應(yīng)的研究。

橈足類(Copepoda)隸屬于節(jié)肢動物門(Arthropoda)、甲殼亞門(Crustacea)，是一類種類多、數(shù)量龐大且分布廣泛的小型低等甲殼動物[6]，既是浮游植物的攝食者，又是魚類的餌料基礎(chǔ)，在海洋生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動中有不可替代的作用。日本虎斑猛水蚤具有世代周期短，繁殖力強(qiáng)，且易于在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的特點(diǎn)，被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用于毒性污染物( 如內(nèi)分泌干擾物、以及金屬污染物)的檢測[7-8]，是開展生態(tài)毒理學(xué)試驗(yàn)的理想生物[9]。

污染物不同的暴露方式是影響污染物在生物體內(nèi)積累的關(guān)鍵因素[10-11]，目前橈足類毒理學(xué)研究多以水體暴露的方式進(jìn)行，通過餌料暴露的慢毒性研究鮮少涉及。自然環(huán)境中污染物不僅可以直接對動物產(chǎn)生毒性效應(yīng)，還可以通過食物鏈進(jìn)入捕食者體內(nèi)進(jìn)而產(chǎn)生影響，因而單獨(dú)的水體暴露并不能完全說明污染物對實(shí)驗(yàn)動物的影響。

本研究以日本虎斑猛水蚤作為實(shí)驗(yàn)對象，研究水體暴露和餌料暴露兩種方式下，TBBPA對日本虎斑猛水蚤繁殖和發(fā)育的影響，加入餌料暴露可以使實(shí)驗(yàn)條件更加接近于自然狀態(tài)，更加全面地反映TBBPA的潛在危害。本研究可為評估TBBPA對海洋無脊椎動物的影響提供資料與方法，對TBBPA的監(jiān)控和治理具有重要意義。

1 材料與方法[12-14]

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 受試生物采集與培養(yǎng) 日本虎斑猛水蚤采自青島匯泉灣附近海域，已在實(shí)驗(yàn)室連續(xù)培養(yǎng)多代，室內(nèi)培養(yǎng)條件為溫度(20±1)℃，鹽度(30±1)，光周期 12 h L∶12 h D。培養(yǎng)所用的海水經(jīng)0.45 μm孔徑的濾膜過濾，充分曝氣24 h后使用。實(shí)驗(yàn)餌料為6.3× 104cells/mL青島大扁藻(Platymonashelgolandica)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 實(shí)驗(yàn)使用的TBBPA固體和二甲基亞砜(DMSO)均為分析純，分別購自J&K化學(xué)試劑有限公司和國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，TBBPA 純度 > 98% 。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 急性毒性實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)設(shè)定空白對照組、溶劑對照組D(助溶劑為二甲亞砜DMSO)、1.06、1.6、2.4、3.6、5.4、8.1 mg·L-1TBBPA共8組。每組有三個平行，每個平行組挑選20只健康活潑的日本虎斑猛水蚤。培養(yǎng)條件同上，每隔24 h觀察并記錄日本虎斑猛水蚤的死亡情況，并更換50%的對應(yīng)溶液。

1.2.2 慢性毒性實(shí)驗(yàn) 有實(shí)驗(yàn)表明[15]，藻細(xì)胞在96 h時達(dá)到最大富集量和最大富集系數(shù)，，因此根據(jù)96h-LC50本實(shí)驗(yàn)將扁藻提前放入1/10 96h-LC50即0.31 mg/L的TBBPA中進(jìn)行96 h染毒。

實(shí)驗(yàn)分為溶劑對照組、餌料暴露組和水體暴露組三組。溶劑對照組，海水中TBBPA濃度為0 mg·L-1，投喂未經(jīng)染毒的青島大扁藻；水體暴露組，海水中TBBPA濃度為0.31 mg·L-1，投喂未經(jīng)染毒的餌料；餌料暴露組，海水中TBBPA濃度為0 mg·L-1，投喂在0.31 mg·L-1的TBBPA中染毒96 h的青島大扁藻。各組均有3個平行，每個平行挑選24只無節(jié)幼蟲至24孔板進(jìn)行單只培養(yǎng)并記錄發(fā)育時間、首次掛卵雌體出現(xiàn)時間和產(chǎn)卵量等指標(biāo)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0軟件分析處理。

2 結(jié)果

2.1 急性毒性影響

急性毒性實(shí)驗(yàn)中，對照組及溶劑對照組中日本虎斑猛水蚤未觀察到死亡現(xiàn)象，這表明實(shí)驗(yàn)中沒有溶劑效應(yīng)；實(shí)驗(yàn)組日本虎斑猛水蚤存活率隨著TBBPA濃度的升高而逐漸下降，96 h時8.1 mg/LTBBPA組死亡率達(dá)到100%(見圖1)。運(yùn)用軟件SPSS 19.0分析求出TBBPA暴露下日本虎斑猛水蚤的96 h-LC50為3.1 mg/L，其95%可信區(qū)間為2.841～3.311 mg·L-1，做回歸曲線擬合得出TBBPA濃度與日本虎斑猛水蚤96 h存活率的二次曲線方程為y=105.63+1.3x-1.99x2，二次曲線模型擬合度為0.95，P<0.01(見表1)。

圖1 TBBPA暴露下日本虎斑猛水蚤96 h的存活率Fig.1 The survival rate of T. japonicus exposed to TBBPA in 96 h

暴露時間①回歸方程②R2顯著性水平③半致死濃度④96 h y=105.63+1.3x-1.99x20.95P<0.013.1 mg·L-1

注：①Exposure time；②Regression equation；③Significant level；④LC50

2.2 慢性毒性試驗(yàn)

2.2.1 不同暴露方式下TBBPA對日本虎斑猛水蚤發(fā)育的影響 2種暴露方式下TBBPA未對日本虎斑猛水蚤的發(fā)育率產(chǎn)生顯著影響(見圖2)。對照組、餌料暴露組和水體暴露組日本虎斑猛水蚤無節(jié)幼蟲發(fā)育成功率均在90%以上，分別為 98.77%、91.03%和96.94%。與其他兩組相比，餌料暴露組發(fā)育成功率略低，但各組間無顯著差異(P>0.05)。

(D組為DMSO對照組；不同字母P<0.05；相同字母P>0.05。 The solvent control group is abbreviated as D; Different lettersP<0.05; Same lettersP>0.05.)

圖2 不同暴露方式下TBBPA對日本 虎斑猛水蚤無節(jié)幼蟲變態(tài)率的影響
Fig.2 Effects of TBBPA on metamorphsis rate ofT.japonicusin different exposure modes

對照組、水體暴露組和餌料暴露組中日本虎斑猛水蚤無節(jié)幼蟲發(fā)育至橈足幼體的時間分別為4.76、4.87和4.69 d，各組間無顯著差異(P>0.05)(見圖3)。與對照組相比，水體暴露組橈足幼體發(fā)育至成熟個體的時間有所延長，但與對照組間沒有顯著差異(P>0.05)；餌料暴露明顯縮短了橈足幼體發(fā)育至成熟個體的時間，與對照組和水體暴露組均有顯著差異(P<0.05)。

(D組為DMSO對照組；不同字母P<0.05；相同字母P>0.05。 The solvent control group is abbreviated as D; Different lettersP<0.05; Same lettersP>0.05.)

圖3 不同暴露方式下TBBPA對日本 虎斑猛水蚤發(fā)育時間的影響
Fig.3 Effects of TBBPA on development time ofT.japonicusin different exposure modes

2.2.2 不同暴露方式下TBBPA對日本虎斑猛水蚤繁殖的影響 2種暴露方式下TBBPA均縮短了日本虎斑猛水蚤首只掛卵雌體出現(xiàn)的時間(見圖4)。對照組、餌料暴露組和水體暴露日本虎斑猛水蚤第一只掛卵雌體出現(xiàn)的時間分別為16.67、13.33和14.33 d。數(shù)據(jù)分析顯示僅餌料暴露組與對照組間有顯著性差異(P<0.05)。

(D組為DMSO對照組；不同字母P<0.05；相同字母P>0.05。 The solvent control group is abbreviated as D; Different lettersP<0.05; Same lettersP>0.05.)

圖4 不同暴露方式下TBBPA對日本虎斑 猛水蚤首只掛卵雌體出現(xiàn)時間的影響
Fig.4 Effects of TBBPA on the fist female mature time ofT.japonicusin different exposure modes

兩種暴露方式下TBBPA對日本虎斑猛水蚤的平均產(chǎn)卵量產(chǎn)生了不同的影響(見圖5)。平均產(chǎn)卵量水體暴露組<對照組<餌料暴露組。與對照組相比，水體暴露組雌體平均產(chǎn)卵量略微減少(P>0.05)；餌料暴露組產(chǎn)卵量與對照組相比增加顯著(P<0.05)，與水體暴露組相比增加極顯著(P<0.01)。

(D組為DMSO對照組；不同字母P<0.05；相同字母P>0.05。 The solvent control group is abbreviated as D; Different lettersP<0.05; Same lettersP>0.05.)

圖5 不同暴露方式下TBBPA對日本 虎斑猛水蚤平均產(chǎn)卵量的影響
Fig.5 Effects of TBBPA on eggs female ofT.japonicusin different exposure modes

對照組，水體暴露組和餌料暴露組日本虎斑猛水蚤的產(chǎn)卵間隔分別為3.14、2.97和3.15 d(見圖6)，各組間均無明顯差異(P>0.05)。

(D組為DMSO對照組；不同字母P<0.05；相同字母P>0.05。 The solvent control group is abbreviated as D; Different lettersP<0.05; Same lettersP>0.05.)

圖6 不同暴露方式下TBBPA對日本虎 斑猛水蚤卵囊發(fā)育時間的影響
Fig. 6 Effects of TBBPA on oocyst development time ofT.japonicusin different exposure modes

如圖7所示，對照組、餌料暴露組和水體暴露組日本虎斑猛水蚤完成一次生活史所需的時間分別為22.20、18.93和21.69 d。與對照組比，水體暴露組無顯著差異(P>0.05)；餌料暴露組明顯縮短了日本虎斑猛水蚤的生活史周期(P<0.01)。

(D組為DMSO對照組；不同字母P<0.05；相同字母P>0.05。 The solvent control group is abbreviated as D; Different lettersP<0.05; Same lettersP>0.05.)

圖7 不同暴露方式下TBBPA對日本虎斑 猛水蚤完成一次生活史所需的影響
Fig. 7 Effects of TBBPA on life cycle ofT.japonicusin different exposure modes

3 討論

TBBPA是一種持久性有機(jī)污染物(POPs)和潛在的內(nèi)分泌干擾物(Endocrine Disrupting Chemicals， EDCs)，有研究顯示，與五溴聯(lián)苯醚(BDE)和六溴環(huán)十二烷(HBCD)等溴代物相比，其具有甲狀腺干擾性、免疫和細(xì)胞毒性、神經(jīng)毒性以及雌激素干擾性等毒性效應(yīng)，對生物的毒性更高[1,16]。急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與哺乳動物相比，TBBPA對水生生物毒性更高[17]，如海洋藻類、水蚤、糠蝦及魚類對TBBPA 均比較敏感。國際化學(xué)品安全規(guī)劃署( IPCS，International Program on Chemical Safety)公布的TBBPA對虹鱒魚(Salmogairdneri)、藍(lán)鰓太陽魚(Lepomismacrochirus)和黑頭軟口鰷(Pimephalespromelas)的96h-LC50分別為0.4、0.51和0.54 mg·L-1，對糠蝦(Mysidopsisbahia)和大型溞(Paphniamagna)的LC50接近1 mg/L(IPCS，1995 )[18]。根據(jù)《新化學(xué)物質(zhì)危害評估導(dǎo)則(HJ/T154-2004)》的毒性評定標(biāo)準(zhǔn)，TBBPA對多數(shù)水生生物的急性毒性均在高毒性甚至極高毒性水平[19]。

本研究測得TBBPA對日本虎斑猛水蚤的96 h-LC50為3.1 mg·L-1。之前的研究結(jié)果顯示，TBBPA對中華哲水蚤[12](Calanussinicus)和太平洋真寬水蚤[13](Eurytemorapacifica)的96 h-LC50分為427.6和178 μg·L-1，對擬長腹劍水蚤[20](Oithonasimilis)48 h-LC50為3.106 mg·L-1。這表明，不同橈足類對TBBPA的耐受能力存在差異，日本虎斑猛水蚤對TBBPA的耐受性相對較高。徐風(fēng)風(fēng)[21]在研究四溴聯(lián)苯醚(BDE-47)對橈足類的急性毒性試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)污染物對不同橈足類的急性毒性存在差異，BDE-47對日本虎斑猛水蚤的96 h-LC50約為太平洋真寬水蚤的15倍。Rajendran 和 Venugopalan[22]的研究中DDT對橈足類真哲水蚤(Eucalanussp.)和紡錘水蚤(Acartiasp.)的24 h-LC50也差異顯著分別為12和28 μg·L-1。綜上所述，橈足類對有機(jī)污染物的敏感性具有物種差異性。

本實(shí)驗(yàn)中，餌料暴露組明顯縮短日本虎斑猛水蚤幼體發(fā)育至成體的時間和生活史，這是因?yàn)闃镒泐愒诟靼l(fā)育期的發(fā)育時間受生理制約和外界壓力的共同影響[23]，而暴露于TBBPA后日本虎斑猛水蚤的攝食率和代謝速率會發(fā)生變化，進(jìn)而影響其生長發(fā)育。之前就有研究發(fā)現(xiàn)較低濃度的污染物可促進(jìn)橈足類攝食、加快代謝速度和縮短生活史周期[24]。韓萃等[20]發(fā)現(xiàn)，低濃度的TBBPA(0.031 mg·L-1)可促進(jìn)了擬長腹劍水蚤的發(fā)育。王曉敏等[25]的研究同樣發(fā)現(xiàn)低濃度的污染物可以縮短橈足類發(fā)育至成熟個體的時間。鞏文靜[26]等發(fā)現(xiàn)TBBPA暴露能誘導(dǎo)加快擬長腹劍水蚤的攝食速率。徐風(fēng)風(fēng)等[21]的研究中同樣發(fā)現(xiàn)BDE-47能促進(jìn)太平洋真寬水蚤的攝食率和濾水率，會增加日本虎斑猛水蚤的攝食率、濾水率、耗氧率和排氨率。綜上，推測TBBPA可以通過影響日本虎斑猛水蚤的代謝速率進(jìn)而影響其在日本虎斑猛水蚤體內(nèi)的積累，最終導(dǎo)致發(fā)育時間以及生活史周期的變化。實(shí)驗(yàn)中無節(jié)幼體變態(tài)時間并沒有受到TBBPA的毒性影響，可能是因?yàn)槿毡净呙退闊o節(jié)幼蟲期對青島大扁藻的攝食量較低，體內(nèi)蓄積的TBBPA不足以產(chǎn)生毒性效應(yīng)。鄭重等[27]就曾指出橈足類無節(jié)幼蟲期可分為六期，前三期依靠卵黃為生，第Ⅳ期才開始進(jìn)行攝食。另外，還有研究表明，污染物會干擾橈足類蛻皮激素的調(diào)節(jié)，導(dǎo)致蛻皮過程的紊亂，進(jìn)而影響橈足類的發(fā)育時間[28-29]。在之后的研究中，探究TBBPA對橈足類蛻皮激素的影響，有利于我們更好的了解TBBPA的毒性作用機(jī)制。

相比對照組，餌料暴露組日本虎斑猛水蚤第一只掛卵雌體出現(xiàn)的時間明顯縮短。這是因?yàn)門BBPA具有弱的雌激素效應(yīng)[30]，在一定濃度范圍內(nèi)會促進(jìn)日本虎斑猛水蚤水蚤卵巢的成熟。Andersen等[31]也發(fā)現(xiàn)低濃度的雙酚A(20 μg·L-1)能刺激湯氏紡錘水蚤(Acartiatonsa)卵巢的成熟。餌料暴露組日本虎斑猛水蚤卵囊發(fā)育時間的略微縮短和產(chǎn)卵量的顯著增加，表明在一定的污染物濃度范圍內(nèi)，面對脅迫橈足類傾向于分配更多的能量用于個體的繁殖。Walthall W K和Michalek-Wagner K等[32-33]研究也發(fā)現(xiàn)，逆境條件下生物體會進(jìn)行能量重新分配，通過增加生殖量來掩蓋死亡率的上升，以維持種群穩(wěn)定。Andersen H R和季更生等[31,34]也發(fā)現(xiàn)，一定濃度的污染物的刺激可引起橈足類產(chǎn)卵率增高。Siu 等[35]的研究中0.2 μg·L-1多氯聯(lián)苯提高了火腿偽鏢水蚤的產(chǎn)卵率。此外，一定污染物濃度范圍內(nèi)，污染物可刺激橈足類攝食增加、代謝速度加快[24]，進(jìn)而引起產(chǎn)卵率增高[31]。另外，本研究只觀察了TBBPA對日本虎斑猛水蚤單世代生殖力的變化，TBBPA的多世代暴露下橈足類的生殖策略是否會發(fā)生改變需要進(jìn)一步的探究。

兩種暴露方式下，僅餌料暴露組對日本虎斑猛水蚤的發(fā)育、繁殖產(chǎn)生了影響，這表明暴露方式會影響TBBPA在日本虎斑猛水蚤體內(nèi)的蓄積。之前也有研究發(fā)現(xiàn)，污染物在生物體內(nèi)的蓄積受多種因素的影響，如：污染物的理化性質(zhì)、生物體自身的代謝能力、年齡、性別以及污染物暴露濃度、方式和環(huán)境因素等，其中污染物不同的暴露方式是影響污染物在生物體內(nèi)積累的關(guān)鍵因素[10-11]。TBBPA水體暴露未對日本虎斑猛水蚤發(fā)育、繁殖產(chǎn)生影響，可能是因?yàn)槿毡净呙退轶w表有幾丁質(zhì)外殼的保護(hù)，可以有效地阻止污染物的滲入，水體中僅有極少量的TBBPA可以進(jìn)入日本虎斑猛水蚤體內(nèi)。Mauchline[36]也曾報(bào)道橈足類很少或幾乎不能通過體表吸收海水中的污染物。而餌料暴露組中扁藻蓄積的TBBPA通過食物鏈直接傳至日本虎斑猛水蚤并在其體內(nèi)進(jìn)行較為快速地蓄積。Wallberg 等[37]就曾指出營養(yǎng)轉(zhuǎn)移是疏水性有機(jī)污染物沿浮游生物群落轉(zhuǎn)移的一個重要途徑。Zhang Q等[38]發(fā)現(xiàn)攝食積累是海洋橈足類和魚類中二噁英積累的主要途徑。Magnusson, K等[39]的研究證明食物攝取是EDCs營養(yǎng)轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵途徑。另外，在研究重金屬對橈足類的的毒性影響時也發(fā)現(xiàn)了暴露方式會影響毒物在橈足類體內(nèi)的蓄積。王文雄等[40]發(fā)現(xiàn)海洋動物(包括無脊椎動物和魚類)中富集重金屬的主要途徑是食物暴露。Hook SE等[41-42]的研究顯示藻類暴露于遠(yuǎn)低于安全濃度以下的重金屬后被橈足類攝食，會導(dǎo)致橈足類的正常繁殖活動受抑，餌料暴露會使橈足類體內(nèi)重金屬負(fù)荷成倍增加。此外，Gretchen等[43]研究中也發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象，湯氏紡錘水蚤直接暴露于水體低濃度重金屬未產(chǎn)生毒性效應(yīng)，一旦以提前暴露的浮游植物作為橈足類的餌料，其繁殖則受到顯著影響。雖然環(huán)境脅迫不盡相同，但上述結(jié)果與本研究的結(jié)果基本一致。

綜上所述，TBBPA會對日本虎斑猛水蚤的生殖發(fā)育產(chǎn)生影響，發(fā)育時間和繁殖力對毒物的敏感性較高，具有在低濃度下可檢測的特點(diǎn)。TBBPA餌料暴露對日本虎斑猛水蚤的影響更大，暴露方式會影響TBBPA在日本虎斑猛水蚤體內(nèi)的積累速率。