朱夢(mèng)嬋 邰先桃 王 堅(jiān) 張 粲 雙曉萍 金美玲 夏世金

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary hypertension, PH)是一種以進(jìn)行性血管狹窄和平均肺動(dòng)脈壓升高為特征的慢性致死性疾病，隨著病程的進(jìn)展，常導(dǎo)致右心衰竭和死亡。其中肺血管重塑是PH的關(guān)鍵病理變化，包括肺血管細(xì)胞的增殖和凋亡異常，遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈的肌化，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的沉積和血管周?chē)难装Y。目前治療PH盡管能夠緩解臨床癥狀，但仍不足以逆轉(zhuǎn)PH的進(jìn)展并提高生存率，迫切需要新的治療方法。微小RNA(microRNA, miRNA)是一類(lèi)具有不同功能和調(diào)節(jié)活性的非編碼RNA，已經(jīng)在許多疾病中進(jìn)行了大量研究。外泌體(exosomes，EXOs)是納米載體，能夠?qū)⒉煌呢浳?例如miRNA)轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞。越來(lái)越多的證據(jù)表明，外泌體miRNA可作為新的生物標(biāo)志物和針對(duì)不同疾病的治療靶標(biāo)。在本文中，我們主要關(guān)注外泌體及其miRNA在PH中的潛在臨床意義，強(qiáng)調(diào)其在PH臨床前階段用作診斷生物標(biāo)志物的潛力以及它們用于治療藥物的可能性。

目前已知只有2%的人類(lèi)基因組編碼蛋白質(zhì)，98%被主動(dòng)轉(zhuǎn)錄成失去蛋白質(zhì)編碼能力的RNA分子，被稱(chēng)為非編碼RNA(non-coding RNA, ncRNA)。微小RNA(miRNA)作為最廣泛描述的ncRNA，是一類(lèi)在真核生物中發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)性?xún)?nèi)源性小RNA，序列長(zhǎng)度在18～25個(gè)核苷酸，其通過(guò)促進(jìn)靶mRNA的切割或通過(guò)抑制它們的翻譯來(lái)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)水平[1-2]。miRNA在真核細(xì)胞中形成主要的調(diào)控基因家族，可同時(shí)影響數(shù)百種mRNA的翻譯。最近的研究表明，在哺乳動(dòng)物中，miRNA參與了所有蛋白質(zhì)的50%以上編碼過(guò)程[3]，在許多生物過(guò)程如細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞遷移、疾病發(fā)生和疾病進(jìn)展等方面具有重要作用[4-7]。

外泌體是晚期內(nèi)體/多囊體(multivesicular body, MVB)與質(zhì)膜融合后釋放到細(xì)胞外環(huán)境的納米級(jí)小膜囊泡(直徑30～100 nm)，幾乎可被來(lái)自不同生物體的所有細(xì)胞主動(dòng)分泌[8-9]。外泌體的組成類(lèi)似于親代細(xì)胞，并且提供循環(huán)可追蹤的特異性特征。外泌體是含有生物分子的異質(zhì)組合物，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸(DNA、mRNA、ncRNA)[10]。當(dāng)外泌體循環(huán)時(shí)，通過(guò)膜融合、內(nèi)吞作用和配體-受體結(jié)合被相鄰細(xì)胞或遠(yuǎn)處細(xì)胞吸收，可直接影響受體細(xì)胞基因表達(dá)和細(xì)胞表型，被認(rèn)為是正常和病理背景下眾多生物過(guò)程中的關(guān)鍵參與者[11-13]。

在過(guò)去幾年中，越來(lái)越多的研究報(bào)道了miRNA在不同疾病中的作用。自2007年，Valadi等[14]最早證明miRNA可以通過(guò)外泌體在細(xì)胞之間進(jìn)行轉(zhuǎn)移，外泌體中功能性miRNA的發(fā)現(xiàn)開(kāi)辟了一個(gè)更有吸引力的世界。在外泌體中存在的各種RNA中，miRNA占總RNA的76.2%。細(xì)胞釋放的外泌體中的miRNA可以與相關(guān)載體一起循環(huán)以到達(dá)相鄰細(xì)胞和遠(yuǎn)處細(xì)胞，遞送至靶細(xì)胞的外泌體miRNA可顯著影響靶細(xì)胞/受體細(xì)胞內(nèi)的生物途徑，導(dǎo)致細(xì)胞功能改變和病理發(fā)展過(guò)程。此外，外泌體脂質(zhì)雙分子層的膜結(jié)構(gòu)保護(hù)miRNA免受體液中的酶降解，從而具有相對(duì)長(zhǎng)且穩(wěn)定表達(dá)的持續(xù)時(shí)間。已知有許多miRNA種類(lèi)的調(diào)節(jié)作用參與了血管細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡和炎癥的整合基因程序的轉(zhuǎn)錄，使得它們理想地適合作為調(diào)節(jié)PH的發(fā)病機(jī)制[15-16]，現(xiàn)對(duì)涉及PH發(fā)病機(jī)制的外泌體miRNA及其潛在臨床應(yīng)用進(jìn)行綜述。

一、 miRNA被分選入外泌體中的潛在模式

在細(xì)胞核中，miRNA基因首先被轉(zhuǎn)錄為初級(jí)miRNA(pri-miRNA)，并由Drosha復(fù)合物加工以形成前體miRNA(pre-miRNA)，其通過(guò)exportin5復(fù)合物輸出到細(xì)胞質(zhì)中。然后pre-miRNA經(jīng)Dicer復(fù)合物消化，成為成熟的miRNA。成熟的miRNA可通過(guò)以下4種潛在的模式分選到外泌體中[17-18]。

1. 中性鞘磷脂酶2依賴(lài)途徑： 中性鞘磷脂酶2(neural sphingomyelinase 2, nSMase2)是第一個(gè)被報(bào)道的與miRNA被分選入外泌體有關(guān)的分子。Kosaka等[19]證明nSMase2的過(guò)表達(dá)增加了外泌體miRNA的數(shù)量，相反地，抑制nSMase2的表達(dá)則減少了外泌體miRNA的數(shù)量。

2. miRNA基序和異質(zhì)核糖核蛋白依賴(lài)途徑： Villarroya-Beltri等[20]發(fā)現(xiàn)異質(zhì)核糖核蛋白A2B1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2B1, hnRNPA2B1)可識(shí)別miRNA序列的3'區(qū)域中的GGAG基序，并導(dǎo)致特定的miRNA被負(fù)載到外泌體中。miRNA被分選入外泌體的過(guò)程可以通過(guò)結(jié)合基序的誘變或hnRNPA2B1磺?；母淖儊?lái)調(diào)節(jié)。另外兩個(gè)hnRNP家族蛋白hnRNPA1和hnRNPC也可以與外泌體miRNA結(jié)合，這表明它們也可能是miRNA分選的候選者，但目前尚未發(fā)現(xiàn)任何結(jié)合基序。

另一個(gè)基序結(jié)合蛋白，突觸結(jié)合素結(jié)合胞質(zhì)RNA相互作用蛋白(synaptotagmin-binding cytoplasmic RNA-interacting protein, SYNCRIP)也被稱(chēng)作hnRNP-Q，可識(shí)別miRNA中的GGCU基序。敲低SYNCRIP會(huì)降低外泌體中miRNA的分類(lèi)，而將GGCU基序嵌入到輸出不良的miRNA中會(huì)增強(qiáng)其在外泌體中的載量[21]。

3. 3′-末端miRNA序列依賴(lài)途徑： Koppers-Lalic等[22]發(fā)現(xiàn)3′-末端腺苷酸化miRNA在B細(xì)胞中相對(duì)富集，而3′-末端尿苷酸化同種型在來(lái)自B細(xì)胞或尿液的外泌體中相對(duì)富集?？偟膩?lái)說(shuō)，它表明轉(zhuǎn)錄后的修飾，特別是3′-末端腺苷酸化和尿苷酸化，發(fā)揮相反的作用，可能有助于直接將miRNA分選到外泌體中。因此，兩種分選模式顯示miRNA序列的3′區(qū)域或3′末端包含尚未鑒定的關(guān)鍵分選信號(hào)。

4. miRNA介導(dǎo)的沉默復(fù)合體依賴(lài)途徑： 成熟的miRNA可以與裝配蛋白相互作用形成稱(chēng)為microRNA介導(dǎo)的沉默復(fù)合體(miRNA-induced silencing complex, miRISC)，包括miRNA，miRNA可抑制mRNA，GW182和AGO2。Guduric-Fuchs等[23]發(fā)現(xiàn)敲除AGO2可以減少HEK293T源性外泌體中優(yōu)先輸出的miRNA的類(lèi)型或豐度，例如miR-451，miR-150和miR-142-3p。其他證據(jù)也支持miRISC和外泌體miRNA分選之間的關(guān)系。首先，發(fā)現(xiàn)miRISC的主要成分與MVB共定位[24]；其次，阻斷MVB進(jìn)入溶酶體的轉(zhuǎn)換可能導(dǎo)致miRISC的過(guò)度積累，而阻斷MVB的形成則導(dǎo)致miRISC的喪失[25]；第三，響應(yīng)細(xì)胞活化而發(fā)生的miRNA可抑制靶標(biāo)水平的變化，并可能會(huì)導(dǎo)致miRNA分選至外泌體[26]。

三、外泌體miRNA的檢測(cè)方法

首先是外泌體的分離富集。目前常用的外泌體提取方法主要是基于外泌體的尺寸、密度和免疫表型等特征，包括超速離心法、密度梯度離心法、超濾法、聚合物沉淀法、體積排阻色譜法和免疫磁珠分選法等。其次是對(duì)外泌體進(jìn)行表征，包括外泌體的大小、濃度、形態(tài)及蛋白質(zhì)組成等信息，可以通過(guò)電鏡、動(dòng)態(tài)光散射、納米顆粒跟蹤分析儀、蛋白質(zhì)免疫印跡、酶聯(lián)免疫吸附法、流式細(xì)胞儀等技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)[27]。最后是外泌體miRNA的檢測(cè)，目前有多種方法可用于miRNA分析，包括Northern 印跡，定量RT-PCR(qRT-PCR)，微陣列和新一代測(cè)序技術(shù)等。每種檢測(cè)方法都有其相對(duì)的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，在選擇檢測(cè)microRNA方法的過(guò)程中需要在成本，準(zhǔn)確性，準(zhǔn)確性和樣品數(shù)量之間取得平衡。Northern印跡可鑒定新型和先前未鑒定的miRNA，但是該方法需要大量的總RNA(數(shù)百微克)作為起始材料，并且常常無(wú)法檢測(cè)到低豐度的miRNA。qRT-PCR是定量miRNA的金標(biāo)準(zhǔn)，通常用于miRNA的表達(dá)譜分析和驗(yàn)證通過(guò)其他方法(例如微陣列和Northern 印跡)獲得的結(jié)果，但是存在通量問(wèn)題。微陣列法可同時(shí)定量檢測(cè)多個(gè)miRNA樣本，篩選出單個(gè)樣本體積內(nèi)數(shù)百靶序列，具有高通量的特點(diǎn)，但檢測(cè)范圍取決于芯片上的探針信息，缺少發(fā)現(xiàn)新miRNA的能力，并且靈敏度也較低，通常被用作篩選工具，而不是用作定量分析平臺(tái)。新一代測(cè)序技術(shù)可以同步做到邊合成邊測(cè)序，極大地提高了發(fā)現(xiàn)miRNA的幾率，為研究miRNA發(fā)生和功能機(jī)制提供了大量的信息，具有非常廣闊的前景，但目前其在臨床中的應(yīng)用仍處于起步階段[28- 29]。

四、肺動(dòng)脈高壓外泌體中的miRNA表達(dá)譜

Aliotta等[30]發(fā)現(xiàn)來(lái)自野百合堿(monocrotaline, MCT)和賦形劑處理小鼠的肺源性細(xì)胞外囊泡(lung-derived extracellular vesicle, LEV)和血漿源性細(xì)胞外囊泡(plasma-derived extracellular vesicle, PEV)中有相似數(shù)量的miRNA(MCT-LEV，賦形劑-LEV，MCT-PEV，賦形劑-PEV分別為224、215、241、278)。其中與賦形劑-LEV，-PEV相比，在MCT-LEV，-PEV中有6個(gè)上調(diào)2倍及以上的miRNAs(miRs-34a，-145，-328，-381，-451，-467c)，7個(gè)下調(diào)2倍及以上的miRNAs(miRs-99，-100，-125a，-132，-340，-350，-546)，還有3個(gè)miRNAs(miRs-10b，-698，-743b)變化不大。

此后該作者進(jìn)一步對(duì)PH外泌體進(jìn)行了更全面的miRNA微陣列分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與從賦形劑注射的小鼠中分離的血漿EXOs相比，MCT-PH小鼠血漿EXOs包含19個(gè)獨(dú)特表達(dá)或上調(diào)的miRNAs，140個(gè)miRNAs減少或不表達(dá)，和221個(gè)以相似水平表達(dá)的miRNAs。與從Lin-骨髓細(xì)胞中分離出的EXOs相比，間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞源性外泌體(mesenchymal stromal cell-derived EXOs, MSC-EXOs)包含65個(gè)獨(dú)特表達(dá)或上調(diào)的miRNAs，147個(gè)減少表達(dá)或不表達(dá)的miRNAs和168個(gè)以相似表達(dá)水平表達(dá)的miRNAs。與從患有MCT-PH的小鼠血漿中分離的EXOs相比，MSC-EXOs包含44個(gè)獨(dú)特表達(dá)或上調(diào)的miRNAs，115個(gè)miRNAs減少或不表達(dá)的miRNAs和221個(gè)以相似水平表達(dá)的miRNAs。對(duì)從患有特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓(idiopathic pulmonary arterial hypertension, IPAH)的人類(lèi)受試者和對(duì)照組受試者的血漿中分離出的EXOs進(jìn)行了類(lèi)似的分析，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照受試者的血漿EXOs相比，有21個(gè)miRNAs在IPAH患者的血漿EXOs獨(dú)特表達(dá)或上調(diào)，其中有11個(gè)miRNAs在MCT-PH小鼠血漿EXOs中也獨(dú)特表達(dá)或上調(diào)[31]。

五、外泌體及其miRNA在PH發(fā)病中的作用

研究表明，細(xì)胞可以通過(guò)外泌體將miRNA分泌到體液中，外泌體miRNA在細(xì)胞與細(xì)胞之間建立聯(lián)系，并通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)各種重要的生理過(guò)程。越來(lái)越多的研究揭示了外泌體miRNA在PH發(fā)病中的關(guān)鍵作用。

PH患者的循環(huán)EV增加，且水平與肺血管阻力、功能障礙和死亡率相關(guān)。Belik等[32]比較了6例慢性血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓(chronic thromboembolic pulmonary hypertension, CTEPH)和年齡及性別匹配的肺栓塞患者和健康對(duì)照者血漿中微粒數(shù)量，結(jié)果顯示與健康和肺栓塞對(duì)照組相比，CTEPH患者內(nèi)皮糖蛋白(+)內(nèi)皮微粒的水平顯著增加，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)這些微粒有助于促進(jìn)人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的存活和血管生成，這可能代表著一種愈合機(jī)制，旨在抵消血管閉塞和內(nèi)皮損傷的影響。

Lee等[33]則首次報(bào)道了PH中外泌體miRNA轉(zhuǎn)移的研究，他們發(fā)現(xiàn)MSC-EXOs抑制血管重塑和低氧PH是通過(guò)在缺氧暴露的早期階段抑制STAT3激活，防止肺血管系統(tǒng)中促增殖miR-17超家族的低氧誘導(dǎo)并阻斷遠(yuǎn)端肺血管中的STAT3-miR-204-STAT3前饋環(huán)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

源自?xún)?nèi)皮細(xì)胞的外泌體可以將miR-143和miR-145傳遞至平滑肌細(xì)胞，從而影響其血管功能。在此基礎(chǔ)上，Deng等[34]也同樣證實(shí)來(lái)自肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的富含miR-143的外泌體可被肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)化并隨后調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管生成。這項(xiàng)研究還表明，miR-143在PH小鼠模型和PH患者的肺血管中被上調(diào)，小鼠中miR-143的基因缺失或miR-143的藥理抑制作用阻止了低氧誘導(dǎo)的PH的發(fā)生。因此，在體內(nèi)條件下，內(nèi)皮細(xì)胞和肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞之間通過(guò)富含miR-143的外泌體的交互作用可能參與了PH的發(fā)病機(jī)制。此后，另一研究表明miR-143/145是通過(guò)靶向ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1, ABCA1)促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，進(jìn)一步解釋了其分子發(fā)病機(jī)制[35]。

六、外泌體及其miRNA在PH治療中的作用

最近，已經(jīng)在PH中測(cè)試了從MSC培養(yǎng)基中分離的EV。MSC-EV減少了PH小鼠炎癥的循環(huán)標(biāo)志物，阻止了炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，并阻斷了肺血管重塑。此外，清除MSC-EV的培養(yǎng)基沒(méi)有這些作用，培養(yǎng)的小鼠肺成纖維細(xì)胞也不具有外泌體[33]。另一研究表明，MSC-EV同樣降低了PH大鼠的平均肺動(dòng)脈壓和血管重構(gòu)[36]。

在此基礎(chǔ)上，Aliotta等[31]發(fā)現(xiàn)從MCT-PH小鼠血漿或肺中分離出的EV中的EXOs而非MVs可誘導(dǎo)健康小鼠的右心室游離壁/左心室加室間隔比值和肺動(dòng)脈壁厚度/直徑比值增加，而從MSC分離出的EXOs可以預(yù)防MCT-PH的發(fā)展并逆轉(zhuǎn)已建立MCT-PH小鼠的肺動(dòng)脈高壓變化。這些發(fā)現(xiàn)表明，EXOs能夠介導(dǎo)右心室肥大和肺血管重塑的發(fā)生和逆轉(zhuǎn)，具體取決于它們的來(lái)源。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自MCT-PH小鼠和IPAH患者的EXOs含有更高水平的已知促進(jìn)PH的miRNAs，包括miRs-19b，-20a，-20b和-145。然而，用MSC-EXOs治療阻斷了PH的發(fā)展，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)是因?yàn)樗鼈兒懈咚降目寡?、抗增殖miRNAs，包括miRs-34a，-122，-124和-127。這一研究結(jié)果解釋了循環(huán)的或MSC-EXOs可能基于其miR載量而具有調(diào)節(jié)肺動(dòng)脈高壓作用。

研究表明，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cells, ASCs)同樣具有逆轉(zhuǎn)肺小動(dòng)脈重塑和右心室肥大的潛力。從ASCs中釋放的外泌體通過(guò)轉(zhuǎn)移特征性蛋白質(zhì)、mRNA和miRNA發(fā)揮治療作用。miR-191是PH受試者循環(huán)中上調(diào)的miRNA之一，也是ASCs-EXOs中代表性最高的miRNA之一。為了闡明ASCs介導(dǎo)的HPAEC保護(hù)性潛在機(jī)制，將ASCs-EXOs與經(jīng)吡咯野百合堿(monocrotaline pyrrole, MCTP)處理的人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行孵育。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-191 antagomir引起血管重構(gòu)的顯著逆轉(zhuǎn)以及與PH相關(guān)的介質(zhì)的下調(diào)，進(jìn)一步研究證實(shí)抑制miR-191可能通過(guò)阻止BMPR2降解來(lái)改善MCTP誘導(dǎo)的PH的發(fā)展。總之，這些結(jié)果表明ASCs-EXOs至少部分地通過(guò)miR-191影響人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，隨后可能影響脈管系統(tǒng)重塑的進(jìn)程[37]。

細(xì)胞可以通過(guò)外泌體將miRNA釋放到體液中，外泌體miRNA在細(xì)胞與細(xì)胞之間建立聯(lián)系，并通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)各種重要的生理過(guò)程。越來(lái)越多的研究揭示了外泌體miRNA在PH發(fā)病中的關(guān)鍵作用。盡管如此，外泌體及其miRNA在肺動(dòng)脈高壓中的研究仍處于初期階段，有很多問(wèn)題需要明確和解決。從診斷的角度來(lái)看，目前的研究方法難以對(duì)獲得的外泌體進(jìn)行有效的定性和定量，這會(huì)顯著影響下游分析的結(jié)果，使數(shù)據(jù)難以比較、重現(xiàn)以及對(duì)各分組間的結(jié)果進(jìn)行分析，因此需要進(jìn)一步優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)化外泌體的分離方法，以最小化因技術(shù)問(wèn)題帶來(lái)的純度和質(zhì)量偏差。從治療的角度來(lái)看，單個(gè)miRNA可以靶向多種mRNA，為了避免不利影響，需要對(duì)每種miRNA及其對(duì)不同信號(hào)通路的影響進(jìn)行深入分析。此外，尚不清楚且需要仔細(xì)研究miRNA模擬物和miRNA抑制劑對(duì)受體細(xì)胞產(chǎn)生潛在副作用的可能性，包括它們的長(zhǎng)期作用，因?yàn)樗鼈兛梢栽诮M織中持續(xù)存在數(shù)月，由此帶來(lái)的安全隱患絕對(duì)不能忽視。

綜上所述，未來(lái)的研究應(yīng)更深入地闡明外泌體及其miRNA在PH發(fā)病作用與機(jī)制，以便為開(kāi)發(fā)PH診斷和治療新方法提供更多的依據(jù)。