章俊亞, 陳吉祥

胰腺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的第5大病因,其5年生存率僅為7%[1-2]。胰腺癌患者早期缺乏特異性癥狀且進(jìn)展迅速,確診時(shí)往往已發(fā)生局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,失去手術(shù)切除機(jī)會(huì)[3-6]。據(jù)統(tǒng)計(jì),僅10%～20%的胰腺癌患者可接受手術(shù)治療,不接受手術(shù)治療的患者,平均生存時(shí)間為確診后3～6 個(gè)月[7]。此外,胰腺癌對(duì)化療藥物具有高度的抗性,化療效果不佳[8]。一些有創(chuàng)、侵入性的臨床輔助檢查,如內(nèi)鏡下逆行膽胰管造影(ERCP)、腹腔鏡超聲內(nèi)鏡等,有出現(xiàn)胰腺炎并發(fā)癥的可能[9]。因此,探索胰腺癌早期診斷的潛在標(biāo)志物以及治療靶點(diǎn),已成為胰腺癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。糖基抗原CA 19-9是迄今報(bào)道的胰腺癌敏感性最高的標(biāo)志物,但通常在胰腺癌的晚期出現(xiàn)異常升高,在肝癌、膽囊癌等其他腫瘤,風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,急慢性胰腺炎等也可出現(xiàn)升高趨勢[10]。

腫瘤的發(fā)生是由傳統(tǒng)基因遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)調(diào)控共同作用的結(jié)果。表觀遺傳學(xué)調(diào)控是在不發(fā)生原始DNA序列變化的前提下,在細(xì)胞分裂過程中對(duì)調(diào)控基因進(jìn)行修飾,使遺傳物質(zhì)改變并隨著細(xì)胞的增殖向下遺傳,進(jìn)而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制主要包括DNA甲基化、染色質(zhì)的組蛋白修飾(包括甲基化、乙酰化等)、基因印跡以及RNA干擾等。DNA 甲基化在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵性的作用,能夠使某些抑癌基因失活,從而促進(jìn)致癌的過程。先前研究證實(shí)在胰腺癌中,神經(jīng)元正五聚體蛋白Ⅱ(neuronal pentraxin Ⅱ,NPTX2)NPTX2基因的啟動(dòng)子區(qū)域CpG島發(fā)生異常高甲基化[11]。DNA甲基化可能是導(dǎo)致胰腺癌中NPTX2蛋白功能失活、表達(dá)沉默的機(jī)制之一。就此,本文對(duì)NPTX2 的 DNA 甲基化在胰腺癌中的最新研究進(jìn)展做一綜述。

1 NPTX2基因

NPTX2基因位于人類七號(hào)染色體(7q21.3-q22.1)，長度為11 kb，其編碼的神經(jīng)元正五聚體蛋白Ⅱ是一種神經(jīng)突觸蛋白，能夠參與興奮性突觸的形成，最初在帕金森病中被發(fā)現(xiàn)，廣泛存在于胰腺、肝臟、大腦、骨骼肌等組織[12-13]。NPTX2是神經(jīng)元正五聚蛋白家族(neuronal pentraxin，NPs)中的成員之一，該家族其他成員有神經(jīng)元正五聚體蛋白Ⅰ(neuronal pentraxin Ⅰ，NPTX1)、神經(jīng)元五聚蛋白受體(neuronal pentraxin receptor，NPTR)，NPTX2蛋白能夠和NPTX1、NPTXR結(jié)合形成異聚體[14]。NPTX2具備五聚體家族蛋白的特點(diǎn)：①由5個(gè)一致的非共價(jià)結(jié)合的亞基呈放射狀排布所形成的五聚體，其形成的過程不依賴Ca2+；②標(biāo)志性序列形式為H-X-C-X-S/T-W-X-S/T(X可代表各種氨基酸)；③依賴Ca2+和各種配體結(jié)合，在Ca2+存在環(huán)境下，可與太攀蛇毒素(一種高效的異木防己堿毒素，能夠阻斷突觸前的神經(jīng)-肌肉傳導(dǎo))和腔內(nèi)鈣結(jié)合蛋白TCBP49結(jié)合[15]。根據(jù)NPTX2這一生化特性，常將其作為該蛋白分離純化的一種有效方法。

NPTX2與人體多種疾病相關(guān)。例如,NPTX2蛋白在患有阿爾茲海默病的患者腦脊液中減少,且與患者認(rèn)知表現(xiàn)和海馬體積具有顯著相關(guān)性[16];NPTX2過度表達(dá)能夠減輕應(yīng)激誘導(dǎo)的焦慮行為,在焦慮癥治療中起著潛在的重要作用[17];NPTX2的表達(dá)下降可能參與了發(fā)作性睡病的發(fā)病機(jī)理[18];NPTX2還被發(fā)現(xiàn)參與了人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展[19]。近年來,諸多研究對(duì)NPTX2在胰腺癌方面的研究越來越多,為胰腺癌發(fā)病機(jī)制的探索提供了新的理論指導(dǎo)和方向。

2 DNA甲基化

DNA甲基化是最重要的表觀遺傳改變之一,在腫瘤的發(fā)展中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用,異常的DNA甲基化涉及啟動(dòng)子CpG島的CpG高甲基化狀態(tài),最終導(dǎo)致腫瘤抑制基因沉默或通過促進(jìn)基因組的不穩(wěn)定從而導(dǎo)致染色體的缺失[20]。DNA甲基化則是在 DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的催化下,胞嘧啶的第5位碳原子與S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基結(jié)合生成5′-甲基胞嘧啶的過程。在真核細(xì)胞中,DNA 甲基化大部分出現(xiàn)在 5′-GC-3′ 核苷酸即CpG上[21]。富含CpG 的DNA區(qū)域被稱為CpG島,CpG 一般位于基因的啟動(dòng)子區(qū)附近,長度為300～3 000 bp。在正常情況下,CpG 島以非甲基化形式存在,當(dāng)CpG 島發(fā)生異常甲基化(以過甲基化為主)時(shí),甲基化結(jié)合蛋白以及轉(zhuǎn)錄抑制物組蛋白乙?；傅冉Y(jié)合到CpG島,使轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合啟動(dòng)子的過程受阻,從而導(dǎo)致啟動(dòng)子區(qū)域下游基因的失活[22]。

DNA異常甲基化廣泛出現(xiàn)在各類腫瘤中,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。Chou等[23]發(fā)現(xiàn)抑癌基因ABCA1在卵巢癌細(xì)胞系中出現(xiàn)高甲基化,且與卵巢癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn),在肺癌組織中檢測到DBCCR1基因CpG島的高甲基化水平,致該基因的表達(dá)沉默,增強(qiáng)了癌細(xì)胞遷移、侵襲的能力,被認(rèn)為是早期肺癌的診斷指標(biāo)之一[24]。Chen等[25]研究表明,TMEFF2 基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化與子宮內(nèi)膜癌的早期發(fā)生相關(guān)。同樣,許多與胰腺癌發(fā)病有關(guān)的基因也出現(xiàn)啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化修飾,例如參與DNA 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的基因INSM2、調(diào)控細(xì)胞增殖的基因GAS6、與凋亡相關(guān)的基因IRF5等均發(fā)生了啟動(dòng)子區(qū)的異常甲基化,出現(xiàn)基因功能紊亂、表達(dá)抑制,進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤形成[26-28]。DNA甲基化改變通常發(fā)生于細(xì)胞癌變過程的早期階段,因此它能夠作為腫瘤發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素和早期診斷的分子標(biāo)志物,將甲基化檢測投入到高危人群的篩查,提高早期診斷的準(zhǔn)確性。

3 NPTX2的DNA甲基化與胰腺癌

2003年,Sato等[11]通過高通量微陣列技術(shù)的研究,發(fā)現(xiàn)NPTX2基因在胰腺癌組織中表達(dá)下降,同時(shí)其啟動(dòng)子區(qū)CpG島發(fā)生異常高甲基化,而正常胰腺組織細(xì)胞中很少出現(xiàn)甲基化,表明NPTX2基因的表達(dá)抑制可能參與了胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過程,且該基因表達(dá)抑制可能與DNA高甲基化相關(guān)。隨后,有關(guān)于胰腺癌中NPTX2的DNA異常甲基化的研究陸續(xù)地開展起來。2006年,Matsubayashi等[29]在胰腺癌的胰液中發(fā)現(xiàn)了一些高甲基化基因:NPTX2、Cyclin D2、FOXE1、p16、ppENK和TFPI2,其中NPTX2基因相比于其他基因檢測的敏感性更高。2007年,Park等[30]運(yùn)用超聲內(nèi)鏡結(jié)合胰管刷檢技術(shù)獲取了33例胰腺癌患者及22例良性胰膽病患者的細(xì)胞樣本,從中提取細(xì)胞基因組DNA,NPTX2基因的啟動(dòng)子區(qū)域 CpG島高甲基化序列經(jīng)過亞硫酸氫鹽處理修飾后,設(shè)計(jì)相應(yīng)引物與該序列互補(bǔ)配對(duì),通過定量甲基化特異PCR法(quantitative methylation-specific PCR, QMSP)進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)胰腺癌細(xì)胞中NPTX2甲基化明顯增高,認(rèn)為NPTX2高甲基化的定量分析將有望成為一種胰腺癌分子診斷標(biāo)志物。2012年,Park等[31]再次采集了169例患者的血液標(biāo)本進(jìn)行研究,其中包括104例胰腺癌患者,60例慢性胰腺炎患者,5例良性膽道結(jié)石病患者,并從每例患者的血漿中提取DNA,通過QMSP法檢測NPTX2基因CpG島高甲基情況。結(jié)果表明,相比于慢性胰腺炎組和良性膽道結(jié)石組,胰腺癌組NPTX2的高甲基化水平顯著增高。同時(shí),觀察比較了NPTX2高甲基化在胰腺癌各階段的表達(dá)倍數(shù)變化,發(fā)現(xiàn)隨著美國癌癥聯(lián)合會(huì)(American Joint Committee on Cancer,AJCC)TNM分期的進(jìn)展,該基因甲基化的水平隨之顯著升高,在胰腺癌進(jìn)展期尤為顯著。緊接著,Zhang等[32-33]證實(shí)了NPTX2在胰腺癌中的低表達(dá)與其啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化聯(lián)系緊密,并且指出NPTX2作為一種抑癌基因,能夠使細(xì)胞G0/G1期阻滯,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移。

篩選出一個(gè)有助于胰腺癌早期診斷的基因甲基化位點(diǎn),須滿足以下幾項(xiàng)基本條件[34-35]:①在胰腺癌細(xì)胞中,候選基因同時(shí)發(fā)生異常甲基化和異常表達(dá);②候選基因大部分在胰腺癌的早期發(fā)生異常甲基化;③在正常胰腺細(xì)胞中,候選基因能夠正常表達(dá),同時(shí)該基因啟動(dòng)子區(qū)處在低甲基化或者非甲基化的狀態(tài)。與此同時(shí),基因的異常甲基化易于在臨床常規(guī)檢查樣本中(如血尿糞、細(xì)胞組織活檢標(biāo)本等)檢測出來,這也是候選基因篩選的一項(xiàng)必要條件[36]。NPTX2的CpG區(qū)高甲基化有望成為早期胰腺癌初篩的分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。目前,甲基化檢測實(shí)驗(yàn)得到了臨床試驗(yàn)的評(píng)估,主要通過甲基化特異PCR法對(duì)有家族病史的胰腺癌患者的胰液進(jìn)行檢測,但該實(shí)驗(yàn)的敏感性和準(zhǔn)確性未經(jīng)證實(shí)。所以,對(duì)于NPTX2基因的甲基化檢測的敏感性及特異性,有待技術(shù)的改進(jìn),做進(jìn)一步的研究考證。

針對(duì)DNA甲基化是一種發(fā)生在腫瘤早期、多發(fā)及可逆的遺傳表觀學(xué)改變,先前Sato等[11]通過一種甲基化酶抑制劑5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-Aza-dC),又名地西他濱,處理了3種胰腺癌細(xì)胞系(AsPC1、PanC1、MiaPaCa2),隨后發(fā)現(xiàn)NPTX2基因的表達(dá)明顯增高?？梢?抑制甲基化的過程可在某種程度上恢復(fù)抑癌基因NPTX2的表達(dá)活性,這也為早期胰腺癌的分子靶向治療提供了新的思路。

4 結(jié)論和展望

綜上,NPTX2作為一種胰腺癌的抑癌基因,該基因的表達(dá)異常可能與異常DNA甲基化有關(guān)。廣泛研究發(fā)現(xiàn),DNA高甲基化抑制了NPTX2基因的表達(dá),促進(jìn)了胰腺癌的發(fā)生發(fā)展。同時(shí),DNA異常甲基化被證實(shí)是一種可逆的表觀遺傳改變,能夠通過抑制甲基化的過程來激活被沉默的抑癌基因。對(duì)于NPTX2基因DNA異常甲基化的研究,將會(huì)為胰腺癌的早期診斷、靶向治療以及預(yù)防提供新的研究領(lǐng)域。目前,盡管證實(shí)了NPTX2基因異常甲基化參與胰腺癌發(fā)病進(jìn)展,但是該基因在胰腺癌中所調(diào)控的通路仍不得而知,需要通過基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡明其在致癌過程中確切的分子機(jī)制。同時(shí),其甲基化檢測在臨床中的應(yīng)用還有待于進(jìn)一步證實(shí)。因此,有必要對(duì)NPTX2基因的DNA異常甲基化在胰腺癌中的調(diào)控機(jī)制做更為深入的研究。