曹軻，陳正庭 綜述，常莉，李文輝 審校

650118昆明，昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院/云南省腫瘤醫(yī)院 放射治療中心(曹軻、陳正庭、常莉、李文輝)，云南省肺癌研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(曹軻、陳正庭)

細(xì)胞游離DNA(cell-free DNA，cfDNA)于1948年被首次報(bào)道[1]，是血液中雙鏈DNA的組成部分之一，并可從血漿中分離出來(lái)[2]。肺癌作為最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率居癌癥之首，其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占所有肺癌分型的85%。研究表明，與健康對(duì)照組或良性疾病組相比，NSCLC患者血漿中的cfDNA水平較高[3]，且cfDNA高水平患者具有更短的無(wú)進(jìn)展生存期(progress free survival，PFS)和總生存期(overall survival，OS)[4]。所以，分析患者血漿中cfDNA或許對(duì)NSCLC患者的早期臨床診斷、基因突變檢測(cè)以及預(yù)后的預(yù)測(cè)、耐藥性監(jiān)測(cè)等方面有著重要價(jià)值，并有望成為重要的液體生物標(biāo)志物和指導(dǎo)NSCLC精準(zhǔn)治療模式中的新方法。為此，本文就cfDNA在非小細(xì)胞肺癌研究中的最新進(jìn)展情況作一綜述。

1 cfDNA

目前認(rèn)為，cfDNA通過(guò)細(xì)胞凋亡或壞死釋放到血液中，通常是長(zhǎng)度為150～200個(gè)堿基對(duì)的雙鏈片段[1]。研究發(fā)現(xiàn)，在健康人血漿中，正常細(xì)胞cfDNA濃度約為30μg/L，而腫瘤患者則為180μg/L，且血漿中cfDNA分子會(huì)被迅速清除，其半衰期為30分鐘至2小時(shí)[5]。早在1977年，Leon等[6]就發(fā)現(xiàn)癌癥患者cfDNA總體水平高于未患癌人群，而在癌癥患者中，從腫瘤細(xì)胞釋放的cfDNA通常被稱為循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)，但其僅構(gòu)成整個(gè)cfDNA的一部分，且癌癥患者整個(gè)cfDNA中ctDNA所占比例差異巨大，根據(jù)腫瘤大小、定位和血管分布，從少于 0.1%至多于90%之間變化[7-8]。雖然個(gè)體患者的ctDNA所占比例往往與腫瘤負(fù)荷平行，但在患相同類型癌癥的不同患者之間，已觀察到顯著的變異，這可能反映了個(gè)體腫瘤的生物學(xué)差異或細(xì)胞死亡率差異。此外，不同類型癌癥的患者在可檢出的ctDNA頻率方面也有顯著變異。故如何在正常種系cfDNA背景中檢測(cè)和分析ctDNA仍是一大難題。

2 cfDNA的檢測(cè)和分析

由于來(lái)自腫瘤的cfDNA含量低、半衰期短，且不同癌癥患者之間個(gè)體差異大，故需要超靈敏的方法來(lái)檢測(cè)血漿cfDNA中以極低頻率存在的變異體-等位基因突變、拷貝數(shù)變化以及其他改變。如今已有多種方法可以檢測(cè)血漿cfDNA中的基因突變情況，包括測(cè)序法、熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)、擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)(amplification refractory mutation system，ARMS)、突變富集PCR、變性高效液相色譜法以及數(shù)字PCR。近年來(lái)，在數(shù)字PCR基礎(chǔ)之上又衍生出如微滴數(shù)字PCR技術(shù)(droplet digital PCR, ddPCR)和微乳滴磁珠PCR以及微數(shù)字PCR[9]，ddPCR技術(shù)甚至可以識(shí)別和定量cfDNA中以≤0.001%的等位基因頻率存在的變化[10]。然而，這些方法的靈敏度和特異度受到DNA聚合酶錯(cuò)誤率和測(cè)序反應(yīng)的限制。新一代測(cè)序(next-generation sequencing，NGS)方法針對(duì)cfDNA進(jìn)行了定制，多項(xiàng)研究表明，NGS結(jié)合了深度測(cè)序覆蓋、分子條形碼方法和錯(cuò)誤抑制算法的改良方法改進(jìn)了檢測(cè)限，其范圍包括從全基因組或全外顯子組測(cè)序到有限基因組的靶向測(cè)序，大大提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性和敏感性[11-15]。

3 cfDNA在NSCLC中的應(yīng)用

腫瘤組織的病理診斷及相關(guān)分子檢測(cè)一直是臨床醫(yī)師診斷和治療的金標(biāo)準(zhǔn)。在未接受活檢的NSCLC患者中，涉及血漿cfDNA的液體活檢技術(shù)是分析臨床相關(guān)遺傳改變的重要材料來(lái)源之一。雖然諸如循環(huán)腫瘤細(xì)胞、外泌體以及RNA亦可作為液體活檢的檢測(cè)對(duì)象，但對(duì)于攜帶基因突變的許多NSCLC患者而言，血漿cfDNA的液體活檢技術(shù)才是最合適的選擇，甚至優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)腫瘤標(biāo)志物，例如CEA和CA12-5、CA15-3、CA19-9[13,16-18]。因此，筆者將從以下幾個(gè)方面對(duì)cfDNA在NSCLC中的應(yīng)用進(jìn)行相關(guān)闡述。

3.1 cfDNA用于NSCLC患者早期臨床診斷

早期發(fā)現(xiàn)和早期治療是提高癌癥患者生存率的關(guān)鍵，與晚期癌癥患者相比，沒有影像學(xué)轉(zhuǎn)移性病變的患者預(yù)后更佳。Szpechcinski等[19]利用PCR方法檢測(cè)NSCLC患者(I期44%，II期40%，IIIA期16%)、慢性呼吸系統(tǒng)疾病患者以及健康志愿者，發(fā)現(xiàn)NSCLC患者的血漿cfDNA濃度水平顯著高于慢性呼吸系統(tǒng)疾病患者和健康個(gè)體，同時(shí)在區(qū)分NSCLC患者與健康個(gè)體時(shí)，其靈敏度和特異度分別為90%和80.5%。Newman等[12]利用一種超靈敏的量化ctDNA方法(CAPP-Seq)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，即使當(dāng)cfDNA含量達(dá)到0.02%的檢測(cè)限時(shí)，仍然在100%的II～I(xiàn)V期NSCLC患者和50%的I期患者中檢測(cè)到cfDNA，且突變基因部分的特異性為96%。國(guó)內(nèi)的一項(xiàng)研究結(jié)論也得出血漿cfDNA可作為NSCLC早期診斷和臨床分期的有效工具[20]。雖然目前已有多項(xiàng)研究表明血漿cfDNA在NSCLC患者早期臨床診斷中的作用，但大部分為小樣本研究，仍缺乏關(guān)于早期NSCLC患者血漿cfDNA檢測(cè)的大規(guī)模研究，這可能與確診的早期NSCLC患者較少?gòu)亩占嚓P(guān)數(shù)據(jù)困難有關(guān)。同時(shí)有研究也提出了質(zhì)疑，例如一項(xiàng)前瞻性研究顯示血漿cfDNA對(duì)早期NSCLC患者檢測(cè)的特異性高但敏感性低，該研究招募了288名NSCLC患者，并使用NGS作為I～I(xiàn)V期NSCLC患者ctDNA中表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)突變的檢測(cè)方法，結(jié)果顯示外顯子19缺失的診斷敏感性和特異性分別為50.9%和98%，并且對(duì)于L858R突變?yōu)?1.9%和94.1%，所有病例的整體敏感度為54.4%，IIIB～I(xiàn)V期為72.7%，但I(xiàn)A～I(xiàn)IIA期為22.2%[21]。以上研究顯示出血漿cfDNA在NSCLC早期臨床診斷領(lǐng)域仍存在一定爭(zhēng)議，需要進(jìn)一步的研究來(lái)確立其效用，但不可否認(rèn)的是血漿cfDNA檢測(cè)為早期腫瘤的微創(chuàng)檢測(cè)提供了廣泛適用的方法，并為NSCLC患者的早期篩查和臨床診斷提供了一定的依據(jù)。

3.2 cfDNA用于NSCLC基因檢測(cè)及預(yù)后預(yù)測(cè)

3.2.1 EGFR EGFR是一種屬于酪氨酸激酶ErbB家族的跨膜蛋白受體，編碼基因位于第7號(hào)染色體短臂，由酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的突變導(dǎo)致信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活，從而引發(fā)細(xì)胞增殖和抗凋亡[22-23]。在NSCLC中最主要的驅(qū)動(dòng)基因就是EGFR，既往數(shù)據(jù)表明，EGFR基因突變率在白種人患者中約10%～15%，而在亞洲人患者中卻高達(dá)40%[24]，其主要發(fā)生在18號(hào)-21號(hào)外顯子內(nèi)，最常見的是19號(hào)外顯子缺失和21號(hào)外顯子L858R堿基替換[25]。以上這些外顯子的突變賦予酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKIs)的敏感性，并顯示出其與藥物高反應(yīng)率(>70%)和PFS相關(guān)[26-28]。一項(xiàng)研究報(bào)道了血漿cfDNA中EGFR基因突變的存在與EGFR-TKIs的反應(yīng)之間有顯著相關(guān)性，并且在血漿和腫瘤組織同時(shí)發(fā)現(xiàn)L858R突變的患者與僅在組織中發(fā)現(xiàn)L858R突變的患者相比，前者的OS較短[29]。

迄今為止，已經(jīng)開發(fā)出了三代EGFR-TKIs，雖然其顯示出較好的早期臨床獲益，然而患者由于耐藥性的產(chǎn)生導(dǎo)致最終復(fù)發(fā)。國(guó)內(nèi)最近的一項(xiàng)研究利用ARMS法檢測(cè)血液cfDNA中EGFR基因突變并監(jiān)測(cè)耐藥基因T790M的變化，同時(shí)評(píng)估TKI在靶向治療患者中的預(yù)后價(jià)值，其結(jié)果顯示血液cfDNA和腫瘤組織樣本活檢在EGFR突變檢測(cè)上的總體一致率為68.2%，結(jié)論提示應(yīng)用ARMS法檢測(cè)血液cfDNA的EGFR基因突變是一種特異性高、敏感好的檢測(cè)方法，適用于晚期NSCLC患者治療前的EGFR基因突變狀態(tài)檢測(cè)，同時(shí)適用于監(jiān)測(cè)靶向治療后T790M耐藥突變狀態(tài)和預(yù)測(cè)患者預(yù)后[30]。由此可見，血漿cfDNA檢測(cè)與組織活檢在確定EGFR基因突變方面存在具有高度一致性，雖然腫瘤組織的活檢傳統(tǒng)上對(duì)于組織學(xué)鑒別原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性肺腫瘤，以及確定相關(guān)EGFR基因突變的存在是必不可少的，且腫瘤組織中的基因檢測(cè)仍是這些應(yīng)用的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，約25%的NSCLC患者為晚期疾病，由于取材困難等問(wèn)題，腫瘤活檢不足以實(shí)現(xiàn)全面的基因檢測(cè)，為了能使EGFR-TKIs更好地應(yīng)用于EGFR基因突變的NSCLC患者，血漿cfDNA液體活檢技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)能夠在血漿中進(jìn)行檢測(cè)，這樣對(duì)于晚期NSCLC患者來(lái)說(shuō)，其可作為組織活檢的替代檢測(cè)方式。

一些研究利用血漿cfDNA評(píng)估了EGFR基因突變的NSCLC患者接受EGFR-TKIs治療后的臨床效用，發(fā)現(xiàn)血漿cfDNA中的突變狀態(tài)與PFS或OS之間存在顯著相關(guān)性，其結(jié)果都顯示出NSCLC患者在接受靶向治療后OS或PFS呈上升趨勢(shì)[31-33]。這些研究都提示血漿中cfDNA濃度水平在評(píng)估NSCLC患者在接受靶向治療后的預(yù)后上具有極大價(jià)值，并能夠反映NSCLC患者潛在的腫瘤負(fù)荷情況，因?yàn)槟[瘤負(fù)荷較高的NSCLC患者可能有更密集的cfDNA釋放到血液中，所以其濃度水平可以通過(guò)治療引起的腫瘤細(xì)胞死亡來(lái)調(diào)節(jié)，在NSCLC患者接受靶向治療后出現(xiàn)短暫性上升，而隨著腫瘤的退縮迅速下降。因此，cfDNA可以作為監(jiān)測(cè)腫瘤負(fù)荷的替代指標(biāo)，并使其成為評(píng)估NSCLC患者的寶貴預(yù)后因素。

3.2.2 Kristen鼠肉瘤病毒原癌基因同源體(Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS) KRAS基因是RAS家族的一個(gè)原癌基因。在NSCLC的不同組織病理學(xué)類型中，尤其是肺腺癌中，KRAS基因突變率在東西方人種中差異較大;該基因突變是西方人種最常見的突變基因，突變率接近30%，但在亞洲人群中突變率僅為5%[34]。研究發(fā)現(xiàn)，KRAS基因編碼的蛋白主要位于EGFR信號(hào)途徑的下游，該突變可導(dǎo)致MAPK信號(hào)通路持續(xù)激活, 從而加速腫瘤細(xì)胞的增殖。KRAS基因突變最常發(fā)生在2號(hào)外顯子的第12位和第13位密碼子[35]。迄今為止, 針對(duì)KRAS突變的靶向藥物研發(fā)工作仍在艱難進(jìn)行中，尚無(wú)臨床廣泛應(yīng)用的靶向藥物。盡管有研究報(bào)道針對(duì)TP53和KRAS突變的免疫療法已顯示出一定的前景[36]，但目前對(duì)于攜帶KRAS基因突變的NSCLC患者，化療才是一線選擇。

傳統(tǒng)上，在NSCLC患者的活組織檢查中檢測(cè)到KRAS基因突變與預(yù)后不良有關(guān)。然而，血漿cfDNA作為預(yù)后標(biāo)志物在評(píng)估KRAS基因突變的NSCLC患者的價(jià)值仍值得進(jìn)一步探討。Nygaard等[37]利用血漿cfDNA對(duì)可接受化療的246例晚期NSCLC患者進(jìn)行至少1個(gè)周期(最多6個(gè)周期)的最小劑量化療后評(píng)價(jià)預(yù)后，發(fā)現(xiàn)17.5%血漿KRAS基因突變患者(治療前檢測(cè))，其OS和PFS較野生型KRAS基因突變的患者明顯縮短，化療對(duì)于血漿KRAS基因突變組的有效率也明顯低于野生型KRAS基因突變組；并且，同一研究組的另一項(xiàng)前瞻性研究納入了69例晚期NSCLC患者，并分析這些患者在治療期間血漿cfDNA與KRAS基因突變的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)患者血漿cfDNA濃度高于基線水平時(shí)提示預(yù)后不良，同時(shí)在治療過(guò)程中若血漿cfDNA水平發(fā)生變化，疾病進(jìn)展顯著增加[38]。這些研究都表明血漿cfDNA中檢測(cè)到KRAS基因突變的存在可能是預(yù)后不良的標(biāo)志?？闪硪豁?xiàng)Meta分析結(jié)果卻提示血漿cfDNA中檢測(cè)到KRAS基因突變可能不是NSCLC患者生存的預(yù)后因素[39]。一種原因可能是，在發(fā)生KRAS基因突變的NSCLC患者中，血漿cfDNA作為預(yù)后和預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物的真正價(jià)值被高估了，另一個(gè)原因可能是利用血漿cfDNA檢測(cè)KRAS基因突變用于預(yù)測(cè)NSCLC患者預(yù)后的研究較少。雖然作為生物標(biāo)志物的cfDNA在血漿中檢測(cè)到KRAS基因突變的預(yù)后和預(yù)測(cè)價(jià)值仍存在爭(zhēng)議，但其體現(xiàn)的作用卻不可忽視，所以仍需要樣本數(shù)更多的前瞻性研究得出明確的結(jié)論。

3.2.3 間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK) ALK是一種跨膜受體酪氨酸激酶，在正常情況下，ALK受體可與配體結(jié)合引起ALK二聚化和下游激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響下游信號(hào)通路，包括RAS/MEK/ERK通路和PI3K/Akt/mTOR通路，從而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖[40-41]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，大約3%～5%NSCLC中會(huì)出現(xiàn)ALK基因重排[42]。Soda等[43]于2007年通過(guò)蛋白組學(xué)技術(shù)在肺腺癌腫瘤組織中首次發(fā)現(xiàn)ALK融合基因，即ALK與棘皮動(dòng)物微管蛋白4(echinoderm microtubule-associated protein like 4, EML4) 形成EML4-ALK融合基因，其產(chǎn)生的融合蛋白可引起ALK的胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域發(fā)生二聚化，激活經(jīng)典的ALK下游信號(hào)通路導(dǎo)致細(xì)胞增殖與凋亡失控。

雖然傳統(tǒng)的化療方案對(duì)ALK陽(yáng)性 NSCLC患者療效并不理想，但針對(duì)ALK陽(yáng)性的靶向藥物間變性淋巴瘤激酶酪氨酸激酶抑制劑(ALK-tyrosine kinase inhibitor,ALK-TKIs)不僅提升了臨床療效，同時(shí)極大程度修改了對(duì)于ALK陽(yáng)性NSCLC患者的臨床用藥指南，成為世界范圍內(nèi)公認(rèn)的一線治療手段。在當(dāng)前的臨床實(shí)踐中，有4種不同方法來(lái)檢測(cè)ALK融合基因的表達(dá)，分別是熒光原位雜交、免疫組織化學(xué)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以及NGS。雖然腫瘤組織仍然是首選材料，但有部分研究也證明血漿cfDNA NGS檢測(cè)提供了一種非侵入性的方法來(lái)檢測(cè)ALK基因重排和ALK融合基因，同時(shí)其具有良好的靈敏度和優(yōu)異的特異性，不僅可以檢測(cè)新診斷的ALK陽(yáng)性 NSCLC患者的靶向改變，對(duì)于已遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的NSCLC患者也具有意義[44-46]。如上所述，多項(xiàng)研究都表明血漿cfDNA可作為檢測(cè)ALK基因重排以及ALK融合基因的實(shí)用性方法，為獲取腫瘤組織困難的患者提供可靠和連續(xù)的檢測(cè)方式，這也間接地說(shuō)明了當(dāng)NSCLC患者檢測(cè)出ALK基因重排或ALK融合基因時(shí)，能夠盡早選擇并使用ALK-TKIs來(lái)延緩疾病的進(jìn)展，而當(dāng)ALK陽(yáng)性的NSCLC患者出現(xiàn)ALK耐藥突變體時(shí)，cfDNA也具備及時(shí)檢測(cè)出新發(fā)耐藥機(jī)制的能力，特別是對(duì)于疾病進(jìn)展迅速或出現(xiàn)ALK耐藥突變體的NSCLC患者，每一代ALK-TKIs針對(duì)的耐藥突變體不同，選擇合適及正確的ALK-TKIs不僅可以減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，還可以精確有效治療這類患者。

ALK陽(yáng)性的NSCLC患者在接受ALK-TKIs治療后，不僅療效顯著，并且患者預(yù)后和生存率也得到大幅度改善[47]。國(guó)內(nèi)最近的一項(xiàng)回顧性分析納入了174例克唑替尼治療的攜帶ALK基因重排并已有腦轉(zhuǎn)移的NSCLC患者，結(jié)果顯示即使這類患者也可以從克唑替尼中獲得生存方面的益處[48]。如前所述，血漿cfDNA新一代測(cè)序(next-generation sequencing，NGS)檢測(cè)存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的NSCLC患者，并且具有高敏感性和高特異性的特點(diǎn)，這也提示血漿cfDNA在檢測(cè)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移伴ALK基因重排或ALK融合基因的NSCLC患者方面具有獨(dú)特的作用，因?yàn)槟X轉(zhuǎn)移或肝轉(zhuǎn)移的NSCLC患者預(yù)后較差且遠(yuǎn)期生存率較低，所以盡早發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的NSCLC患者是否存在ALK基因重排或ALK融合基因，并及時(shí)選擇正確的ALK-TKIs具有十分重要的意義。雖然關(guān)于血漿cfDNA檢測(cè)在評(píng)估EGFR或KRAS基因突變的NSCLC患者預(yù)后的研究很多，可目前對(duì)于ALK基因重排或ALK融合基因的NSCLC患者，利用血漿cfDNA評(píng)估其接受ALK-TKIs治療后臨床效用的研究卻十分缺乏。這也提示，對(duì)于ALK陽(yáng)性的NSCLC患者，雖然血漿cfDNA在評(píng)估其預(yù)后方面具有一定的前景，但仍需要大量研究來(lái)證明其效用才可以得出明確的結(jié)論。

3.3 cfDNA用于NSCLC中耐藥性監(jiān)測(cè)

3.3.1 EGFR-TKIs獲得性耐藥監(jiān)測(cè) 如前所述，EGFR-TKIs對(duì)于EGFR基因突變的NSCLC患者來(lái)說(shuō)占據(jù)重要地位。與單純接受化療或放化療聯(lián)合的患者相比，放化療聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)一線EGFR-TKIs(如吉非替尼，厄洛替尼或阿法替尼)治療的EGFR基因突變患者客觀緩解率(objective response rate，ORR)、PFS和生活質(zhì)量均明顯更好[27,49-51]。然而不幸的是，大多數(shù)患者都存在不可避免的獲得性耐藥，而T790M次級(jí)突變是最常見的耐藥機(jī)制，占近60%的病例[52-53]。在這種情況下，相比于手術(shù)活檢，使用血漿cfDNA的液體活檢優(yōu)勢(shì)在于可以進(jìn)行頻繁采樣，當(dāng)使用EGFR-TKIs治療EGFR基因突變的NSCLC患者時(shí)，cfDNA在血漿中減少甚至消失，且這種情況與T790M次級(jí)突變一起再次出現(xiàn)。因此，對(duì)于發(fā)生T790M次級(jí)突變的NSCLC患者來(lái)說(shuō)，組織活檢往往可行性差，而血漿cfDNA的液體活檢技術(shù)在EGFR-TKIs的治療背景下顯得十分重要，目前正用作手術(shù)活檢的替代方法，一些研究也已經(jīng)證明，血漿cfDNA中檢測(cè)到T790M次級(jí)突變的NSCLC患者，可選擇第三代EGFR-TKIs進(jìn)行治療[54-56]。

第三代EGFR-TKIs(奧希替尼)可以與T790M受體結(jié)合，目前已被批準(zhǔn)用于治療進(jìn)展為EGFR-TKIs耐藥并攜帶T790M次級(jí)突變的NSCLC患者[57]，是針對(duì)T790M次級(jí)突變的高選擇性且不可逆性的藥物。臨床研究結(jié)果顯示，該藥對(duì)發(fā)生T790M次級(jí)突變的NSCLC患者療效顯著，反應(yīng)率為55%，PFS中位數(shù)為9.6～13.1個(gè)月[58-59]。但使用第三代EGFR-TKIs仍然導(dǎo)致了新的抵抗機(jī)制，Thress等[60]研究報(bào)道，EGFR基因突變的NSCLC患者通過(guò)C797S突變的機(jī)制從而發(fā)生了奧西替尼抗性，其對(duì)來(lái)自7名發(fā)生奧西替尼抗性的NSCLC患者，利用ctDNA進(jìn)行NGS檢測(cè)，其中一例患者表現(xiàn)出C797S突變，而連續(xù)收集的15例攜帶T790M次級(jí)突變并接受AZD9291處理的NSCLC患者，利用ctDNA進(jìn)行ddPCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)奧西替尼抗性的3種分子亞型，其中6例攜帶C797S突變，5例有T790M次級(jí)突變而沒有C797S突變，4例僅發(fā)現(xiàn)EGFR基因突變。c-MET擴(kuò)增或過(guò)表達(dá)是另一種可導(dǎo)致EGFR-TKIs治療失敗的獲得性耐藥機(jī)制，約占病例的5%～20%，其可以激化下游信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、遷移和血管生成[61]。目前關(guān)于抗MET單克隆抗體和MET-TKIs的療效正在非T790M患者的臨床試驗(yàn)中進(jìn)行[62]。其他耐藥機(jī)制還包括ERBB2擴(kuò)增(12%～13%的病例)，PIK3CA突變(約5%)，BRAF突變(1%)和組織學(xué)轉(zhuǎn)化[63]。因此，對(duì)于發(fā)生獲得性耐藥性機(jī)制的NSCLC患者，血漿cfDNA的液體活體技術(shù)可以利用頻繁取樣的優(yōu)勢(shì)使其成為個(gè)體化醫(yī)療中最重要的應(yīng)用，并能讓臨床醫(yī)生采用更有效的替代治療策略。

3.3.2 ALK-TKIs獲得性耐藥監(jiān)測(cè)

雖然ALK-TKIs的療效取得了矚目進(jìn)展，ALK陽(yáng)性患者最初對(duì)ALK-TKIs反應(yīng)良好，但獲得性耐藥依舊不可避免，絕大多數(shù)患者會(huì)在幾年內(nèi)出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥，而其耐藥機(jī)制主要包括：1)ALK繼發(fā)性耐藥突變(激酶域的點(diǎn)突變和ALK融合基因拷貝數(shù)目的擴(kuò)增)；2)旁路信號(hào)通路活化；3)繼發(fā)性自噬；4)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。在ALK-TKIs獲得性耐藥中最常見的為L(zhǎng)1196M，其次為G1269A、C1156Y、G1202R、I1171T、S1206Y、E1210K等[64]。第一代ALK-TKIs克唑替尼對(duì)于ALK陽(yáng)性的晚期NSCLC亞裔患者，在PFS和客觀緩解率ORR方面都具有顯著療效[65]。第二代ALK-TKIs(色瑞替尼和阿雷替尼)雖然對(duì)克唑替尼耐藥性敏感，但耐藥譜卻各不相同，例如色瑞替尼對(duì)存在L1196M、G1269A、I1171T和S1206Y耐藥突變的細(xì)胞有明顯抑制作用，但對(duì)G1202R和F1174C耐藥性突變無(wú)效，而阿雷替尼能夠克服L1196M、C1156Y和F1174L等耐藥相關(guān)的突變從而產(chǎn)生療效[66]。第三代ALK-TKIs勞拉替尼則克服了目前已知的多種ALK耐藥突變體，是唯一強(qiáng)效抑制包括G1202R在內(nèi)的所有ALK二次突變ALK-TKIs，對(duì)于使用過(guò)多線ALK-TKIs治療后仍復(fù)發(fā)的患者而言，其對(duì)復(fù)合型突變也有效，且具有較好的PFS和ORR[67-68]。但目前也有研究表明在接受勞拉替尼治療后復(fù)發(fā)的患者中檢測(cè)到了L1198F突變[69]。如上所述，盡管獲得了最初的臨床益處，但大部分患者最終仍因不同的耐藥機(jī)制而復(fù)發(fā)。Bordi等[70]分析了20例ALK陽(yáng)性的晚期NSCLC患者，在4/20(25%)患者的血漿cfDNA中檢測(cè)到ALK耐藥性突變，在1例中觀察到伴隨的L1196M和G1269A，表明獲得性抗性機(jī)制的異質(zhì)性；此外，在10/20(50%)病例中檢測(cè)到KRAS突變，其中3例中出現(xiàn)了ALK基因突變。由此可表明，血漿cfDNA在檢測(cè)ALK基因突變的新發(fā)耐藥機(jī)制以及可能的旁路途徑方面有著高靈敏度和高特異性的特點(diǎn)，其對(duì)ALK陽(yáng)性NSCLC患者具有重要指導(dǎo)意義。

在NSCLC的眾多治療手段中，特別對(duì)于發(fā)生基因突變的NSCLC患者，靶向治療起著十分重要的作用，而血漿cfDNA的液體活檢技術(shù)不僅可以檢測(cè)NSCLC患者的基因突變，同時(shí)還能識(shí)別獲得性耐藥的新發(fā)遺傳改變，進(jìn)而采用適合的TKI進(jìn)行治療，更好地指導(dǎo)臨床用藥，這極大程度上提高了臨床治療效率，并且其在患者的早期診斷、預(yù)測(cè)患者預(yù)后方面也展現(xiàn)出極高的價(jià)值，為NSCLC靶向治療計(jì)劃提供了新的依據(jù)和參考。

4 總結(jié)與展望

在NSCLC的發(fā)展過(guò)程中，特別是晚期NSCLC，相比于組織活檢或標(biāo)準(zhǔn)腫瘤標(biāo)志物，血漿cfDNA的液體活檢技術(shù)能夠便捷并有效地監(jiān)測(cè)患者的疾病進(jìn)展情況，從而選擇更有針對(duì)性的治療方案。盡早確定NSCLC患者的分子分型是選擇并接受靶向制劑的必要條件，然而目前的基因突變分析往往基于腫瘤組織，并有許多局限性，因?yàn)榇蠖鄶?shù)NSCLC患者確診時(shí)已為晚期，由于取材等問(wèn)題，不適合通過(guò)侵入性手術(shù)或活檢提供組織，而血漿cfDNA的液體活檢技術(shù)由于其微創(chuàng)性的性質(zhì)，是十分有前途的來(lái)源并作為基因突變分析的檢測(cè)工具。同時(shí)，隨著免疫治療在NSCLC中發(fā)揮作用的研究被證實(shí)，多項(xiàng)研究也顯示出血漿cfDNA監(jiān)測(cè)可作為免疫治療反應(yīng)的早期指標(biāo)，并可用于監(jiān)測(cè)癌癥患者對(duì)免疫療法的反應(yīng)[71-72]，最新的一項(xiàng)研究利用血漿cfDNA實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)晚期NSCLC患者服用納武單抗有效性，其結(jié)果表明血漿cfDNA在免疫治療抗性的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)中可能具有潛在作用[73]。綜上所述，血漿cfDNA的液體活檢技術(shù)在NSCLC的早期臨床診斷、基因突變檢測(cè)以及預(yù)后的預(yù)測(cè)、耐藥性監(jiān)測(cè)等方面均有著重要的應(yīng)用價(jià)值，且在免疫治療中的早期反應(yīng)監(jiān)測(cè)以及藥物抗性監(jiān)測(cè)等方面也逐漸發(fā)揮出相應(yīng)作用，有望成為指導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌精準(zhǔn)治療模式中的新方法。

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