饒子亮 鄭佳琳 黃 威 王 弋 潘詩云 黃綺玲 鄺少松

(1. 廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，佛山 528248)(2. 北京萬特爾生物制藥有限公司，北京 100000)

銅綠假單胞菌注射液(Pseudomonasaeruginosa-mannosesensitive hemagglutinin，PA-MSHA)是一種細(xì)菌類生物制劑，是以自然界中的銅綠假單胞菌為載體，通過基因工程技術(shù)表達(dá)出周身密布甘露糖敏感性血凝素菌毛的滅活疫苗(圖1)。在臨床上用于多種惡性腫瘤的輔助治療，能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、激活人體免疫反應(yīng)，預(yù)防腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移[1-2]。銅綠假單胞菌注射液作為腫瘤輔助治療藥物，目前聯(lián)合化療的協(xié)同效果缺乏實(shí)驗(yàn)研究。本研究選取了H22小鼠移植瘤，驗(yàn)證銅綠假單胞菌注射液聯(lián)合順鉑或阿霉素化療的輔助作用，為未來相關(guān)領(lǐng)域的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與飼養(yǎng)條件

SPF級BALB/c小鼠55只，雄性，體質(zhì)量14.5～16.9 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：[SCXK(粵)2013-0002]，合格證號：0103987。

小鼠飼養(yǎng)在廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF級實(shí)驗(yàn)動物室IVC系統(tǒng)內(nèi)，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK(粵)2013-0002，室內(nèi)保持20～26 ℃，濕度40%～70%，采用10 h∶14 h晝夜間斷照明，自由飲水、進(jìn)食，水料充足，SPF級飼料產(chǎn)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審查通過。

1.2 細(xì)胞

H22細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫。

1.3 主要試劑和儀器

主要儀器：倒置顯微鏡，日本奧林巴斯公司，型號：CKX41；超凈工作臺，蘇州凈化有限公司，型號：SW-CJ-2FD；恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司，型號：HWS-28；低速大容量離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠，型號：TDL-5-A。

主要試劑：銅綠假單胞菌注射液，由北京萬特爾生物制藥有限公司提供；RPMI1640培養(yǎng)基，GIBCO公司生產(chǎn)；新牛血清，GIBCO公司生產(chǎn)；青/鏈霉素雙抗，杭州吉諾生物醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)；胰酶，杭州吉諾生物醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)；順鉑，南京制藥廠有限公司生產(chǎn)；鹽酸阿霉素，MBCHEM；生理鹽水，廣東利泰制藥股份有限公司生產(chǎn)。

圖1 銅綠假單胞菌對H22移植瘤的影響注:A組：空白對照；B組：銅綠假單胞菌組；C組：聯(lián)合順鉑組；D組：聯(lián)合阿霉素組；E組：順鉑組；F組：阿霉素組Fig.1 Effect of PA-MSHA on H22 transplanted tumorNote: A: blank control； B: Pseudomonas aeruginosa group；C: combined with cisplatin group；D: combined with adriamycin group；E: cisplatin group；F: adriamycin group

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1接種：復(fù)蘇H22細(xì)胞，錐蟲藍(lán)染液染色計(jì)數(shù)，用 PBS配成濃度為1×l07個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，于2只小鼠腹腔注射細(xì)胞懸液0.2 mL/只。7 d后，無菌取小鼠腹水，以PBS配成濃度為1×l07個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，將檢疫合格的53只BALB/c小鼠先剪去左側(cè)腋下被毛，再用碘酒消毒，每只小鼠左側(cè)腋下注射0.2 mL的H22細(xì)胞懸液，每次注射前需混勻細(xì)胞懸液。

1.4.2分組：待大部分動物的腫瘤直徑長至約5 mm時(shí)，選取較均勻的48只動物，按腫瘤體積將小鼠隨機(jī)分為6組：空白對照、銅綠假單胞菌組、聯(lián)合順鉑組、聯(lián)合阿霉素組、順鉑組、阿霉素組，8只/組。

1.4.3配制：銅綠假單胞菌注射液直接使用，無需配制，灌胃給藥前恢復(fù)至室溫；順鉑的配制：準(zhǔn)確吸取1 mL的順鉑注射液，用生理鹽水定容至5 mL；阿霉素的配制：準(zhǔn)確稱取2 mg阿霉素，加入10 mL生理鹽水，混勻。

1.4.4給藥：空白組灌胃給予PBS溶液；銅綠假單胞菌組灌胃給予PA-MSHA(1 000×108個(gè)/mL)溶液；聯(lián)合順鉑組灌胃給予PA-MSHA(1 000×108個(gè)/mL)溶液，同時(shí)腹腔注射順鉑(0.2 mg/mL)；聯(lián)合阿霉素組灌胃給予PA-MSHA(1 000×108個(gè)/mL)溶液，同時(shí)腹腔注射阿霉素(0.2 mg/mL)；順鉑組腹腔注射順鉑(0.2 mg/mL)；阿霉素組腹腔注射阿霉素(0.2 mg/mL)。每天灌胃給藥0.2 mL/10 g，隔天腹腔注射0.1 mL/10 g，連續(xù)給藥14 d。

1.4.5觀察：每天觀察動物1次，每周測量2次動物體質(zhì)量；每周測量2次腫瘤長短徑，繪制腫瘤生長曲線；腫瘤體積按公式：V=1/2ab2測量計(jì)算，a、b分別表示長和寬；相對腫瘤增殖率T/C(%)計(jì)算公式如下：T/C%=TRTV/ CRTV×100%。(TRTV：治療組RTV；CRTV：陰性對照組RTV)。根據(jù)測量的結(jié)果計(jì)算出相對腫瘤體積(relative tumor volume，RTV)，計(jì)算公式為：RTV=Vt/ V0。其中V0為分籠給藥時(shí)(即0 d)測量所得腫瘤體積，Vt為每一次測量時(shí)的腫瘤體積。

1.4.6實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，完整剝離腫瘤稱重，分組排列照相，計(jì)算腫瘤抑制率：腫瘤生長抑瘤率(%)=(空白對照組平均瘤質(zhì)量-治療組平均瘤質(zhì)量)/空白對照組平均瘤質(zhì)量×100%。

1.5 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 銅綠假單胞菌聯(lián)合化療對一般臨床表現(xiàn)的影響

接種H22細(xì)胞后第4天，小鼠左背部皮下逐漸長出腫瘤。各組小鼠口、眼、耳、鼻均未見異常分泌物，精神狀態(tài)正常，大便無稀爛，尿量未見異常，尿液澄清透明。

2.2 銅綠假單胞菌聯(lián)合化療對體質(zhì)量的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，與空白對照組比較，聯(lián)合順鉑組、聯(lián)合阿霉素組、順鉑組、阿霉素組體質(zhì)量顯著降低(P<0.05)，銅綠假單胞菌組體質(zhì)量無顯著性變化(P>0.05)，見表1。

2.3 銅綠假單胞菌聯(lián)合化療對腫瘤體積的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，與空白對照組比較，聯(lián)合順鉑組、聯(lián)合阿霉素組、順鉑組、阿霉素組的腫瘤體積顯著降低(P<0.05)，銅綠假單胞菌組的腫瘤體積無顯著性變化(P>0.05)，見表2。

表1 銅綠假單胞菌對H22移植瘤小鼠體質(zhì)量的影響Table 1 Effect of PA-MSHA on body weight of H22 transplanted tumor

注：*表示與空白對照組比較，P<0.05，△表示與順鉑組比較P<0.05，▼表示與阿霉素組比較P<0.05

Note：Compared with blank control group,*P<0.05；Compared with cisplatin group,△P<0.05；Compared with adriamycin group,▼P<0.05

表2 銅綠假單胞菌對H22移植瘤生長的影響Table 2 Effect of PA-MSHA on the growth of H22 transplanted

注：*表示與空白對照組比較P<0.05，△表示與順鉑組比較P<0.05，▼表示與阿霉素組比較P<0.05

Note：Compared with blank control group,*P<0.05；Compared with cisplatin group,△P<0.05；Compared with adriamycin group,▼P<0.05

2.4 銅綠假單胞菌聯(lián)合化療對腫瘤質(zhì)量的影響

與空白對照組比較，聯(lián)合順鉑組、聯(lián)合阿霉素組、順鉑組的腫瘤質(zhì)量顯著降低(P<0.05)，阿霉素組的腫瘤質(zhì)量無顯著性變化(P>0.05)，見表2和圖1。聯(lián)合順鉑組、順鉑組的抑瘤率為49.2%、46.6%，聯(lián)合阿霉素組、阿霉素組的抑瘤率為32.1%、19.8%，見表2。

2.5 銅綠假單胞菌聯(lián)合化療對臟器系數(shù)的影響

與空白對照組比較，聯(lián)合順鉑組、聯(lián)合阿霉素組、順鉑組、阿霉素組的胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)顯著降低(P<0.05)；與順鉑組比較，銅綠假單胞菌組的胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)顯著增加(P<0.05)；與阿霉素組比較，銅綠假單胞菌組的脾臟系數(shù)顯著增加(P<0.05)，見表3。

表3 銅綠假單胞菌對H22移植瘤小鼠臟器系數(shù)的影響Table 3 Effect of PA-MSHA on organ coefficient of H22 transplanted tumor

注：*表示與空白對照組比較P<0.05，△表示與順鉑組比較P<0.05，▼表示與阿霉素組比較P<0.05

Note：Compared with blank control group,*P<0.05；Compared with cisplatin group,△P<0.05；Compared with adriamycin group,▼P<0.05

3 討論

人類利用細(xì)菌治療腫瘤已有一百多年的歷史[3]。銅綠假單胞菌注射液是一種通過基因工程手段制備的銅綠假單胞菌生物制劑[4]，其不僅能有效激活人體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，還能直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[5]，包括胃癌、肝癌、乳腺癌、腸癌、膀胱癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤等[6-8]。銅綠假單胞菌注射液是以自然界的綠膿桿菌為載體，通過基因工程技術(shù)表達(dá)出密布周身甘露糖敏感性(mannose sensitive hemagglutinin，MSHA)菌毛的制劑。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，銅綠假單胞菌注射液是一種免疫增強(qiáng)劑，通過活化人體的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，從而間接發(fā)揮抗腫瘤和抗感染的作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)，其物質(zhì)基礎(chǔ)是銅綠假單胞菌注射液菌毛上的甘露糖結(jié)合蛋白，該蛋白能與腫瘤細(xì)胞表面的甘露糖發(fā)生特異性結(jié)合，并產(chǎn)生兩方面的作用：① 靶向結(jié)合后改變腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，并誘導(dǎo)其凋亡；② 放大癌細(xì)胞的抗原信號，以刺激抗原遞呈細(xì)胞，幫助重建免疫監(jiān)視功能，從而阻止腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步播散和轉(zhuǎn)移[8]。進(jìn)一步的機(jī)理研究表明，銅綠假單胞菌注射液特有的MSHA 菌毛通過甘露糖分子的介導(dǎo)，阻斷細(xì)胞表面EGFR 受體的活化，從而導(dǎo)致惡性腫瘤細(xì)胞的凋亡，該理論稱為甘露糖通道途徑[10-13]。

銅綠假單胞菌制劑為我國學(xué)者自主研發(fā)，國內(nèi)主要用于惡性腫瘤的輔助治療[14]。但其輔助治療效果如何，目前需要實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的進(jìn)一步支持。本次研究結(jié)果證實(shí)，銅綠假單胞菌注射液(1 000×108個(gè)/mL)對BALB/c小鼠一般狀態(tài)、體質(zhì)量、腫瘤體積和腫瘤質(zhì)量無顯著性影響；對H22小鼠移植瘤的直接抑制效果不明顯，對順鉑化療的輔助治療效果不明顯，對阿霉素化療的輔助治療有一定的增強(qiáng)效果；提高了脾臟系數(shù)，降低了胸腺系數(shù)。本實(shí)驗(yàn)探討了銅綠假單胞菌注射液的輔助抗腫瘤活性，為未來相關(guān)領(lǐng)域和臨床研究打下了基礎(chǔ)。