劉甦蘇 吳 曦 周舒雅 王辰飛 左 琴 李保文 范昌發(fā)

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

c-Ha-ras(簡稱hRas)是人源ras原癌基因家族的一員，編碼由189個氨基酸組成的p21蛋白。p21蛋白是細胞內(nèi)信號傳導系統(tǒng)中的重要信號轉導因子，對細胞的增殖和分化起著調節(jié)作用[1-3]。本實驗室在早期利用傳統(tǒng)的轉基因技術建立了表達人類原癌基因hRas的C57BL/6 -Tg-hRas小鼠模型[4](簡稱Tg-hRas)并獲得了專利批準[5]。目的基因表達分析提示轉入hRas基因在小鼠13個主要臟器中均表達[6]，陽性致癌物給藥實驗也表明該模型較野生型小鼠敏感。目前正在推動該模型在藥物臨床前安全性評價的應用[7-8]。

隨著生物技術的發(fā)展，近幾年出現(xiàn)了條件性基因打靶技術[9]。該方法是在常規(guī)基因敲除的基礎上，利用重組酶介導的位點特異性重組技術，可對生物基因打靶的范圍和時間進行控制，將目的基因在生物特定類型的細胞或發(fā)育的特定階段中進行表達[10-11]，其優(yōu)勢在于比傳統(tǒng)的轉基因技術更加穩(wěn)定。利用這一新型的條件打靶技術，本實驗室又構建了針對hRas基因構建基于Cre-LoxP系統(tǒng)的條件性定點敲入小鼠模型(hRasfl/+小鼠)，以期通過新建小鼠模型與不同組織器官表達Cre重組酶的工具小鼠交配，獲得hRas基因在特定組織器官條件性表達的一系列小鼠模型，為新藥的臨床前致癌性安全評價及抗癌藥物的研發(fā)及癌癥機制研究提供新的實驗動物模型。本文選取了全身性表達的EIIa-cre小鼠與新建模型進行交配，并對其后代特性進行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物:B6.FVB-Tg(EIIa-cre)C5379Lmgd/J小鼠(以下簡稱EIIa-cre小鼠)引自美國Jackson實驗室，純合子小鼠引自美國Jackson實驗室，本品系EIIa啟動子調控Cre基因的表達，在小鼠胚胎早期(特別是1-細胞期)表達Cre重組酶。Cre介導的重組發(fā)生在動物發(fā)育的所有組織中，并且可以通過生殖細胞將遺傳改造傳遞給后代[12]。小鼠引進后在中國食品藥品檢定研究院實驗動物中心進行繁殖；C57BL/6 J、BALB/C、KM小鼠來自中國食品藥品檢定研究院實驗動物研究所，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(京)2014-0013。繁育環(huán)境為SPF級，飼養(yǎng)和實驗在清潔級環(huán)境中進行，飼喂SPF級小鼠顆粒飼料，其生產(chǎn)許可證號為京飼證(2014)06054，飲用滅菌自來水。本實驗在中國食品藥品檢定研究院實驗動物倫理委員會監(jiān)督下進行。

1.1.2主要儀器及試劑:限制性內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶、Taq酶、TRIzol試劑、RT-PCR 試劑盒、SYBR Premix Ex TaqⅡ熒光定量PCR試劑盒等(大連寶生物公司)；瓊脂糖及其他生化試劑為進口分裝、DMEM高糖培養(yǎng)基、L-谷氨酞胺、非必需氨基酸、青鏈霉素溶液、巰基乙醇、胎牛血清 (ES細胞認證)、二甲亞楓(DMSO)、PBS緩沖液pH7.2、EDTA等試劑分別購自Gibco、Sigma和HyClone公司。

Roche 480Ⅱ熒光定量PCR儀(Roche)；Nano Drop超微量分光光度(Thermo)；微量移液器(Eppendorf)；引物由諾賽基因公司合成；TE緩沖液、TAE緩沖液自行配置；其他常見生化試劑乙醇、異戊醇、苯、氯仿購自北京化學工業(yè)集團有限公司。

1.2 方法

1.2.1基于Cre- LoxP系統(tǒng)的人源hRas基因條件性定點敲入小鼠模型的載體構建:首先從人類cDNA中擴增獲得hRas目的基因，該基因包含4個外顯子，全長596 bp，擴增引物為Ai3-hRas-F /Ai3-hRas-R，序列及退火溫度見(表1)。隨后將目的基因cDNA導入改造后的Ai3載體中，該載體包含Rosa26基因的同源重組臂、篩選基因新霉素(Neo)，CAG強啟動子，并且利用Cre-LoxP系統(tǒng)，在啟動子與目的基因之間加入轉錄終止序列“STOP”，以獲得目的基因在特定的組織或細胞中的調控表達。具體打靶載體策略見圖1。

表1 小鼠構建及基因型鑒定及QRT-PCR引物序列及退火溫度Table 1 Primer and Tm information in hRas and gene identification by PCR and real-time RT-PCR method

圖1 人源hRas基因打靶載體Fig.1 The construction of hRas targeting strategy

1.2.2電擊轉染ES細胞:轉染前用XhoI酶將經(jīng)酶切鑒定成功的載體進行線性化，同時ES 細胞用胰酶消化后重懸于PBS中。取40μg載體DNA與1 mL細胞混勻，加入電穿孔槽中穿電擊，電穿孔條件：電壓280 V，電容500F，時間10 ms。將電擊后的細胞分入已鋪好滋養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)皿中，置于CO2孵箱中培養(yǎng)，20 h 后換成ES 細胞篩選G418培養(yǎng)液。

1.2.3ES 細胞陽性克隆的篩選和Southern blot鑒定:克隆篩選條件為含有300μg/ mL G418，篩選10 d，每天更換ES 細胞篩選培養(yǎng)液，第10 d挑取ES 細胞克隆。將挑取的單個未分化ES 克隆置于96 孔板中，充分消化后轉移至24 孔培養(yǎng)板上擴增并提取基因組DNA，在恒定電壓下，將DNA樣品放在0.8%瓊脂糖凝膠中進行電泳，在轉移到尼龍膜和紫外線交聯(lián)后，預雜交和雜交參考羅氏地高辛試劑盒使用說明操作。

1.2.4囊胚注射制備嵌合體小鼠:

(1)囊胚的收集：選取4 周齡的BALB/c雌鼠，48 h間隔注射孕馬血清促性腺激素和人絨毛膜促性腺激素促進排卵，與小鼠合籠后次晨檢查陰栓，記為0.5 d。第3.5 d取其胚胎，置37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。

(2)囊胚顯微注射：經(jīng)鑒定的陽性打靶ES細胞復蘇并傳代后, 用 0.25%的胰酶消化成單細胞懸液置于冰盒, 用于囊胚顯微注射，每個囊胚注射10～15個ES細胞，注射后置37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中恢復1～2 h后進行胚胎移植。

(3)囊胚移植: 選用KM小鼠做假孕母鼠，挑選發(fā)情前期和發(fā)情期雌鼠, 1∶1與結扎雄鼠交配, 次日檢栓, 單籠飼養(yǎng)備用, 見栓當天為0.5 d，子宮移植用2.5 d假孕鼠。移植成功等小鼠出生7～10 d后由毛色初步判斷是否為嵌合體小鼠。

1.2.5雜合hRasfl/+小鼠的繁育:嵌合小鼠出生后，根據(jù)毛色篩選嵌合率在50%及以上的雄鼠，將其與野生的C57BL/6 J小鼠擴繁后代，在其后代中通過PCR、Southern blot方法鑒定后，獲得可遺傳的雜合子hRasfl/+小鼠。

1.2.6全身細胞表達人源hRas基因的基因敲入小鼠的建立:首先將篩選得到的hRasfl/+雜合小鼠自身交配，獲得hRasfl/fl純合小鼠；再用hRasfl/fl與EIIa-cre純和小鼠雜交，獲得全身細胞表達人源hRas基因敲入純合子小鼠(簡稱hRas-EIIa-cre小鼠)。

圖2 基于Cre- LoxP系統(tǒng)的全身表達hRas基因敲入小鼠模型繁殖示意圖Fig.2 Breeding schematic of hRas gene conditional knock in mouse using the Cre- Loxp strategy

1.2.7hRas-EIIa-cre全身表達敲入小鼠基因表達量測定:分別取E10至E14 d的經(jīng)基因型鑒定的hRas-EIIa-cre小仔胚胎，E15及E17 d檢栓成功hRas-EIIa-cre母鼠的胎盤組織，以及E13 d的Tg-hRas小仔、C57BL/6野生型小仔的胚胎進行熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)檢測，并比較其表達量。

1.2.8總RNA的提取以及逆轉錄反應:Trizol法提取總RNA，取等量各組織總RNA，除去基因組DNA進行逆轉錄反應。逆轉錄采用寶生物的Prime Script TM RT reagent Kit，逆轉錄反應體系20 μL其中總RNA 1 μL，具體操作參照說明書。反轉錄得到c-Ha-ras基因cDNA后，以cDNA為模板進行PCR擴增。

1.2.9熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)檢測基因表達水平:選用GAPDH 內(nèi)參基因，設計qRT-PCR 引物，hRas基因特異上游引物為RQ-RAS-F，下游引物為RQ-RAS-R，目的片段長177 bp，序列及退火溫度見表1。進行反應時，測定cDNA 溶度，稀釋終溶度為50 ng/μL，qPCR反應體系：SYBR Premix Ex Taq II(TliRNase H Plus)10.0 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.3 μL，cDNA模板2 μL，ROX Reference Dye II(50×)0.4 μL，加ddH20至20 μL。反應條件：95 ℃ 30 s 預變性，隨后95 ℃ 5 s，62 ℃ 30 s，40個循環(huán)。

2 結果

2.1 打靶載體的構建及其中人源hRas基因的鑒定

本研究將hRas基因連接到Ai3打靶載體中，根據(jù)打靶載體構建原理設計兩對鑒定引物，其中Ai3-hRas-F/R鑒定大小、hRAS-523F及WPRE-R鑒定片段方向(見表1)；并通過PCR鑒定目的片段大小及方向，將篩選到的克隆進一步用限制性內(nèi)切酶酶切后明確片段的正確性。第一次共篩選到8個正確大小的克隆，目的片段為596 bp(圖3A)，但是通過Ncol內(nèi)切酶的酶切鑒定后，8個克隆均未能成功酶切，實驗結果表明這8個克隆不是正確克隆(圖3C)；隨后又通過菌落PCR鑒定、正確克隆搖菌、提取質粒、酶切檢測等步驟，篩選得到3號一個正確克隆，目的片段370 bp(圖3B)，經(jīng)過BamHI、HindIII、EcoRI+EcoRV內(nèi)切酶酶切后結果顯示該克隆正確，部分結果見(圖3D)。

圖3 人源hRas基因的鑒定和克隆篩選注：A：hRas基因連接到Ai3打靶載體中第一次篩選到8個正確大小的克隆，目的片段為596 bp；B：hRas基因連接到Ai3打靶載體中第二次篩選到1個正確大小的克隆，目的片段為370 bp； C：將篩選到的第一次8個克隆用Ncol內(nèi)切酶的酶切結果；D：將篩選到第二次1個克隆用內(nèi)切酶的酶切結果Fig.3 Identification and cloning of human hRas geneNote: A：The results for the first time of hRas plasmid result; B：The results for the second time of hRas plasmi dresult;C：The results for the first time of Ncol enzyme;D：The results for the second time of BamHI、HindIII、EcoRI+EcoRV enzyme

2.2 同源重組 ES 細胞克隆的Southern blot鑒定

選擇3號克隆進行Ai3-hRas-knock-in載體線性化，電轉染到 ES 細胞中。經(jīng)過 G418篩選培養(yǎng)7 d 后發(fā)現(xiàn)并挑取 96 個藥物抗性 ES 細胞克隆，提取其基因組 DNA 樣本并進行Southern blot鑒定。分別從兩端各設計一對探針(圖4A)，Southern blot目的片段分別為3'端為5.5Kb，5'端為12.1Kb，經(jīng)過初篩和復篩，共獲得陽性克隆12個(圖4B)。

圖4 基因組DNA進行Southern檢測注：A：探針設計示意圖；B：3′端探針Southern檢測結果；C：5′端探針Southern檢測結果Fig.4 DNA expressions human hRas gene in ES by Southern blottingNote:A：The modes of Probe design strategy sketch; B：Result of 3′end Southern blot; C：Result of 5′end Southern blot

2.3 陽性ES克隆囊胚注射、嵌合體雄鼠繁育得到hRasfl/+基因敲入小鼠

選擇A11號克隆進行顯微囊胚注射，移植了48枚胚胎，出生9只小鼠，最終得到6只嵌合鼠，其中4只雄鼠，毛色嵌合率大于50%的有1只；2只雌鼠，毛色嵌合率均小于50%。將嵌合率大于50%嵌合雄鼠與野生型C57BL /6 J雌鼠進行交配獲得了21只F1代小鼠，取這些小鼠鼠尾的DNA 進行PCR鑒定，根據(jù)打靶載體設計了兩對區(qū)分基因型的引物，分別為Rosa-GT-F/R，WPRE-F/R，具體引物信息見(表1)，最終得到4只hRasfl/+雜合子小鼠，雌雄各半。將自主建立的4只hRasfl/+雜合子小鼠，雌雄比例1∶1，將其兩兩交配后得到29只F2代小鼠，經(jīng)剪尾及PCR檢測篩選小鼠基因型，僅保留10只hRasfl/fl純合子小鼠，雌雄各半，基因型鑒定結果見(圖5)。

圖5 hRasfl/+小鼠基因型鑒定結果注：M：D-2000 marker；hRasfl/+：hRas基因雜合子小鼠；hRasfl/fl :hRas基因純合子小鼠；WT：野生型小鼠；CK-：陰性對照Fig.5 Analysis of the genotype of hRasfl/+knockin mice.Note: M：D-2000 marker；hRasfl/+：hRas gene Heterozygote mice；hRasfl/fl :hRas gene Homozygote mice；WT：wide type；CK-：negative control

2.4 hRasfl/flEIIa-cre基因敲入小鼠的繁殖及基因表達水平結果

采用1∶1的方式，用8周齡hRasfl/fl雄鼠與EIIa-cre純合雌鼠共交配3次，每次8只，檢栓成功11只母鼠；采用8周齡EIIa-cre純合雄鼠與hRasfl/fl雌鼠共交配3次，每次5只，檢栓成功7只母鼠，觀察到18只檢栓成功母鼠均有明顯腹部懷孕現(xiàn)象，但是到胚胎發(fā)育到13 d后母鼠腹部減小，21 d孕期結束未有新生小鼠出生(表2)。重新交配后，待母鼠懷孕13 d進行解剖后均見黑色胎盤以及吸收的胚胎。取未吸收完全的5只剩余胚胎經(jīng)基因型鑒定為cre基因陽性，記為hRas-EIIa-cre胚胎；采用8周齡hRasfl/fl雄鼠與EIIa-cre純合雌鼠交配檢栓成功后，在E13解剖母鼠，取出胚胎，檢測hRas基因表達水平并與同期的Tg-hRas模型比較。結果表明hRas-EIIa-cre敲入小鼠E13的胚胎與Tg-hRas模型目的基因表達水平相當，說明構建的hRasfl/fl小鼠與EIIa-cre工具鼠交配后，轉入基因在胚胎中表達(見圖6A～D)。

表2 hRasfl/fl EIIa-cre基因敲入小鼠的繁殖情況Table 2 The breeding records of hRasfl/fl EIIa-creknockin mice

圖6 與Cre工具鼠交配后仔鼠及胚胎基因型鑒定及表達水平注：A：左側為正常13 d的小鼠胚胎，右側為未完全吸收胚胎；B：hRas-EIIa-cre懷孕13 d母鼠子宮，可見黑色胎盤及未完全吸收胎兒；C：hRas-EIIa-cre胚胎的PCR檢測結果，500 bp條帶為所整合的Cre基因，1-5分別表示5只未吸收的胚胎，CK+及CK-表示陽性、陰性對照；D：小鼠E13 d胚胎qRT-PCR結果圖。Fig.6 Analysis of the PCR genotyping and qPCR ofhRas-EIIa-creknockin mice.Note:A：the normal mouse embryos for 13 days(left), not completely absorbed embryo for 13 days (right); B：hRas EIIa-cre 13 days mother’swomb；C：PCR genotyping of hRas knockin mice, Primer pair was designed in Creallele; D：Relative real-time PCR of hRasm RNA in hRas-EIIa-cre mice、Tg- hRas and C57BL/6 control mice at embryos for 15.5 days

2.5 不同日齡hRas-EIIa-cre基因敲入小鼠胚胎期hRas基因表達水平檢測

為進一步探討hRas-EIIa-cre基因敲入小鼠胚胎期死亡原因，隨后在母鼠懷孕后E10.5～14.5 d解剖母鼠，取出未吸收胚胎，檢測并比較hRas基因表達水平。結果表明hRas-EIIa-cre敲入小鼠E10.5～14.5 d的胚胎目的基因表達水平總體呈現(xiàn)一個上升趨勢，13 d后表達水平明顯增加，這一現(xiàn)象與觀察到的母鼠懷孕13.5 d后腹部減少現(xiàn)象一致。進一步在母鼠懷孕后E15.5 d解剖多只母鼠，觀察到子宮內(nèi)只剩黑色的胎盤，胎兒全部被吸收，取胎盤組織進一步檢測hRas基因mRNA表達水平并與母體比較，發(fā)現(xiàn)胎盤中表達量是母體的404倍(圖7)。

圖7 不同日齡hRas-EIIa-cre基因敲入小鼠胚胎期hRas基因表達水平Fig.7 hRas gene mRNA expressed in hRas-EIIa-creembryos for different days by qPCR technology

3 討論

本研究運用Cre-LoxP系統(tǒng)建立了帶有hRas基因敲入的小鼠模型(簡稱hRasfl/fl)，在其hRas靶基因前端的終止子序列兩側插入LoxP序列，表型上等同于野生型，但是當其與不同表達Cre重組酶的轉基因小鼠交配后，能刪除兩個LoxP位點之間的終止子序列，Cre-LoxP位點依賴的重組便會發(fā)生在表達Cre酶的細胞中，并導致該特定細胞中靶基因的改變，從而獲得了hRas表達的可獲得組織特異性基因敲入小鼠，即hRas-cre小鼠。

選用全身組織表達Cre重組酶的EIIa-cre小鼠試圖獲得全身hRAS基因高效表達的小鼠模型，但交配6批次后依然沒有仔鼠出生。小鼠的胚胎發(fā)育是一個極為特殊的分化過程，既包括細胞數(shù)目的不斷增殖，也包括細胞不斷地退出細胞周期，分化為具有不同功能的終末細胞。李酈等研究表明p21基因表達信號從 E10.5 d開始參與小鼠胚胎發(fā)育，到E13.5 d逐步增強[13]，這一結果與本實驗觀察到的母鼠13 d后腹部變小的現(xiàn)象一致，說明轉入基因啟動了表達隨即影響了胚胎的進一步發(fā)育。

本實驗室在構建hRasfl/fl小鼠時采用了CAG啟動子，它是人工構建的組合啟動子，由巨細胞病毒早期增強子和雞β-肌動蛋白啟動子組成，用于驅動基因在哺乳動物載體的高水平表達[14]。早期構建Tg-hRas模型時，采用的是轉基因方法且使用了自身啟動子，而這次使用了CAG啟動子，可實現(xiàn)外源基因在組織中高表達，這可能是導致EIIa-cre小鼠胚胎致死的一個原因。隨后本研究進一步檢測并比較了hRas-EIIa-cre和Tg-hRas兩種模型的hRas基因表達水平，在E13.5 d的胚胎中插入基因差異不明顯，但隨著時間的增加hRas-EIIa-cre模型中hRas基因表達水平明顯逐步增加，特別是在E15.5 d時檢測胎盤組織的表達量是母體的404倍。小鼠胎盤最外層為蛻膜層，屬于母體來源。其次為成膠質細胞層，成膠質細胞層和蛻膜層中間散在分布著巨細胞[15]，各種胚外組織形成一個統(tǒng)一的生命支持系統(tǒng)，在子宮中維持，營養(yǎng)并保護胚胎[16]。胎盤組織是一個融合組織，從實驗結果看母體不表達hRas基因而胎盤表達明顯，說明其表達組織應該來自退化的胎兒，轉入基因的高表達可能是hRas-EIIa-cre小鼠胚胎致死的原因。

另外在胚胎發(fā)育過程中，不同日齡及不同器官中的小鼠胚胎中表達強度也不一樣。Tg-hRas模型因轉基因隨機插入的原因，也是經(jīng)過了首建鼠(founder)的篩選，選擇了一個比較穩(wěn)定且表達量適中的系而成功構建的[17-18]。hRas-EIIa-cre小鼠的構建是定點插入且采用CAG啟動子，導致胚胎期不同器官的高表達，可能引起了胚胎期死亡。本實驗中轉入hRas基因得到全身表達影響了機體的所有細胞，進一步檢測不同胚胎期不同器官的表達水平，可能是探討胚胎致死原因的一個切入點[13]。