樊曉盼 劉靜靜 梁麗雅 吳晨燕 馬儷珍2,

(1. 天津農(nóng)學(xué)院工程技術(shù)學(xué)院，天津 300384；2. 天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津 300384；3. 天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300384)

肉香味由基本性香味和特征性香味組成，形成肉香味的前體物質(zhì)通常分為兩大類：水溶性成分和脂質(zhì)，形成芳香風(fēng)味化合物的主要反應(yīng)包括氨基酸和還原糖之間的美拉德反應(yīng)、脂質(zhì)的熱降解反應(yīng)以及脂質(zhì)降解產(chǎn)物與美拉德反應(yīng)之間的相互作用[1]。動(dòng)物脂肪是肉類特征香味物質(zhì)形成的重要前體物質(zhì)，脂肪的加入可使牛肉味、豬肉味、雞肉味等肉香味更容易區(qū)別。當(dāng)燒烤不含脂肪的牛肉時(shí)，能判別出是牛肉的比率為45.2%；而假如是燒烤含有10%脂肪的牛肉時(shí)，則能夠準(zhǔn)確判斷出是否牛肉的比率會(huì)增加到90.2%[2]。Hornstein等[3-4]和Pearson等[5]研究發(fā)現(xiàn)豬肉、牛肉和羊肉的水溶性提取物經(jīng)加熱處理后具有類似的香味，而脂肪經(jīng)加熱處理后則會(huì)明顯產(chǎn)生特征性肉香味。

脂肪氧化通常包括脂肪在空氣中的加熱氧化和添加脂肪酶進(jìn)行的催化氧化。脂肪氧化產(chǎn)物加入到美拉德反應(yīng)體系中會(huì)使制備的肉味調(diào)味基料特征性香氣更加突出；脂肪水解產(chǎn)物產(chǎn)生的不飽和脂肪酸通過氧化降解反應(yīng)也可以產(chǎn)生香味物質(zhì)或作為美拉德反應(yīng)的香味前體物質(zhì)[6-7]。目前，關(guān)于脂肪酶氧化結(jié)合美拉德熱反應(yīng)制備肉類調(diào)味基料的研究還鮮有報(bào)道，而關(guān)于脂肪熱氧化參與美拉德反應(yīng)制備肉味調(diào)味基料的技術(shù)已有一定的發(fā)展[8]。孫寶國(guó)[9]在中國(guó)第三代肉味香精的生產(chǎn)技術(shù)中融合了脂肪調(diào)控氧化環(huán)節(jié)，即將一定氧化程度的脂肪添加到美拉德反應(yīng)體系中，在遵循“味料同源”的同時(shí)，還增強(qiáng)了肉的特征風(fēng)味，大大降低了脂肪用量。中國(guó)許多學(xué)者也對(duì)脂肪氧化對(duì)美拉德熱反應(yīng)產(chǎn)物風(fēng)味的影響進(jìn)行了大量研究。張玲等[10]研究了氧化及未氧化雞脂對(duì)“肉酶解液—葡萄糖—半胱氨酸”反應(yīng)體系風(fēng)味的影響，結(jié)果表明添加氧化脂肪對(duì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物風(fēng)味的調(diào)控作用比添加未氧化脂肪大，從而使熱反應(yīng)體系呈協(xié)調(diào)的肉香味，且特征肉香味更加突出。吳肖等[11]在牛肉酶解液中添加不同氧化程度的牛油進(jìn)行美拉德反應(yīng)，結(jié)果表明不同氧化程度的牛油能夠影響體系中含硫氨基酸和鮮味氨基酸的反應(yīng)活性，進(jìn)而影響美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的香氣和味感。

為進(jìn)一步增強(qiáng)傳統(tǒng)天然牛肉調(diào)味基料(Beef Flavor，BF)的特征香氣，本試驗(yàn)擬以冷凍牛骨肉末為原料，經(jīng)熱—壓浸提、酶解后，在美拉德反應(yīng)體系中添加經(jīng)熱氧化或酶氧化處理過的牛油制成氧化型牛肉調(diào)味基料(Oxidized Beef Flavor，OBF)，采用電子鼻、電子舌結(jié)合SPME-GC-MS對(duì)其揮發(fā)性氣味和滋味進(jìn)行分析，研究熱氧化和酶氧化2種氧化牛油對(duì)OBF風(fēng)味的貢獻(xiàn)效果，為實(shí)際生產(chǎn)特征香氣濃郁的肉味調(diào)味基料提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛骨肉末：冷凍牛肉胴體電鋸分割時(shí)留下的肉末(骨肉質(zhì)量比為3∶7)，天津掛月食品有限公司；

風(fēng)味蛋白酶(500 LAPU/g)、復(fù)合蛋白酶(1.5 AU/g)：丹麥諾維信公司；

蛋氨酸、脯氨酸：食品級(jí)，冀州市華恒生物科技有限公司；

VB1：江西天新藥業(yè)有限公司；

葡萄糖、木糖：山東西王糖業(yè)有限公司；

脂肪酶：30 U/mg，江蘇一鳴生物有限公司；

新鮮牛油：天津伊興清真食品有限公司；

高壓蒸汽滅菌鍋：SX-500型，日本TOMY有限公司；

水浴恒溫振蕩器：WE-2型，天津市歐諾儀器儀表有限公司；

電子舌：Astree型，法國(guó)Alpha M.O.S公司；

電子鼻：PEN3型，德國(guó)AIRSENSE公司；

電動(dòng)攪拌器：D8401W 型，天津市華興科學(xué)儀器廠；

玻璃轉(zhuǎn)子流量計(jì)：LZB3型，浙江余姚流量?jī)x表廠；

電磁式空氣壓縮機(jī)：ACO208型，浙江森森實(shí)業(yè)有限公司；

數(shù)顯恒溫油浴鍋：yy-1型，江蘇省金壇市金祥龍電子有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 熱氧化牛油的制備 在裝有通氣管、電動(dòng)攪拌器、水銀溫度計(jì)和回流冷凝管的500 mL四口燒瓶中加入50 g新鮮牛油，通過調(diào)節(jié)空氣壓縮機(jī)和玻璃轉(zhuǎn)子流量計(jì)按照0.51 L/min 的流速通入空氣進(jìn)行熱氧化牛油的制備，控制氧化溫度為110 ℃，分別氧化1，2，3，4 h得到不同熱氧化程度的牛油O1、O2、O3和O4。

1.2.2 酶氧化牛油的制備 稱取適量新鮮牛油于錐形瓶中，按照1∶1(質(zhì)量比)的比例添加磷酸鹽緩沖溶液(pH為6.5)，放置于磁力攪拌器上，轉(zhuǎn)速為150 r/min，溫度45 ℃，當(dāng)混合物達(dá)到45 ℃時(shí)，按照酶/底物(E/S)比率為0.5%(0.5 g脂肪酶/100 g牛油)添加脂肪酶。分別酶解1，2，3，4 h后，將樣品置于沸水浴滅酶10 min，使酶失活，制備出不同酶氧化程度的牛油L1、L2、L3和L4。

1.2.3 OBF的制備 將冷凍牛骨肉末解凍至常溫后，按照牛骨肉末∶水=1∶4(質(zhì)量比)分別稱取肉末和蒸餾水，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，放置在高壓蒸汽滅菌鍋中，在壓?.1 MPa、溫度120 ℃、時(shí)間4 h條件下浸提牛骨肉末中的蛋白質(zhì)，制成牛骨肉蛋白浸提液，添加0.06%風(fēng)味蛋白酶，0.03%復(fù)合蛋白酶，在50 ℃，自然pH條件下酶解4.5 h，沸水浴滅酶20 min后立即冷卻，然后添加1.2.1和1.2.2制成的不同氧化程度的4%氧化牛油、2%木糖、2%葡萄糖、0.4%蛋氨酸、0.4%脯氨酸、1.2% VB1，振蕩均勻后放置于油浴鍋中，在110 ℃條件下進(jìn)行美拉德反應(yīng)1.5 h制成OBF，冷卻過濾后分別用電子鼻、電子舌結(jié)合GC-MS對(duì)其氣味和滋味進(jìn)行測(cè)定，并進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。添加未氧化牛油制成的OBF記為BFC，添加不同氧化時(shí)間的熱氧化牛油制成的OBF記為BFO1～BFO4，添加不同氧化時(shí)間的酶氧化牛油制成的OBF記為BFL1～BFL4。

1.2.4 指標(biāo)測(cè)定方法

(1) 牛油酸價(jià)的測(cè)定：按GB 5009.229—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中酸價(jià)的測(cè)定》執(zhí)行。

(2) 牛油羰基價(jià)的測(cè)定：按GB 5009.230—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中羰基價(jià)的測(cè)定》執(zhí)行。

(3) 牛油茴香胺值的測(cè)定：按GB/T 24304—2009《動(dòng)植物油脂 茴香胺值的測(cè)定》執(zhí)行。

(4) OBF的氣味分析：取10 mL待測(cè)樣品，密封后常溫放置10 min后依次進(jìn)行測(cè)定分析，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

電子鼻工作參數(shù)設(shè)置為：采樣時(shí)間1 s/組，傳感器自動(dòng)清洗時(shí)間180 s，歸零時(shí)間10 s，樣品平衡時(shí)間10 s，進(jìn)樣流量5 mL/s，測(cè)定分析時(shí)間60 s。

(5) OBF的滋味分析：將待測(cè)樣品緩慢倒入電子舌專用燒杯(25 mL)中，待測(cè)。電子舌傳感器系統(tǒng)包括SRS、SWS、BRS、STS、UMS、SPS、GPS 7根傳感器，其中前5根傳感器(SRS、SWS、BRS、STS、UMS)分別為對(duì)酸、甜、苦、咸和鮮味敏感的傳感器，其響應(yīng)值能夠用來反映不同樣品5種滋味的相對(duì)強(qiáng)度。以Ag/AgCl為參比電極，傳感器經(jīng)活化、校正后開始測(cè)樣，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定6次。

(6) OBF中揮發(fā)性化合物的測(cè)定：取1 mL樣品置于20 mL 頂空瓶?jī)?nèi)，采用SPME提取揮發(fā)性化合物，再通過GC-MS對(duì)化合物進(jìn)行分離并分析。

固相微萃取條件：采用65 μm PDMS/DVB萃取頭，將樣品置于60 ℃條件下平衡20 min后，插入萃取頭萃取30 min，萃取結(jié)束后，拔出萃取頭，置于200 ℃進(jìn)樣口解析2 min。

色譜條件：選用DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)色譜柱，柱溫箱初始溫度為40 ℃，進(jìn)樣口溫度為200 ℃，不分流進(jìn)樣模式，載氣流速為1 mL/min，柱溫箱升溫程序?yàn)?0 ℃ 保持3 min，以5 ℃/min升至120 ℃后，再以10 ℃/min 升至200 ℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件：離子源溫度為200 ℃，傳輸線溫度為250 ℃，采用全掃描(Scan)模式采集信號(hào)，掃描范圍為35～500m/z。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用Microsoft Excel 2003對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，Statistix 8.1進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，顯著性差異(P<0.05)通過Turkey test程序進(jìn)行。氣味和滋味分析用電子鼻和電子舌自帶軟件Alpha soft進(jìn)行主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 9組牛油的氧化程度

9組牛油的氧化程度如表1所示。酸價(jià)是脂肪中游離脂肪酸含量的標(biāo)志，從表1可看出，與未氧化(新鮮)牛油(C組)相比，經(jīng)氧化處理后的牛油酸價(jià)均明顯增加，尤其是經(jīng)脂肪酶處理過的，加酶氧化不同時(shí)間的牛油(L1～L4)酸價(jià)分別為55.8，82.5，84.9，88.0 mg NaOH/g，這是因?yàn)閯?dòng)物油脂多為飽和脂肪酸，常溫貯藏條件下很難被氧化，且牛油的主要成分是甘油三酯，而脂肪酶能夠逐步將甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。試驗(yàn)結(jié)果說明采用脂肪酶對(duì)牛油進(jìn)行酶解，可大大提高其游離脂肪酸含量，而脂肪酸會(huì)進(jìn)一步氧化或與其他物質(zhì)反應(yīng)生成過氧化物進(jìn)而分解為香氣閾值很低的酮、醛、酸等揮發(fā)性化合物，產(chǎn)生令人愉快的肉香味[12]。羰基價(jià)通常是指油脂氧化酸敗后產(chǎn)生的含有醛基和酮基的脂肪酸或甘油酯及其聚合物的總量，是油脂熱劣變的靈敏指標(biāo)，用來反映油脂氧化產(chǎn)物——酮醛等有害物質(zhì)的含量和油脂酸敗劣變的程度[13-14]。從表1可看出，9組牛油的羰基價(jià)值最低為C組(3.31 meq/kg)，最高為熱氧化4 h的牛油O4組(5.92 meq/kg)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于酸敗油脂和加熱劣化油的羰基價(jià)(50 meq/kg)，說明本試驗(yàn)處理過的牛油并未達(dá)到酸敗狀態(tài)，不會(huì)導(dǎo)致不良風(fēng)味的產(chǎn)生。此外，熱氧化處理的牛油羰基價(jià)值整體高于酶氧化牛油，說明加熱更容易導(dǎo)致牛油氧化生成過氧化物，從而進(jìn)一步分解為含羰基的化合物。茴香胺值是指油脂在氧化劣變過程中產(chǎn)生的醛類化合物的含量，與羰基價(jià)一致，都是用來表征油脂劣變程度的指標(biāo)，從表1還可知，經(jīng)氧化處理后的牛油茴香胺值最高為L(zhǎng)4組(1.33)，其次為O4組(1.17)，且二者差異不顯著(P>0.05)，說明本試驗(yàn)將油脂氧化時(shí)間控制在1～4 h不會(huì)造成油脂氧化過度，產(chǎn)生酸敗哈喇味。

表1 9組牛油的氧化程度?

? 不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)。

2.2 電子鼻檢測(cè)OBF風(fēng)味

采用電子鼻對(duì)OBF揮發(fā)性氣味的檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。第一主成分和第二主成分的貢獻(xiàn)率分別為91.42%和4.95%，總貢獻(xiàn)率達(dá)到96.37%(>90%)，表明這2個(gè)主成分能夠用來反映添加不同氧化牛油制成的OBF揮發(fā)性氣味的實(shí)際情況。整體來看，添加氧化牛油制成的OBF與BFC均無重疊，表明脂肪氧化能夠顯著影響OBF的揮發(fā)性氣味，這與劉金凱等[15]關(guān)于氧化羊骨油對(duì)羊肉調(diào)味基料的風(fēng)味影響研究結(jié)果一致。此外，4組BFO與4組BFL之間也未重疊，表明熱氧化和酶氧化的脂肪對(duì)傳統(tǒng)牛肉調(diào)味基料揮發(fā)性氣味的貢獻(xiàn)效果不同。BFC與BFO1～BFO4的區(qū)分指數(shù)分別為0.999，0.997，0.996，0.997，說明添加熱氧化牛油制成的OBF風(fēng)味均與BFC風(fēng)味差異極顯著。且從圖1可看出，BFO1、BFO2和BFO3重疊部分較多，說明熱氧化1～3 h對(duì)OBF氣味影響不大，而氧化4 h時(shí)表現(xiàn)出明顯的差異。BFC與BFL1～BFL4的區(qū)分指數(shù)分別為0.911，0.984，0.997，0.998，說明隨著氧化時(shí)間的延長(zhǎng)，酶氧化牛油對(duì)OBF的風(fēng)味影響越來越大。而BFL1和BFL2的特征區(qū)域有明顯重疊，表明酶解1～2 h的牛油對(duì)OBF氣味的貢獻(xiàn)效果相似，酶解3 h的OBF特征區(qū)域明顯區(qū)別開，而酶解4 h與BFC距離遠(yuǎn)，表明酶氧化相比較熱氧化來說，對(duì)OBF的揮發(fā)性氣體風(fēng)味影響較大，特別是酶氧化4 h之后這一影響更為明顯。

圖1 電子鼻對(duì)不同OBF樣品的主成分分析

2.3 電子舌檢測(cè)OBF風(fēng)味

從圖2(a)可看出，BFC與其他8組之間距離很遠(yuǎn)，說明BFC滋味與其他8組差異很大，以致于8組之間的差異情況不易分析，因此圖2(b)僅對(duì)8組添加了氧化牛油的OBF滋味進(jìn)行判別因子分析。電子舌檢測(cè)到的8組OBF樣品的特征區(qū)域均無重疊，說明8組樣品之間差異顯著，表明不同氧化時(shí)間和不同氧化方式的牛油對(duì)OBF滋味的貢獻(xiàn)能力不同。在判別因子分析圖中，通常用樣品兩兩間的相對(duì)距離分析樣品間滋味差異，樣品間的相對(duì)距離越近，則樣品滋味越接近。BFO1與BFO2、BFO3、BFO4之間的相對(duì)距離分別為25.25，28.53，28.83；BFO2與BFO3、BFO4之間的相對(duì)距離分別為12.26，14.82；BFO3和BFO4之間的相對(duì)距離17.5，表明BFO1與其他3組的滋味差別最大，BFO3與BFO4滋味差別較大，其次是BFO2和BFO4，而BFO2和BFO3的滋味最接近。BFL1與BFL2、BFL3、BFL4之間的相對(duì)距離分別為11.61，26.35，31.95；BFL2與BFL3、BFL4之間的相對(duì)距離分別為22.14，27.1；BFL3和BFL4之間的相對(duì)距離為36.28。說明牛油酶氧化時(shí)間對(duì)OBF的整體滋味影響較大，可能與酶氧化反應(yīng)劇烈導(dǎo)致牛油組分變化較大有關(guān)(表1)[16]。

2.4 GC-MS分析OBF的揮發(fā)性化合物

采用SPME-GC-MS分析9組OBF樣品主要揮發(fā)性化合物的組成和含量如表2所示，結(jié)果顯示BFC中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類有9種，BFO1～BFO4中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類分別為14，14，12，12種，BFL1～BFL4中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類分別為6，7，7，7種。與本實(shí)驗(yàn)室前期制備的天然香辛料型牛肉調(diào)味基料[17]和微生物發(fā)酵型牛肉調(diào)味基料[18]相比，本研究采用氧化牛油進(jìn)行賦香，能夠增強(qiáng)牛肉調(diào)味基料的牛肉特征香氣，這是因?yàn)樘砑友趸Ｓ秃螅梢云胶怏w系中的含硫化合物含量，突出令人愉悅的特征肉香味[19]。

在揮發(fā)性化合物中，醛類物質(zhì)一般閾值較低，對(duì)風(fēng)味的直接貢獻(xiàn)作用較大，且具有脂肪香，是肉香味特征香氣的主要構(gòu)成部分。由表2可知，BFC中醛類物質(zhì)總相對(duì)含量為4.05%；BFO1～BFO4的醛類物質(zhì)總相對(duì)含量分別為5.81%，5.57%，2.92%，3.96%，說明一定程度(氧化1～2 h)的熱氧化牛油對(duì)OBF脂肪香氣有貢獻(xiàn)作用，氧化時(shí)間越長(zhǎng)，反而會(huì)降低體系中的醛類物質(zhì)。BFL1～BFL4的醛類物質(zhì)總相對(duì)含量分別為2.35%，4.16%，2.60%，2.23%，同樣表明并非氧化時(shí)間越長(zhǎng)越好，當(dāng)酶氧化時(shí)間2 h時(shí)，醛類物質(zhì)相對(duì)含量顯著增加，繼續(xù)氧化則會(huì)導(dǎo)致OBF中醛類物質(zhì)降低，對(duì)體系的香氣貢獻(xiàn)減小。在上述醛類物質(zhì)中，辛醛和壬醛是對(duì)牛肉香氣有重要貢獻(xiàn)作用的成分，從表2可以看出，熱氧化1，2 h時(shí)OBF中有辛醛檢出，分別為0.24%和0.61%，酶氧化則不會(huì)促進(jìn)體系中辛醛的形成。2種氧化方式對(duì)壬醛含量有影響，同樣是當(dāng)熱氧化時(shí)間為1，2 h時(shí)，OBF中可檢出壬醛，相對(duì)含量分別為1.12%和1.41%，顯著高于BFC中的壬醛含量(0.43%)。酶氧化2 h對(duì)壬醛的形成影響作用最大，占到0.62%，牛油酶氧化至3 h時(shí)體系中的壬醛含量則會(huì)降低，為0.31%。結(jié)果表明熱氧化和酶氧化時(shí)間為2 h時(shí)，對(duì)OBF體系的牛肉香氣貢獻(xiàn)最大，與酶氧化方式相比，經(jīng)熱氧化處理后的牛油制成的OBF中能夠形成一些新的香氣物質(zhì)，比如2-乙基-1-己醇、3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇、1-辛醇等風(fēng)味物質(zhì)。

圖2 電子舌對(duì)不同OBF樣品的判別因子分析

表2 OBF主要揮發(fā)性化合物的組成及含量

? “-”表示未檢出。

從表2還可看出，9組OBF樣品中的主要揮發(fā)性化合物均為4-甲基-5-羥乙基噻唑，相對(duì)含量為90.62%～96.05%，而4-甲基-5-羥乙基噻唑是硫胺素亞甲基橋裂解形成的一種食品、肉品和調(diào)味品的重要增香物質(zhì)[20]，說明脂肪氧化與否對(duì)其含量無明顯影響(P>0.05)。此外，由于4-甲基-5-羥乙基噻唑的香氣閾值較高，在水中的香氣閾值為10 800 μg/kg，而醛類物質(zhì)如辛醛、壬醛在水中的香氣閾值分別為 0.7，1.0 μg/kg，因此4-甲基-5-羥乙基噻唑?qū)BF體系的風(fēng)味貢獻(xiàn)較小。

3 結(jié)論

在牛肉調(diào)味基料制備過程中，添加4%不同氧化程度的牛油有一定的賦香作用。電子鼻、電子舌結(jié)合SPME-GC-MS檢測(cè)結(jié)果表明，熱氧化和酶氧化的牛油對(duì)OBF風(fēng)味的貢獻(xiàn)效果不同，經(jīng)加熱氧化處理的牛油對(duì)OBF的特征香氣具有重要貢獻(xiàn)作用，且牛油氧化時(shí)間越長(zhǎng)，OBF風(fēng)味差異越明顯；當(dāng)氧化時(shí)間為2 h時(shí)，氧化牛油對(duì)OBF體系的牛肉特征香氣貢獻(xiàn)最大。本試驗(yàn)未對(duì)氧化處理后的牛油風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，牛油對(duì)體系的香氣貢獻(xiàn)機(jī)制尚不清楚，下一步應(yīng)對(duì)牛油進(jìn)行進(jìn)一步分析研究其賦香機(jī)制。