孟利民 楊華 信栓力 劉吉祥 趙秀峰 劉麗軍 楊瑞波 常超

056002 邯鄲市第一醫(yī)院心內(nèi)一科

氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)和單核/巨噬細胞是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵性因素，對泡沫細胞形成、炎癥反應(yīng)、巨噬細胞凋亡、易損斑塊的破裂、壞死核心和繼發(fā)血栓的形成起重要作用，成為動脈粥樣硬化疾病治療作用靶點[1-3]。本課題組前期研究表明，重組人B型利鈉肽(recombinant human brain natriuretic peptide，rhBNP)可抑制ox-LDL誘導(dǎo)的THP-1源巨噬細胞凋亡[4]，但具體機制不明；研究發(fā)現(xiàn)，白細胞介素37(interleukin-37，IL-37)作為抗炎細胞因子，參與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[5]。因此，本研究重點探討rhBNP對ox-LDL誘導(dǎo)的THP-1源巨噬細胞氧化應(yīng)激和IL-37水平的影響，旨在為臨床尋找及應(yīng)用抑制動脈粥樣硬化的藥物提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人單核細胞系THP-1源細胞購自武漢大學(xué)；rhBNP(商品名：新活素，批號：20161228)購自成都諾迪康生物制藥有限公司。主要試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)；鏈霉素/青霉素、胎牛血清(FBS)(美國GIBCO公司)；ox-LDL試劑(廣州亦源生物科技有限公司)；H2DCF-DA熒光探針(美國Sigma公司)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malonaldehyde，MDA)試劑(南京建成生物工程研究所)；IL-37的ELISA雙抗體試劑(上海西唐生物科技有限公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 THP-1源巨噬細胞的培養(yǎng)及分組 本課題組前期研究結(jié)果[4]：人單核細胞系THP-1細胞用100 mmol/L的佛波酯孵育24～48 h，使其誘導(dǎo)分化為巨噬細胞；與50和75 μg/ml ox-LDL相比，100 μg/ml ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細胞24 h的凋亡率顯著升高，故選100 μg/ml作為ox-LDL處理THP-1源巨噬細胞的濃度；將不同濃度的rhBNP(10-7、10-8、10-9和10-10mol/L)和100 μg/ml ox-LDL分別干預(yù)THP-1源巨噬細胞24 h，結(jié)果顯示，10-9mol/L rhBNP的抑制凋亡作用最為顯著，故選10-9mol/L作為rhBNP干預(yù)ox-LDL誘導(dǎo)的THP-1源巨噬細胞的濃度。

實驗分為3組：(1)對照組：不進行任何干預(yù)，THP-1源巨噬細胞置1640培養(yǎng)基中于5%CO2、37℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育24 h；(2)100 μg/ml ox-LDL組：在實驗細胞中加入100 μg/ml ox-LDL共同孵育24 h；(3)100 μg/ml ox-LDL+10-9mol/L rhBNP組：10-9mol/L rhBNP和100 μg/ml ox-LDL共同孵育24 h。

1.2.2 共聚焦顯微鏡檢測活性氧(reactive oxygenspecies，ROS)的含量 2′，7′-Dichloroflu-orescein diacetate(H2DCF-DA)是一種專門檢測細胞內(nèi)ROS的細胞滲透熒光染料。H2DCF的熒光強度與細胞產(chǎn)生的ROS含量成正比。給予THP-1源巨噬細胞分組干預(yù)后，PBS洗滌2遍，加入終濃度為10 μM的H2DCF-DA探針，37 ℃避光30 min，去除上清液，用PBS緩沖液漂洗2遍后重懸于1 ml PBS中，之后立即用共聚焦顯微鏡檢測細胞平均熒光密度(MFI)，激發(fā)光波長為488 nm，發(fā)射光波長為525 nm，MFI值可反映細胞內(nèi)ROS變化。采用Image-Pro Plus 6.0軟件進行分析。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)檢測SOD、MDA的基因表達 采用ABI 7300系統(tǒng)行基因分析。從細胞提取RNA用于cDNA逆轉(zhuǎn)錄，參照TaKaRa說明書行RT-PCR。PCR引物設(shè)計用primer 3.0軟件，并經(jīng)GenBank校對，核實，引物序列見表1。反應(yīng)體系：SYBR 5 μL，F(xiàn)orward Primer 0.2 μL，Reverse Primer 0.2 μL，template 1 μL，dH2O 3.6 μL，SYBR Premix Ex Taq。反應(yīng)條件：(1)95℃ 30 s；(2)循環(huán)40次：95℃ 5 s， 60℃ 30 s；(3)Melt Curve 95℃ 0 s，65℃ 15 s，95℃ 0 s，每樣品3復(fù)孔，保證實驗數(shù)據(jù)的有效性。PCR結(jié)束后，以GAPDH為內(nèi)參照，計算2-ΔΔt。

表1 RT-PCR引物序列和反應(yīng)參數(shù)

1.2.4 比色方法檢測SOD活性及MDA含量 收集培養(yǎng)細胞的上清液，儲存在-70℃；采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，硫代巴比妥法測定MDA含量，嚴格按照試劑盒說明書操作。使用分光光度計檢測550 nm和532 nm的吸光度。

1.2.5 ELISA檢測細胞上清IL-37水平 取細胞培養(yǎng)液，3 000 r/min離心15 min，取上清液置-70℃冰箱保存、待測，待標(biāo)本全部收集完畢后1次測定。采用ELISA的雙抗體夾心法檢測細胞上清的IL-37水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 rhBNP抑制了ox-LDL誘導(dǎo)的ROS水平的增加

與對照組比較，100 μg/ml ox-LDL干預(yù)THP-1源巨噬細胞24 h明顯升高ROS水平(527.30%±36.20% 比100.00%±0.00%，P<0.05)；與100 μg/ml ox-LDL組相比，100 μg/ml ox-LDL+10-9mol/L rhBNP明顯降低ROS水平(237.30%±30.62% 比527.30%±36.20%，P<0.05)，見圖1。

2.2 rhBNP抑制了ox-LDL誘導(dǎo)的SOD mRNA的表達和活性降低

與對照組比較，100 μg/ml ox-LDL干預(yù)THP-1源巨噬細胞24 h明顯降低SOD mRNA的表達和活性[0.53±0.18 比1.00±0.00，(256.60±8.20)U/ml比 (355.80±9.58)U/ml；均為P<0.05]；與100 μg/ml ox-LDL組相比，100 μg/ml ox-LDL+10-9mol/L rhBNP明顯升高SOD mRNA的表達和活性[0.90±0.07 比0.53±0.18，(310.40±2.97)U/ml比 (256.60±8.20)U/ml；均為P<0.05]。

2.3 rhBNP抑制了ox-LDL誘導(dǎo)的MDA mRNA的表達和含量增加

與對照組比較，100 μg/ml ox-LDL干預(yù)THP-1源巨噬細胞24 h明顯升高MDA mRNA的表達和含量[1.59±0.23 比 1.00±0.00，(29.40±1.68)nmol/ml 比(5.94±0.51)nmol/ml；均為P<0.05]；與100 μg/ml ox-LDL組比較，100 μg/ml ox-LDL+10-9mol/L rhBNP明顯降低MDA mRNA的表達和含量[1.14±0.10 比 1.59±0.23，(20.54±1.55)nmol/ml比(29.40±1.68)nmol/ml；均為P<0.05]。

A：對照組；B：100 μg/ml ox-LDL組；C：100 μg/ml ox-LDL+10-9mol/L rhBNP組；激光共聚焦顯微鏡下細胞內(nèi)的ROS呈紅色熒光圖1 rhBNP抑制了ox-LDL誘導(dǎo)的ROS水平的增加(共聚焦顯微鏡，×200，n=3)

2.4 rhBNP抑制了ox-LDL誘導(dǎo)的IL-37水平的降低

與對照組比較，100 μg/ml ox-LDL干預(yù)THP-1源巨噬細胞24 h明顯降低IL-37水平[(48.05±3.01)ng/L 比(57.82±2.26)ng/L，P<0.05]；與100 μg/ml ox-LDL組比較，100 μg/ml ox-LDL+10-9mol/L rhBNP明顯升高IL-37水平[(53.06±1.87)ng/L 比(48.05±3.01)ng/L，P<0.05]。

3 討論

氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)貫穿了動脈粥樣硬化的始終。ox-LDL可引起內(nèi)皮損傷和功能障礙，是致動脈粥樣硬化的關(guān)鍵因素[6]，可通過參與巨噬細胞源性泡沫細胞的形成、促進細胞粘附、刺激巨噬細胞增生和分化、促進血小板粘附、聚集血栓形成、損傷內(nèi)皮細胞的機制參與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[7-8]。病變晚期，單核/巨噬細胞亦可通過促進炎癥、凋亡、脂質(zhì)沉積和斑塊破裂，形成易損斑塊的壞死核心，繼而誘發(fā)血栓形成導(dǎo)致血管堵塞，誘發(fā)急性冠脈綜合征的發(fā)生[9-10]。因此，ox-LDL及單核/巨噬細胞始終是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)和關(guān)鍵步驟，是動脈粥樣硬化疾病治療作用靶點。

rhBNP不僅可有效改善急性失代償性心力衰竭患者的癥狀和血流動力學(xué)[11]，還具有抗炎作用[12]，然而，rhBNP對動脈粥樣硬化的作用研究不多見。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，ox-LDL可誘導(dǎo)巨噬細胞凋亡，及rhBNP可能通過抑制線粒體膜電位的減少，從而抑制巨噬細胞凋亡，初步提示rhBNP具有抗動脈粥樣硬化作用，但其具體機制仍未明確[13]。

在動脈粥樣硬化病變過程中，氧化應(yīng)激可激發(fā)產(chǎn)生大量ROS，通過各種機制啟動血管周圍炎癥，并減少相關(guān)的抗氧化酶水平，損傷組織和細胞，加速細胞凋亡和促進動脈粥樣硬化的發(fā)展[14-15]。為了減輕ROS的不良作用，體內(nèi)產(chǎn)生了相關(guān)的抗氧化酶，比如SOD，為ROS清除酶家族成員之一，通過促進超氧陰離子的消除來抵抗ROS對機體的損傷[16]。此外，MDA為脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，可作為氧化應(yīng)激對組織損傷的標(biāo)志[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，rhBNP 可減輕ox-LDL誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激狀態(tài)，ox-LDL可加重巨噬細胞氧化應(yīng)激，即增加細胞內(nèi)ROS的形成和MDA的含量，但rhBNP明顯減輕了ox-LDL誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，即減少了ROS的產(chǎn)生和MDA的含量，增加SOD的活性。另外，研究表明，與對照組相比，ox-LDL組SOD mRNA表達明顯降低，MDA mRNA表達增加，而經(jīng)過rhBNP共同處理，SOD mRNA表達增加，MDA mRNA表達減少。本文從基因水平上證實了，ox-LDL可通過降低SOD mRNA水平和增加MDA mRNA水平誘導(dǎo)細胞凋亡，且rhBNP可改善這些變化。同時結(jié)果表明，抗氧化酶SOD表達的增加伴隨著MDA水平的減少。本次實驗進一步證實了rhBNP具有抗氧化應(yīng)激作用，但具體信號通路仍需進一步研究。

動脈粥樣硬化是一種免疫介導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)性疾病[18]。研究表明，單核/巨噬細胞聚集可釋放炎癥因子，進而損傷內(nèi)皮細胞，導(dǎo)致炎癥細胞聚集，參與動脈粥樣硬化的發(fā)生[19]。IL-37作為抗炎細胞因子，參與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[5]。ox-LDL是否影響巨噬細胞IL-37的分泌尚未見相關(guān)報道，而本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，ox-LDL組IL-37水平下降，提示ox-LDL抑制了巨噬細胞抗炎因子的生成；但經(jīng)rhBNP干預(yù)后，IL-37水平升高，提示rhBNP可能抑制ox-LDL誘導(dǎo)的IL-37減少，協(xié)調(diào)抗炎/促炎因子失衡，抑制炎性反應(yīng)。

綜上所述，ox-LDL可能通過增加ROS的產(chǎn)生、降低SOD的活性、增加MDA的含量、下調(diào)SOD mRNA的表達、上調(diào)MDA mRNA表達及降低IL-37水平，對巨噬細胞產(chǎn)生影響，且rhBNP可逆轉(zhuǎn)這些作用。本研究僅在細胞水平上探討rhBNP的作用，但具體通過何種途徑發(fā)揮作用，有待今后進一步的研究和探索。

利益沖突：無