鄒文斌 廖專 李兆申

海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院消化內(nèi)科，上海胰腺病研究所，上海 200433

【提要】 慢性胰腺炎(CP)是一種由遺傳、環(huán)境等因素引起的胰腺組織進(jìn)行性慢性炎癥性疾病。目前研究認(rèn)為遺傳因素在CP致病過(guò)程中起非常重要的作用，主要易感基因包括PRSS1、SPINK1、CTRC和CFTR，經(jīng)典的致病通路是胰酶-抗胰酶系統(tǒng)失衡。近年來(lái)不斷有新的易感基因和致病機(jī)制被報(bào)道，在致病變異類型和機(jī)制方面東西方差異較大。遺傳易感性、遺傳與環(huán)境的相互作用影響CP的臨床起病、病程和結(jié)局，尤其是青少年和特發(fā)性CP患者應(yīng)重視易感基因突變的篩查，對(duì)疾病預(yù)后評(píng)估和早期干預(yù)具有重要臨床指導(dǎo)意義。

慢性胰腺炎(CP)是一種由遺傳、環(huán)境等因素引起的胰腺組織進(jìn)行性慢性炎癥性疾病，其病理特征為胰腺腺泡萎縮、破壞和間質(zhì)纖維化[1]。臨床以反復(fù)發(fā)作的上腹部疼痛，胰腺內(nèi)、外分泌功能不全為主要表現(xiàn)，可伴有胰管結(jié)石、胰管狹窄和胰管不規(guī)則擴(kuò)張等。在全球范圍內(nèi)，CP雖然屬于少見(jiàn)病，但其發(fā)病率及患病率在部分地區(qū)和國(guó)家存在上升趨勢(shì)。美國(guó)CP發(fā)病率為4.4/10萬(wàn)，患病率為41.8/10萬(wàn)[2]；法國(guó)在西方國(guó)家居高位，CP發(fā)病率為7.7/10萬(wàn)，患病率為26.4/10萬(wàn)[3]。而亞洲國(guó)家中，日本CP發(fā)病率為14/10萬(wàn)，患病率為52.4/10萬(wàn)[4]；印度CP的患病率最高，超過(guò)100/10萬(wàn)[5]；我國(guó)10年前的流行病學(xué)資料顯示CP患病率約為13.5/10萬(wàn)[6]，近年來(lái)呈較快增長(zhǎng)趨勢(shì)。CP在男女性別分布上也存在差異，男性發(fā)生率高于女性2倍以上。目前認(rèn)為不論在酒精性CP還是特發(fā)性CP患者中，遺傳因素均占重要作用，常見(jiàn)易感基因包括PRSS1、SPINK1、CTRC和CFTR等。筆者所在上海長(zhǎng)海醫(yī)院牽頭一項(xiàng)大樣本研究發(fā)現(xiàn),超過(guò)50%的CP患者攜帶4個(gè)主要易感基因的罕見(jiàn)致病突變，而健康對(duì)照的攜帶率僅為5.94%(OR=16.12)[10]。近年來(lái)不斷有新的易感基因和致病機(jī)制被報(bào)道，在CP致病變異類型和機(jī)制方面中西方差異較大。

一、CP主要易感基因

目前研究認(rèn)為與CP明確相關(guān)的主要易感基因有絲氨酸蛋白酶1(serine protease 1，PRSS1)、絲氨酸肽酶抑制因子Kazal型1(serine protease inhibitor kazal-type 1，SPINK1)、糜蛋白酶C(chymotrypsin C，CTRC)和囊性纖維跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)子(cystic fibrosis transmembrane regulator，CFTR)，其中PRSS1、SPINK1 、CTRC均與胰酶依賴通路相關(guān)，包括胰酶自身激活、保護(hù)性胰酶降解或胰酶抑制因子受損。

1．PRSS1基因：PRSS1基因位于7號(hào)染色體長(zhǎng)臂，編碼陽(yáng)離子胰蛋白酶原，是人體胰液中最為常見(jiàn)的胰蛋白酶原亞型[12]。PRSS1突變屬于功能獲得型突變，與遺傳性CP密切相關(guān)，呈常染色體顯性遺傳。它可直接刺激胰蛋白酶原在胰腺內(nèi)的自身激活，即CTRC非依賴性自身激活；也可間接通過(guò)CTRC-PRSS1軸發(fā)揮作用，即CTRC依賴性自身激活。多項(xiàng)研究證實(shí)，PRSS1錯(cuò)義突變可導(dǎo)致胰蛋白酶濃度增高或自身激活增加，發(fā)生頻率排序?yàn)閜.R122H>p.N29I>p.A16V-p.R122C>p.N29T>p.V39A[13-14]。我國(guó)最為常見(jiàn)的PRSS1錯(cuò)義突變依次是p.G208A>p.R122H>p.R116C>p.N29I，其中p.G208A發(fā)生頻率近8%，總的致病突變頻率為12.9%(OR=7.0)[10]。

此外，拷貝數(shù)變異可通過(guò)基因劑量效應(yīng)增加胰酶活性。早期在法國(guó)遺傳性胰腺炎和特發(fā)性CP患者研究中發(fā)現(xiàn)，7號(hào)染色體上出現(xiàn)一段包含人胰酶家族的、長(zhǎng)為605 kb的三拷貝和雙拷貝重復(fù)[15-16]。筆者前期對(duì)我國(guó)75例青少年特發(fā)性CP患者研究中首次報(bào)道1例患者攜帶PRSS1基因5拷貝變異[17]。近期法國(guó)報(bào)道了4個(gè)不同起源位置的PRSS1雙拷貝重復(fù)變異[18]。

2．SPINK1基因：SPINK1基因位于5號(hào)染色體，編碼絲氨酸蛋白酶抑制劑Kazal 1型，也被稱為胰腺分泌胰蛋白酶抑制因子，是由胰腺腺泡細(xì)胞分泌的6.2kDa的蛋白質(zhì)，其可以有效地抑制胰蛋白酶，通過(guò)延遲胰蛋白酶原的自身激活使蛋白酶以無(wú)活性的形式從胰腺轉(zhuǎn)移到十二指腸。SPINK1表達(dá)水平降低或?qū)Ч芤后w流量減少可能會(huì)損害這種保護(hù)機(jī)制，并增加過(guò)早胰腺內(nèi)胰蛋白酶原自身激活的風(fēng)險(xiǎn)。

p.N34S是歐美人群SPINK1基因突變中研究最為常見(jiàn)和重要的突變。該突變與4個(gè)內(nèi)含子變異形成單倍體，表現(xiàn)為c.56-37T>C，c.87+268A>G，c.195-606G>A和 c.195-66_65insTTTT。最新一項(xiàng)薈萃分析顯示，p.N34S可增加白種人CP患病風(fēng)險(xiǎn)9倍，且對(duì)特發(fā)性CP的作用強(qiáng)于酒精性CP[19]。盡管人們不斷研究p.N34S突變相關(guān)單倍體型與疾病有關(guān)的功能作用，但發(fā)現(xiàn)其對(duì)胰蛋白酶的抑制或SPINK1的細(xì)胞折疊和分泌均沒(méi)有影響[20]，基本的分子機(jī)制尚不明確。近期筆者課題組在SPINK1基因上游增強(qiáng)子區(qū)域中鑒定出一個(gè)功能性SNP(rs142703147:C>A)，其作用是破壞PTF1L結(jié)合位點(diǎn)，該SNP與p.N34S存在強(qiáng)的連鎖不平衡，是潛在的致病位點(diǎn)[21]。

在亞洲人群中，最為常見(jiàn)的致病性SPINK1突變?yōu)閏.194 + 2T> C。該突變?yōu)榧艚又虏⌒酝蛔儯梢鹜怙@子3的異常跳躍，導(dǎo)致SPINK1 mRNA表達(dá)顯著降低[22]。我國(guó)c.194+2T>C的發(fā)生率高達(dá)35%以上，尤其是特發(fā)性CP患者中比例更高，增加CP患病風(fēng)險(xiǎn)40倍以上[10]。此外，筆者在外顯子[23]和內(nèi)含子區(qū)均發(fā)現(xiàn)新的致病性突變，并建立mRNA剪接分析模型，闡明多個(gè)內(nèi)含子突變的功能和臨床意義[24-25]。

3．CTRC基因：CTRC基因位于1號(hào)染色體，編碼糜蛋白酶C，可特異性降解所有人胰蛋白酶和胰蛋白酶原亞型，是防止胰酶自身激活的第二道防線[26]。中西方最常見(jiàn)的致病突變均為c.180C>T，該突變?yōu)橥x突變，不引起氨基酸改變，與c.493+52G>A存在關(guān)聯(lián)。根據(jù)ExAC數(shù)據(jù)庫(kù)，c.180C>T可引起通過(guò)改變mRNA前體剪接而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄水平下降。我國(guó)該突變的發(fā)生率為1.7%，可增加CP患病風(fēng)險(xiǎn)6.8倍[10]?；贑TRC生化活性分析和CTRC突變的功能屬性，目前存在3種解釋CTRC突變導(dǎo)致CP的發(fā)生機(jī)制：(1)酶原受損或胰酶降解[27]；(2)A型羧肽酶活化受損[27]；(3)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)[28]。

4．CFTR基因：CFTR基因位于7號(hào)染色體長(zhǎng)臂，編碼囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)子。與PRSS1、SPINK1 、CTRC基因不同的是，CFTR主要在胰腺導(dǎo)管和中心腺泡細(xì)胞中表達(dá)，參與稀釋和堿化富含蛋白的腺泡分泌物，從而阻止蛋白栓形成的功能[29]。既往認(rèn)為該基因主要導(dǎo)致囊性纖維化，近期多項(xiàng)研究提示該基因與CP密切相關(guān)，但仍存爭(zhēng)議[30]。當(dāng)CFTR發(fā)生基因突變后，缺陷CFTR蛋白不能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中正常加工，大多數(shù)不能運(yùn)送到細(xì)胞膜或者結(jié)構(gòu)異常蛋白達(dá)到細(xì)胞膜，喪失了CFTR離子通道蛋白的功能，導(dǎo)致胰腺導(dǎo)管細(xì)胞無(wú)法正常轉(zhuǎn)運(yùn)氯離子。

目前研究顯示CFTR功能丟失性突變(>1 800個(gè))中約40%為錯(cuò)義突變[31]。根據(jù)不同的致病機(jī)制， CFTR突變分為5類，Ⅰ～Ⅲ類對(duì)功能和表型影響最為嚴(yán)重，Ⅳ和Ⅴ類影響較輕[32]。其中，ΔF508屬于Ⅱ類突變，一項(xiàng)薈萃分析證實(shí)該突變與CP致病相關(guān)(OR=3.2)，且在印度人群中作用更強(qiáng)[33]。有研究認(rèn)為，引起胰腺炎發(fā)生危險(xiǎn)性增加的主要是輕度CFTR基因型，而不是重度CFTR基因型[34]。德國(guó)一項(xiàng)大樣本研究發(fā)現(xiàn)，CFTR致病突變對(duì)CP患病風(fēng)險(xiǎn)影響較小(OR=2.7)，同一基因或者不同基因的復(fù)合雜合突變發(fā)生率較低(1.4%)，說(shuō)明該基因?qū)P發(fā)生的作用較弱[35]。CFTR突變?cè)谖覈?guó)CP患者中發(fā)生率同樣較低(5.7%)，但在突變類型上與西方存在差異，總體突變累積增加患病風(fēng)險(xiǎn)3.7倍[10]。

三、CP新基因

CP是一種多基因參與的復(fù)雜疾病，除已知基因外，近年來(lái)全球各大研究中心分別報(bào)道了多個(gè)新的易感基因，主要集中在腺泡細(xì)胞特異表達(dá)的相關(guān)基因。

1．羧肽酶A1(carboxypeptidase A1，CPA1)基因：CPA1基因位于7q32.2，大約長(zhǎng)8 kb，包含10個(gè)外顯子，編碼羧肽酶A1(OMIM 114850)。羧肽酶是一種胰腺金屬蛋白酶，可水解食物多肽鏈的C-端肽鍵[36]。CPA1在人胰液中存在3種等位形式：A型羧肽酶(包括CPA1和CPA2)，可作用于經(jīng)糜蛋白酶和彈性蛋白酶活化后的芳香族和脂肪族氨基酸殘基；B型羧肽酶，可水解由胰蛋白酶裂解產(chǎn)生的Lys和Arg殘基C-端。CPA1前體由胰酶和CTRC通過(guò)剪切、降解前肽區(qū)從而被活化[37]。CPA1前體是胰液中僅次于胰蛋白酶原的第二大組成部分，占總蛋白含量的10%以上[38]。Witt等[39]首次證實(shí)CPA1可增加胰腺炎發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，可能與錯(cuò)誤折疊誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)。筆者對(duì)1 112例漢族特發(fā)性CP患者和1 580例對(duì)照組進(jìn)行CPA1基因靶向二代測(cè)序，檢測(cè)所有新發(fā)現(xiàn)變異的CPA1活性和分泌情況，共發(fā)現(xiàn)18種罕見(jiàn)的CPA1突變，按以往20% CPA1活性標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行定義，該基因突變與CP無(wú)明顯相關(guān)性；但如果將標(biāo)準(zhǔn)提高至30%以上，CPA1與中國(guó)人群CP致病相關(guān)[40]。

2．羧基酯脂肪酶(carboxyl esterlipase，CEL)基因：CEL基因位于9號(hào)染色體，編碼羧基酯脂肪酶，是一種主要在胰腺腺泡細(xì)胞中表達(dá)的糖蛋白，在十二指腸內(nèi)經(jīng)膽鹽激活，參與膽固醇和脂溶性維生素的水解和吸收[41]。Fjeld和Chen等[42]首次在歐洲人群中發(fā)現(xiàn)CEL雜合變異與CP致病相關(guān)，該變異是CEL基因與鄰近CELP形成一個(gè)雜合等位基因，導(dǎo)致脂肪酶活性下降、分泌功能受損、胞內(nèi)酶蓄積并引起自噬。筆者所在上海長(zhǎng)海醫(yī)院團(tuán)隊(duì)牽頭[43]開(kāi)展的多中心(中國(guó)、日本、印度)研究發(fā)現(xiàn)，亞洲人群中并未發(fā)現(xiàn)歐洲人群中的CEL-HYB1等位基因，而是存在一種新的類型(CEL-HYB2)，該變異在CP患者中的平均攜帶率為1.7%，與對(duì)照組無(wú)明顯差異，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)該變異發(fā)生NMD降解，提示其可能是一個(gè)種族特異的疾病危險(xiǎn)因子。

3．糜蛋白酶B(chymotrypsin B，CTRB)基因：CTRB基因位于16q23.1，該位置含有兩個(gè)相反方向且高度相似的糜蛋白酶編碼基因：CTRB1和CTRB2，兩個(gè)基因核苷酸序列具有97%一致性。糜蛋白酶B是一種胰腺腺泡細(xì)胞分泌的陰離子絲氨酸蛋白酶，起初以無(wú)活性的前體蛋白的形式存在，到達(dá)小腸后，被胰蛋白酶水解激活以產(chǎn)生功能酶。相較于CTRB1，CTRB2對(duì)PRSS2有更強(qiáng)的保護(hù)性降解的效果。

近期歐洲一項(xiàng)全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)[44]，CTRB1-CTRB2基因倒置變異增加患CP的風(fēng)險(xiǎn)，其主要標(biāo)記SNP位點(diǎn)rs8055167的OR為1.35。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，該倒置變異改變了CTRB1和CTRB2亞型的表達(dá)比率，造成CTRB1 mRNA表達(dá)增加和CTRB2 mRNA表達(dá)減少，從而減弱對(duì)保護(hù)性胰蛋白酶降解而增加胰腺炎的風(fēng)險(xiǎn)。筆者所在團(tuán)隊(duì)在中國(guó)人群中進(jìn)行了大樣本驗(yàn)證[45]，對(duì)1041例特發(fā)性CP和978例健康對(duì)照組中檢測(cè)rs8055167、rs8048956以及倒置變異，結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其分布在中國(guó)人群中幾乎都是固定的，歐洲和中國(guó)人群在CP遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素方面顯然存在顯著的種族差異。未來(lái)探索新基因需要從中國(guó)特有的人種資源來(lái)進(jìn)行測(cè)序篩選，而不應(yīng)只參照西方發(fā)現(xiàn)的致病基因。

四、基因型與臨床表型關(guān)聯(lián)分析

筆者課題組以SPINK1基因c.194+2T>C突變?yōu)橹饕獧z測(cè)點(diǎn)進(jìn)行小樣本研究，初步發(fā)現(xiàn)攜帶該突變的患者具有更為嚴(yán)重的臨床病程，如較早發(fā)生糖尿病或脂肪瀉，并影響內(nèi)鏡治療效果[46-47]。為進(jìn)一步證實(shí)該研究結(jié)論，最近課題組對(duì)1 061例漢族CP患者和1 196例對(duì)照組進(jìn)行了4個(gè)CP主要易感基因的靶向測(cè)序，為評(píng)估基因-環(huán)境相互作用，將患者分為特發(fā)性CP(715例)、酒精性CP(206例)和吸煙相關(guān)CP(140例)，使用Kaplan-Meier模型評(píng)估罕見(jiàn)致病突變對(duì)CP發(fā)病年齡和臨床結(jié)果的潛在影響，發(fā)現(xiàn)535例(50.42%)CP患者存在SPINK1、PRSS1、CTRC和或CFTR基因的罕見(jiàn)致病基因型，僅71例(5.94%)對(duì)照組中存在致病基因型(OR=16.12，P<0.001)。與突變陰性的ICP患者相比，突變陽(yáng)性患者在疾病起病，診斷胰腺結(jié)石、糖尿病和脂肪瀉時(shí)更早。致病基因型在不同亞組CP中的分布頻率也存在差異(特發(fā)性CP占57.1%，酒精性CP占39.8%，吸煙性CP占32.1%)，并影響所有亞組的疾病起病年齡和臨床預(yù)后。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)不同基因亞型對(duì)臨床病程的影響不同，以PRSS1基因p.R122H和SPINK1基因c.194+2T>C純合子突變影響最為嚴(yán)重，其次是c.194+2T>C雜合突變，PRSS1基因p.G208A突變最輕微。

綜上所述，目前研究認(rèn)為遺傳因素在CP致病過(guò)程中其非常重要的作用，主要易感基因包括PRSS1、SPINK1、CTRC和CFTR，胰酶是CP致病的核心因素，包括胰酶自身激活、保護(hù)性胰酶降解或者胰酶抑制因子受損。近年來(lái)，不斷有新的易感基因被報(bào)道，在遺傳背景方面東西方差異較大。不同致病突變類型對(duì)臨床病程的影響不同，尤其是青少年和特發(fā)性CP患者，應(yīng)重視易感基因突變的篩查，為疾病預(yù)后評(píng)估和早期干預(yù)有重要臨床指導(dǎo)意義。

利益沖突所有作者聲明不存在利益沖突