黃寶瑩，佘之蘊(yùn)，沈宏林，周臣清，王文敏

（廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，廣東 順德 528000）

0 引 言

乳酸菌是一類能發(fā)酵糖類產(chǎn)生大量乳酸的無芽孢、革蘭氏陽性球菌或桿菌細(xì)菌的總稱，是益生菌中最具代表性的菌屬之一[1]。酸乳是指以鮮牛（羊）乳或乳粉為原料，經(jīng)巴氏殺菌后接種乳酸菌，如嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌（德氏乳桿菌保加利亞亞種）發(fā)酵制成的乳制品[2]，產(chǎn)品中含有大量活乳酸菌。目前常用于發(fā)酵乳中的乳酸菌主要包含三個(gè)屬：雙歧桿菌屬、乳桿菌屬和鏈球菌屬[3]。傳統(tǒng)發(fā)酵乳主要使用德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌作為酸奶的發(fā)酵菌種[4]。乳酸菌能分解牛（羊）乳中的乳糖和蛋白質(zhì)，發(fā)酵乳中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如半乳糖、乳糖、乳酸、乳酸菌增殖因子、多種礦物質(zhì)和維生素、活性乳酸菌等[5-6]，具有緩解乳糖不耐癥[7-8]、抗氧化[9]、維持腸道菌群正常平衡[10]、防治腹瀉[11]、增強(qiáng)免疫[12]、降低膽固醇[13]等促進(jìn)人體健康作用。乳酸菌要發(fā)揮益生作用，其活菌數(shù)需要達(dá)到106CFU/g[14]。國標(biāo)GB 19302-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵乳》中規(guī)定，乳酸菌數(shù)不得低于106CFU/g（CFU/mL）[2]。

CNAS-CL07:2011《測量不確定度的要求》中規(guī)定：檢測實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定與檢測工作特點(diǎn)相適應(yīng)的測量不確定度評(píng)估程序，并將其用于不同類型的檢測工作。檢測實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有能力對(duì)每一項(xiàng)有數(shù)值要求的測量結(jié)果進(jìn)行測量不確定度評(píng)估。GB 4789.35-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》[15]于2017年6月23日實(shí)施，標(biāo)準(zhǔn)增加了乳酸菌總數(shù)培養(yǎng)條件的選擇，在原來的需氧培養(yǎng)條件下，增加了厭氧培養(yǎng)的選擇，同時(shí)將接種方式由涂布法改為傾注法，接種量由0.1 mL改為1 mL。本文對(duì)GB 4789.35-2016方法測定發(fā)酵乳中乳酸菌總數(shù)進(jìn)行不確定度評(píng)定，并確定其置信區(qū)間，為其不確定度的評(píng)定提供借鑒，保證乳酸菌總數(shù)的檢測結(jié)果在正常誤差范圍內(nèi)，證明檢測結(jié)果的正確性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：風(fēng)味發(fā)酵乳

培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基,廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；MC培養(yǎng)基,北京陸橋技術(shù)股份有限公司；氯化鈉,廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

CL-40M高壓滅菌器,日本ALP；千級(jí)潔凈室、MS3基本型旋渦混合器，德國IKA；Easymax拍擊式均質(zhì)器，AESChemunex；AnaeroPack厭氧培養(yǎng)罐，日本三菱MGC；JJ1000電子天平（感量0.01 g），常熟市雙杰測試儀器廠；GHP-9270隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法[15]

1.3.1 樣品制備

樣品的全部制備過程均應(yīng)遵循無菌操作程序，無菌生理鹽水作為稀釋液。以無菌操作稱取25 g樣品，置于225 mL稀釋液的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打2 min制成1:10的樣品稀釋液。

1.3.2 10倍系列稀釋

用1 mL無菌分度吸量管吸取1.3.1中1:10樣品稀釋液1 mL，沿管壁慢慢注入裝有9 mL稀釋液的無菌中號(hào)試管中，操作過程中分度吸量管流液口不能觸碰稀釋液，否則可能導(dǎo)致檢測結(jié)果偏高。使用旋渦混合器振搖試管1 min其混合均勻，制成1:100的樣品稀釋液。另取1 mL無菌分度吸量管，按照上述操作步驟，按10倍系列依次制備樣品稀釋液，每遞增稀釋一次，需換用新的分度吸量管。

1.3.3 嗜熱鏈球菌計(jì)數(shù)A

依據(jù)待檢樣品標(biāo)簽聲稱的乳酸菌類別和含量，估算待檢樣品中是否含有嗜熱鏈球菌及其數(shù)量，選擇（2～3）個(gè)合適的連續(xù)稀釋度，每個(gè)稀釋度吸取1 mL樣品稀釋液置于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平行。同時(shí)分別吸取1 mL空白稀釋液加入兩個(gè)無菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照。然后注入約15 mL冷卻至（48±1）℃的MC培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使之混合均勻。待培養(yǎng)基凝固后置于（36±1）℃培養(yǎng)箱中需氧培養(yǎng)（72±2）h，培養(yǎng)后計(jì)數(shù)與計(jì)算。

1.3.4 雙歧桿菌和乳桿菌計(jì)數(shù)B

依據(jù)待檢樣品標(biāo)簽聲稱的乳酸菌類別和含量，估算待檢樣品中是否含有雙歧桿菌和乳桿菌及其數(shù)量，選擇（2～3）個(gè)合適的連續(xù)稀釋度，每個(gè)稀釋度吸取1 mL樣品稀釋液置于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平行。同時(shí)分別吸取1 mL空白稀釋液加入兩個(gè)無菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照。然后注入約15mL冷卻至（48±1）℃的MRS培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使之混合均勻。待培養(yǎng)基凝固后置于（36±1）℃培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)（72±2）h，培養(yǎng)后計(jì)數(shù)與計(jì)算。

1.3.5 乳酸菌總數(shù)計(jì)數(shù)C

乳酸菌總數(shù)C為嗜熱鏈球菌計(jì)數(shù)A和雙歧桿菌和乳桿菌計(jì)數(shù)B二者結(jié)果之和，即C=A+B。嗜熱鏈球菌計(jì)數(shù)A和雙歧桿菌和乳桿菌計(jì)數(shù)B的計(jì)數(shù)范圍均為30 CFU～300 CFU之間。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)為兩個(gè)平行的平均值。

如果只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)落在計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，直接計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均數(shù)，再除以稀釋因子，得到每克中菌落總數(shù)結(jié)果，按公式（1）計(jì)算。

式中：N為樣品中的菌落數(shù)，CFU/g；∑C為兩個(gè)平板菌落數(shù)之和，CFU；d為稀釋因子。

如果有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)落在計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí)，則按公式（2）計(jì)算。

式中：N為樣品中菌落數(shù)，CFU/g；∑C為平板（包含所有落在計(jì)數(shù)范圍內(nèi)的平板）菌落數(shù)之和，CFU；n1為第一稀釋度（即低稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)；n2為第二稀釋度（即高稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)；d為稀釋因子（第一稀釋度）。

1.3.6 不確定度來源

在微生物檢測中一般認(rèn)為不確定度來源于樣品量、樣品制備、樣品種類、微生物在樣品中的分布、樣品中微生物的含量、樣品稀釋、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、計(jì)量器具校準(zhǔn)、操作人員技能等[16]。大部分微生物定量檢測不能進(jìn)行有效的不確定度評(píng)定，因?yàn)樵谖⑸锖枯^低的情況下，檢測結(jié)果接近方法的檢出限，檢測結(jié)果的重復(fù)性和再現(xiàn)性都難以保障，微生物在樣品中的分布也是不均勻的。本文只研究發(fā)酵乳單一樣品種類，樣品特點(diǎn)是乳酸菌種類相對(duì)穩(wěn)定，含量較高，一般大于106CFU/g。樣品的相對(duì)穩(wěn)定性使得不確定度評(píng)定有了基礎(chǔ)和意義。本文對(duì)影響較大的樣品制備、遞增稀釋、加樣體積和重復(fù)測量引起的不確定度進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)不確定度（不確定度分量）評(píng)估

2.1.1 樣品制備引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度（urel(制備)）

樣品制備的不確定度主要通過天平、量筒的不確定度傳播而導(dǎo)致，通常不是不確定度來源的主因。首次稀釋樣品量為25 g，加入到225 mL稀釋液中。主要由2個(gè)不確定度分量組成：稱量25 g樣品時(shí)電子天平相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度(urel(稱))和量取225 mL生理鹽水時(shí)量筒相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度(urel(量))。

（1）電子天平相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度(urel(稱))

電子天平（感量0.01 g）引入的不確定度包括示值誤差和重復(fù)性引入的不確定度。根據(jù)電子天平的檢定證書，0～50 g量程時(shí)示值最大允許誤差為±0.05 g，取均勻分布的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為重復(fù)性最大允許誤差為±0.15 g，取均勻分布的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（2）量筒相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度(urel(量))

根據(jù)JJG 196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程方法》得250 mL量出式量筒容量允差為±2.0 mL，取均勻分布的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（3）樣品制備相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度(urel(制備))

urel(稱)和(urel(量))是相互獨(dú)立的2個(gè)不確定度分量。

2.1.2 遞增稀釋引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度(urel(稀釋))

本次檢測結(jié)果MRS培養(yǎng)基和MC培養(yǎng)基均以稀釋因子為10-6的平板上的菌落總數(shù)來計(jì)數(shù)和報(bào)告。主要是由流出式的10 mL分度吸量管和1 mL分度吸量管引入的不確定度。在制備1∶100樣品勻液時(shí)，10 mL和1 mL分度吸量管分別用了1次。同樣，在制備1∶1 000樣品勻液時(shí)，10 mL和1 mL分度吸量管分別用了1次。同理類推，在10-2至10-6的10倍系列遞增稀釋過程中，10 mL和1 mL分度吸量管分別使用了5次。根據(jù)檢定證書的10 mL和1 mL分度吸量管準(zhǔn)確度等級(jí)均為A級(jí)，查JJG 196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程方法》得流出式A級(jí)10 mL和1 mL分度吸量管的容量允差分別為±0.05 mL和±0.008 mL，取均勻分布的標(biāo)準(zhǔn)不確定度得

2.1.3 加樣體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度(urel(加樣))

本次檢測結(jié)果MRS培養(yǎng)基和MC培養(yǎng)基均以稀釋因子為10-6的平板上的菌落總數(shù)來計(jì)數(shù)和報(bào)告。MRS培養(yǎng)基和MC培養(yǎng)基在10-6稀釋度分別吸取1 mL樣品稀釋液于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平行。在加樣過程中使用了1 mL分度吸量管4次。取均勻分布的標(biāo)準(zhǔn)不確定度得加樣時(shí)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.1.4 重復(fù)檢測引起的不確定度(urel(SR)）

重復(fù)檢測引起的不確定度，主要是檢測過程中多種因素作用下隨機(jī)性造成的乳酸菌總數(shù)數(shù)值不同引起的。由于微生物定量檢測結(jié)果發(fā)散性較大，一般認(rèn)為重復(fù)性檢測是不確定的的主要影響因素。由同一人員在相對(duì)恒定的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)同一待測樣品進(jìn)行連續(xù)10次的重復(fù)檢測，然后對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行不確定度分析和評(píng)定，考量重復(fù)檢測帶來的不確定度。乳酸菌數(shù)的檢測結(jié)果見表1。平板計(jì)數(shù)的結(jié)果不是正態(tài)分布而是偏態(tài)分布，將檢測數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成對(duì)數(shù)，使分布接近正態(tài)分布，然后再進(jìn)行分析。

2.2 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算

樣品制備、遞增稀釋、加樣體積和重復(fù)測量引起的不確定度是相對(duì)獨(dú)立的不確定度分量，合成不確定度為：

表1 乳酸菌數(shù)的檢測結(jié)果

2.3 擴(kuò)展不確定度

取置信概率p=95%，自由度v=10－1=9，由t分布表查得K=2.26，則擴(kuò)展不確定度為：

U=K·ucrel=2.26×5.12×10-2=0.1157

所以檢測結(jié)果的對(duì)數(shù)值范圍為：lgx=8.3716±0.1157，也就是：8.2559≤lgx≤8.4873

反對(duì)數(shù)得：180000000≤x（乳酸菌數(shù)）≤310000000

2.4 結(jié)果取值范圍

該樣品中乳酸菌數(shù)含量為x=108.3716CFU/g=235288120 CFU/g，修約后取兩位有效數(shù)字，結(jié)果為2.4×108CFU/g。檢測結(jié)果的對(duì)數(shù)值范圍為8.2559≤lgx≤8.4873，取反對(duì)數(shù)并修約取兩位有效數(shù)字后，結(jié)果取值范圍為1.8×108～3.1×108CFU/g。

3 結(jié)論

在微生物定量檢測中，不確定度的來源較為分散，且很多因素對(duì)不確定度的影響較大。樣品均勻性、樣品的性質(zhì)、保存條件、檢測環(huán)境、培養(yǎng)基質(zhì)量、稀釋液、試管、分度吸量管、均質(zhì)袋、培養(yǎng)條件（溫濕度）、培養(yǎng)時(shí)間、取樣量、人員操作等因素都會(huì)引入不確定度。平板計(jì)數(shù)法檢測乳酸菌數(shù)的結(jié)果表明，不確定度主要來源依次為：重復(fù)檢測、遞增稀釋、加樣體積和樣品制備。重復(fù)檢測引入的不確定度分量最大，這是因?yàn)槿樗峋捎肕RS培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)和MC培養(yǎng)基需氧培養(yǎng)相結(jié)合的方法，檢測過程和培養(yǎng)過程較為復(fù)雜，對(duì)操作人員技術(shù)要求較高，相比其他微生物定量檢測會(huì)產(chǎn)生更多不確定性。其次是遞增稀釋引入的不確定度，取決于樣品的微生物含量。乳酸菌數(shù)的檢測遞增稀釋次數(shù)較多，一般為6次或以上，對(duì)不確定度帶來較大影響。加樣體積和樣品制備引起的不確定度較小。通過對(duì)發(fā)酵乳中乳酸菌數(shù)的不確定度評(píng)估，明確了不確定度的主要來源，方便實(shí)驗(yàn)室有針對(duì)性的加強(qiáng)質(zhì)量管理。