曾娟妮，李文華，劉 筱，楊 敏，周雯婷，劉越飛，沈詠梅，何永恒＊＊

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院肛腸科 長(zhǎng)沙 410005；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 長(zhǎng)沙 410208；3.成都高新好醫(yī)生第一醫(yī)院 成都 610202）

慢性難愈合創(chuàng)面是指因多種外界或內(nèi)在因素引起經(jīng)治療1個(gè)月以上愈合進(jìn)展緩慢或仍未愈合的創(chuàng)面[1]。臨床中難愈合創(chuàng)面主要有糖尿病足潰瘍、肛瘺術(shù)后創(chuàng)面、壓瘡等。細(xì)胞凋亡是一種主動(dòng)的、程序性的由基因控制的細(xì)胞自主性死亡方式，可清除機(jī)體衰老、畸變或惡化細(xì)胞，是多細(xì)胞生物維系其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和內(nèi)環(huán)境功能平衡及生長(zhǎng)發(fā)育必須的最基本的生物學(xué)過(guò)程[2]。肉芽組織的形成與收縮是創(chuàng)傷恢復(fù)過(guò)程的重要內(nèi)容，在創(chuàng)面愈合中通過(guò)凋亡的方式使肉芽組織中的炎性細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等各類細(xì)胞數(shù)量減少，從而促進(jìn)傷口愈合?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡在慢性創(chuàng)面愈合過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，美洲大蠊提取物可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡（Death Effector Domain，DED），那美洲大蠊是如何作用于DED的呢？透明質(zhì)酸與蛋白聚糖是增殖細(xì)胞核遷移細(xì)胞胞外基質(zhì)的主要成分，兩者如何影響創(chuàng)面的修復(fù)？該實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Real Time-PCR觀察凋亡基因的表達(dá)、運(yùn)用Western blot檢測(cè)細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分透明質(zhì)酸與蛋白聚糖的光密度，從而進(jìn)一步探究美洲大蠊提取液對(duì)慢性難愈合創(chuàng)面的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年SPF級(jí)Wistar雄性大鼠60只（購(gòu)買于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，來(lái)源證號(hào)：43004700026384），12周齡，體質(zhì)量220 g-250 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 主要儀器設(shè)備及試劑

紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)（Lambda35，美國(guó)Perkin Elmar公司），核酸蛋白分析儀（Bio-Photometer D30，德國(guó)eppendorf公司），實(shí)時(shí)定量PCR儀（CFX Connect，美國(guó)Bio-Rad公司），Trizol（批號(hào)15596-026，美國(guó)GIBCO公司），DNA Marker（批號(hào)SM0672，F(xiàn)ermentas公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（A3500，promega公司）、Real-time PCR mix（批號(hào)4367659，thermo fisher公司），引物購(gòu)自上海生工公司。貝復(fù)濟(jì)15 mL/瓶（批號(hào)S10980075，珠海億勝生物有限公司）；美洲大蠊提取液100 mL/瓶（商品名：康復(fù)新【含有尿嘧啶、丙三醇等成分，不含透明質(zhì)酸及蛋白聚糖】[3]，批號(hào)Z51021834，四川好醫(yī)生攀西藥業(yè)有限公司）。

1.3 分組及模型制備

將SPF級(jí)Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為：急性全層皮膚缺損對(duì)照組（簡(jiǎn)稱對(duì)照組），慢性創(chuàng)面組分為模型組、美洲大蠊提取液實(shí)驗(yàn)組（簡(jiǎn)稱實(shí)驗(yàn)組）、貝復(fù)濟(jì)陽(yáng)性組（簡(jiǎn)稱陽(yáng)性組）（n=15）。全層皮膚缺損+激素法制成大鼠慢性難愈合創(chuàng)面模型[4]。20%烏拉坦（5 mL·kg-1）腹腔注射麻醉大鼠后，在其背中部脊柱兩側(cè)旁開(kāi)1 cm，距肩胛骨以下2 cm用外科方法作兩條深達(dá)筋膜、直徑為18 mm的全層皮膚缺損開(kāi)放性創(chuàng)面；造模后即刻皮下注射醋酸氫化可的松（6 mg·100 g），模型組、實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性組大鼠按上述方法制備慢性難愈合創(chuàng)面模型。對(duì)照組按前述全層皮膚缺損法制成大鼠模型，但不注射氫化可的松；

1.4 換藥及取材

各組創(chuàng)面制備后每日用相應(yīng)藥物治療，實(shí)驗(yàn)組所敷紗條用康復(fù)新液（0.2 mL/cm2），陽(yáng)性組所敷紗條用貝復(fù)濟(jì)（60 u/cm2），對(duì)照組與模型組創(chuàng)面所敷紗條用生理鹽水（0.2 mL/cm2）。各組于第3天、第8天、第15天、第20天隨機(jī)取3只大鼠取造模區(qū)深達(dá)真皮全層的創(chuàng)面組織被試管固定液中待用，所有大鼠在第20天取材后統(tǒng)一處死。

1.5 熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)

所取組織樣品投入RNAstore樣本-80℃保存液中凍存，進(jìn)行Real-Time PCR檢測(cè)。以β-action為內(nèi)參基因，模型組第3天的△CT為參照，比較各組2-△△CT差異。

1.6 Western blot檢測(cè)

圖1 bax mRNA的擴(kuò)增曲線

圖2 bcl-2 mRNA的擴(kuò)增曲線

圖3 caspase3 mRNA的擴(kuò)增曲線

第3天、第8天、第15天、第20天，每組隨機(jī)取3個(gè)樣本組織進(jìn)行Western blot檢測(cè)，用圖像分析軟件IPP6.0對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以x±s表示，滿足方差齊性檢驗(yàn)，采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法，若方差不齊，采用秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析：

2.1 PCR對(duì)bcl2、bax、caspase3的檢測(cè)

2.1.1 bax、bcl-2、caspase3、β-actin的擴(kuò)增曲線分析

bax、bcl-2、caspase3擴(kuò)增曲線圖中，CT值在20-35之間，平臺(tái)期較穩(wěn)定，拐點(diǎn)清晰，線性關(guān)系良好，B圖中bcl-2的Ct值最小最集中，純度最佳，對(duì)PCR反應(yīng)的影響最?。▓D1-3）。

2.1.2 以模型組第3天2-△△CT為參照，各組的基因表達(dá)倍數(shù)差異（表1-3）。

表1中，在第3天、第8天、第15天、第20天，模型組與對(duì)照組比較有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，模型組表達(dá)最高，對(duì)照組最低（P＜0.01）。模型組與陽(yáng)性組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，模型組高于陽(yáng)性組（P＜0.01）。模型組與實(shí)驗(yàn)組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，模型組高于實(shí)驗(yàn)組（P＜0.01）。在第3-20天，對(duì)照組與模型組組內(nèi)的表達(dá)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），實(shí)驗(yàn)組與陽(yáng)性組的愈合周期變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

表1 各組bax的2-△△CT比較（x±s）

表2 各組bcl-2的2-△△CT比較（x±s）

表3 各組caspase3的2-△△CT比較（x±s）

表2中，在第3天、第8天、第15天、第20天，對(duì)照組與模型組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，對(duì)照組表達(dá)明顯高于模型組（P＜0.01）；陽(yáng)性組與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。在第3天，實(shí)驗(yàn)組與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），第8-20天，實(shí)驗(yàn)組與模型組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，實(shí)驗(yàn)組表達(dá)均高于陽(yáng)性組（P＞0.05）。第3-20天內(nèi)，對(duì)照組的愈合周期表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），而模型組、陽(yáng)性組、實(shí)驗(yàn)組的愈合周期有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。模型組與陽(yáng)性組在第3-15天緩慢下降，至20天上升；實(shí)驗(yàn)組在第3-15天逐漸上升，至20天下降。

表3中，在第3天、第8天、第15天、第20天，模型組與對(duì)照組比較有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，模型組表達(dá)最高，對(duì)照組最低（P＜0.01）。模型組與陽(yáng)性組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，模型組高于陽(yáng)性組（P＜0.05）。模型組與實(shí)驗(yàn)組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，模型組高于實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05）。在第3-20天，對(duì)照組與模型組的周期表達(dá)變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），陽(yáng)性組與實(shí)驗(yàn)組的愈合周期變化有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，兩者第3天表達(dá)均最高，后逐漸緩慢下降（P＜0.01）。

2.3 Western blot對(duì)透明質(zhì)酸與蛋白聚糖的檢測(cè)如下圖4-6

條帶干凈清晰，無(wú)拖尾、變形、跑帶等現(xiàn)象，符合實(shí)驗(yàn)要求（圖4）。

圖5，6中，對(duì)照組與模型組的透明質(zhì)酸及蛋白聚糖比較均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，對(duì)照組的兩者表達(dá)均高于模型組（P＜0.01）。陽(yáng)性組與模型組的透明質(zhì)酸及蛋白聚糖比較均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，陽(yáng)性組的兩者表達(dá)均高于模型組（P＜0.01）。實(shí)驗(yàn)組與模型組的透明質(zhì)酸及蛋白聚糖比較均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，實(shí)驗(yàn)組的兩者表達(dá)均高于模型組（P＜0.01）。慢性創(chuàng)面3組透明質(zhì)酸及蛋白聚糖表達(dá)在第3天最高；模型組呈逐漸下降趨勢(shì)，陽(yáng)性組第8天最低，第15天逐漸升高，第20天稍下降；實(shí)驗(yàn)組第8天最低，第15天、20天逐漸升高（P＜ 0.01）。

3 討論

慢性難愈合創(chuàng)面是外科臨床的疑難病癥，具有病因復(fù)雜、病程長(zhǎng)、反復(fù)發(fā)作以及可能癌病等特點(diǎn)[5]?，F(xiàn)代研究指出凋亡是創(chuàng)面整個(gè)愈合過(guò)程中細(xì)胞數(shù)量減少的最基本、最重要的方式，也是創(chuàng)面愈合過(guò)程中非常重要的組成部分[6,7]。這些過(guò)程主要由抑制凋亡蛋白（Bcl-2）家族蛋白、半胱氨酸蛋白酶（Caspase）家族蛋白調(diào)控凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)，彼此相互制約組成一個(gè)完整、高效的凋亡機(jī)制網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)[8，9]。Bcl-2家族蛋白根據(jù)成員結(jié)構(gòu)和功能的不同可以分為抗凋亡成員（BCL-2、BCL-xL）和促進(jìn)凋亡成員（Bax、Bak、Bid、Bim 等)［10］。而bax與bcl-2分別是促進(jìn)凋亡和抑制凋亡最典型的代表基因。caspase家族蛋白酶可直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡解體，其成員中caspase3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，若被激活，將導(dǎo)致下游的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。因此，研究bcl-2/bax與caspase3在創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中的表達(dá)及調(diào)控，對(duì)探索細(xì)胞凋亡與機(jī)體組織損傷的修復(fù)及再生具有十分重要的意義。透明質(zhì)酸是一種酸性粘多糖，能調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、水電解質(zhì)擴(kuò)散及運(yùn)轉(zhuǎn)，蛋白聚糖可與細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原、纖粘連蛋白、層黏連蛋白及彈性蛋白結(jié)合，構(gòu)成組織特性的細(xì)胞外基質(zhì)，共同促進(jìn)創(chuàng)傷愈合。

圖4 蛋白聚糖與透明質(zhì)酸的條帶圖

圖5 各組創(chuàng)面中蛋白聚糖表達(dá)情況

圖6 各組創(chuàng)面中透明質(zhì)酸表達(dá)情況

本實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組與未用藥物干預(yù)的模型組比較，bax、bcl-2、caspase3表達(dá)有明顯的差異。Bax與bcl-2的比值關(guān)系決定創(chuàng)面的修復(fù)質(zhì)量，bax占優(yōu)勢(shì)細(xì)胞凋亡，bcl-2占主導(dǎo)時(shí)細(xì)胞存活[11]。模型組的bax在愈合周期內(nèi)表達(dá)均最高，第3天、第8天、第15天的表達(dá)逐漸上升，第20天較前下降，表明前中期創(chuàng)面大量細(xì)胞凋亡，損傷嚴(yán)重，后期凋亡速度減慢；對(duì)照組與模型組相比，表達(dá)較低，愈合周期內(nèi)bax的變化緩慢；陽(yáng)性組與實(shí)驗(yàn)組表達(dá)低于模型組，周期表達(dá)變化差異不明顯，處于穩(wěn)定適中水平。Bcl-2中，模型組的Bcl-2的表達(dá)較其他三組低，前中期逐漸升高，后期降低；陽(yáng)性組的表達(dá)明顯高于模型組，前期表達(dá)最高，中后期下降；實(shí)驗(yàn)組前中期表達(dá)逐漸升高，中期達(dá)到頂峰，后期下降。Caspase3中，模型組的表達(dá)均高于其他三組，愈合周期內(nèi)表達(dá)變化差異不明顯，陽(yáng)性組與實(shí)驗(yàn)組前期表達(dá)較高，而后處于持續(xù)下降的水平。結(jié)合三者基因的表達(dá)情況，對(duì)照組bax、caspase3的低表達(dá)，bcl-2高表達(dá)，表明創(chuàng)面修復(fù)進(jìn)程中細(xì)胞凋亡較少，組織輕度損傷。模型組bax與caspase3高表達(dá)，bcl2低表達(dá)，組織細(xì)胞過(guò)度凋亡，可導(dǎo)致使創(chuàng)面延遲愈合[12]。而陽(yáng)性組與實(shí)驗(yàn)組基因表達(dá)情況，優(yōu)于模型組。陽(yáng)性組bax前中期上升，后期略下降，caspase3前期表達(dá)較高，而后緩慢下降，bcl-2前中期下降，后期略上升，前中期細(xì)胞凋亡祛除壞死組織與后期抗凋亡利于組織再生使創(chuàng)面修復(fù)。實(shí)驗(yàn)組表明美洲大蠊提取液在創(chuàng)面愈合前期使bax、caspase3 RNA表達(dá)維持較高水平，加快創(chuàng)面腐肉組織脫落，中期bax、caspase3表達(dá)均緩慢下降，bcl-2上升，有利于組織的生長(zhǎng)；bax在后期表達(dá)略升高，bcl-2、caspase3下降可減少組織的過(guò)度增生避免形成瘢痕疙瘩[13]，從而促進(jìn)慢性創(chuàng)面的愈合。

實(shí)驗(yàn)組的蛋白聚糖與透明質(zhì)酸的表達(dá)明顯高于模型組。透明質(zhì)酸與蛋白聚糖在第3天左右達(dá)到旺盛，可促進(jìn)細(xì)胞遷移及增殖，使傷口炎癥反應(yīng)減輕；第8天稍降低，而后繼續(xù)上升，促進(jìn)組織的成熟和老化。表明實(shí)驗(yàn)組兩者的表達(dá)情況明顯優(yōu)于模型組。

綜上所述，美洲大蠊提取液能高效調(diào)控凋亡基因的趨勢(shì)化、提高透明質(zhì)酸、蛋白聚糖的表達(dá)，加速難愈合創(chuàng)面的修復(fù)進(jìn)程，為美洲大蠊提取液在臨床慢性創(chuàng)面的應(yīng)用提供了進(jìn)一步的科學(xué)依據(jù)。