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1.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000

肝硬化(hepatic cirrhosis)[1-2]是由一種或多種原因引起的、以肝組織彌漫性纖維化、假小葉和再生結(jié)節(jié)為組織學(xué)特征的進(jìn)行性慢性肝病，是肝臟疾病發(fā)展到中后期的必然結(jié)果，早期無(wú)明顯癥狀，后期因肝臟變形變硬、導(dǎo)致肝小葉結(jié)構(gòu)和血液循環(huán)途徑顯著改變，破壞和假小葉形成，及血管重建，肝臟逐漸變形、縮小、變硬而發(fā)展為肝硬化。肝纖維化[3](hepatic fibrosis，HF)是指由于各種致病因子致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生，肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)廣泛過(guò)度沉積的一種病理過(guò)程，是所有慢性肝病的病理基礎(chǔ)。肝纖維化[4-5]是慢性肝病的重要病理特征，是疾病發(fā)展成為肝硬化的一個(gè)必經(jīng)階段。目前，大量研究報(bào)道疾病在肝纖維化階段是可以逆轉(zhuǎn)的[6-7]。因此，在肝纖維化階段能否阻斷其繼續(xù)發(fā)展，甚至逆轉(zhuǎn)肝臟病理變化，從而防止或延緩肝硬化的發(fā)生、阻止肝癌進(jìn)一步形成，具有十分重要的臨床意義。TGF-β1和PDGF是肝臟形成纖維化過(guò)程中較為關(guān)鍵的細(xì)胞因子。導(dǎo)師廖志峰在臨床上治療早期肝硬化多用扶正化瘀抗纖方進(jìn)行加減，并取得滿意療效。本次實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)觀察扶正化瘀抗纖方對(duì)肝硬化大鼠肝臟組織中TGF-β1、PDGF表達(dá)的影響，以探索其可能的作用機(jī)制，為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 動(dòng)物 SD大鼠40只，SPF級(jí)，雄性，體重(200±20) g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)為SYXK(甘)2011-0001。分籠飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，SPF級(jí)，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，飼以標(biāo)準(zhǔn)的大鼠合成飼料，自由飲用純凈水，環(huán)境溫度( 22±2)℃，相對(duì)濕度40%～60% 。

1.2 藥物與試劑 扶正化瘀抗纖方基礎(chǔ)方：丹參30 g，蟲(chóng)草1 g，桃仁10 g，生黃芪30 g，水蛭3 g，大黃10 g，由甘肅省中醫(yī)院中藥房提供；按組方稱取藥材，用蒸餾水煎煮藥液 3 024 mL(共6周藥量)，真空包裝后置冰箱4℃冷藏。熊去氧膽酸片(國(guó)藥準(zhǔn)字：H31021950，規(guī)格50 mg/片，上海中西三維制藥有限公司)使用時(shí)以滅菌缽體研磨至細(xì)末，蒸餾水配制濃度54 g/L混懸液 1 480 mL(共6周藥量)，使用前充分搖勻。四氯化碳(批號(hào)：20120128，天津富宇精細(xì)化工有限公司)；橄欖油(批號(hào)：GB 23347，山東魯花集團(tuán)有限公司)；食用酒精(衛(wèi)生許可證號(hào)：5449419807，北京紅星股份有限公司)；I抗TGF beta1 Antibody、PDGFA Antibody(批號(hào)：P01137、P04085，甘肅瑞德生物科技有限公司)；II抗Rabbit Anti-Mouse IgG(H+L)HRP(批號(hào)：S0001，甘肅瑞德生物科技有限公司)。

1.3 儀器 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Heraeus公司)；光學(xué)顯微鏡(日本 Olympus 公司)；電泳槽、電泳儀：北京六一；恒溫式冷凍切片機(jī)(德國(guó)LEICA公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組、造模及給藥 大鼠常規(guī)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)將動(dòng)物分為對(duì)照組、模型組、扶正化瘀抗纖方組及熊去氧膽酸組，每組各10只大鼠。其中，對(duì)照組喂養(yǎng)正常大鼠飼料及飲水，模型組按照經(jīng)典復(fù)合因素并加以改進(jìn)制備肝硬化模型[8-9]，不進(jìn)行任何治療。造模成功的標(biāo)志大體上觀察可見(jiàn)大鼠毛發(fā)凌亂無(wú)光澤，食欲較差，精神萎靡活動(dòng)少，對(duì)外界刺激反應(yīng)變慢，體重較正常組相比較明顯下降，尸檢部分大鼠可見(jiàn)腹水形成，部分可見(jiàn)肝臟表面小結(jié)節(jié)形成，鏡下觀察可見(jiàn)纖維組織增生和假小葉形成；藥物劑量以成人用藥(60 kg體重)按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體形系數(shù)換算法計(jì)算，得扶正化瘀抗纖方劑量及熊去氧膽酸劑量。治療組在造模成功后即予相應(yīng)藥物干預(yù)。除對(duì)照組外，其余各組均采用30%酒精為唯一飲料，皮下注射CCl4(首次劑量給予5 mL/kg，以后每隔3 d皮下注射40%CCl4油劑3 mL/kg)，予加入0.5%膽固醇的高脂飼料喂養(yǎng)，連續(xù)6周成模。

對(duì)照組及模型組用等量生理鹽水灌胃，扶正化瘀抗纖方組按成人用藥有效劑量換算為18.9 g/kg。熊去氧膽酸組成人用藥量為10 mg/kg/d，按成人體重60 kg估算，成人每天用藥劑量6 g，按0.018換算系數(shù)計(jì)算大鼠等效劑量為0.54 g/kg，分別灌胃治療干預(yù)。

2.2 取材 治療6周后分別處死動(dòng)物取材，取材前1天下午5點(diǎn)后禁食不禁水。于當(dāng)日上午8點(diǎn)開(kāi)始，各組大鼠稱重后麻醉(按照3.5 mL/kg體重的標(biāo)準(zhǔn)腹腔注射10% 水合氯醛) ，剖腹后腹主動(dòng)脈采血，4℃靜置3 h ，4 000 r/min離心10 min，分離血清；采血后摘取大鼠肝臟，用濾紙吸取血液，生理鹽水沖洗干凈，取肝臟右葉同一部位約1 cm×1 cm×0.5 cm大小的肝臟組織放入4%多聚甲醛液中固定，以制作病理切片；再取肝臟右葉1 cm×1 cm×1 cm大小的新鮮肝臟組織放入凍存管內(nèi)，置-80℃ 超低溫冰箱保存，用于 RT-PCR備檢。

2.3 肝臟組織病理學(xué)檢查及評(píng)分 取于4% 多聚甲醛中固定24 h后的大鼠肝臟，流水沖洗30 min，然后剪成組織大小約3 mm×2 mm×3 mm，各級(jí)酒精梯度脫水，二甲苯三級(jí)透明，浸蠟包埋，石蠟切片機(jī)切片、粘片及烤片后HE染色，HE 染色步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。根據(jù)《肝臟病理診斷學(xué)》[10]標(biāo)準(zhǔn)，肝纖維化程度可分為4期：0期無(wú)病理變化；1期匯管區(qū)纖維擴(kuò)大，限小葉內(nèi)纖維化；2期匯管區(qū)纖維化，纖維間隔形成，肝小葉結(jié)構(gòu)存在；3期纖維間隔伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂，無(wú)肝硬化；4期為早期肝硬化。

2.4 RT-PCR法測(cè)定肝臟組織TGF-β1mRNA、PDGFmRNA的表達(dá)引物設(shè)計(jì) TGF-β1擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃50 s變性，退火溫度58℃，45 s，72℃，60 s反應(yīng)，40個(gè)循環(huán)，最后60℃延伸10 min，擴(kuò)增長(zhǎng)度為391 bp；PDGF擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃30 s變性，退火溫度58℃，30 s，72℃，60 s反應(yīng)，40個(gè)循環(huán)，最后60℃延伸5 min，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為284 bp；GAPDH擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃40 s變性，退火溫度59℃，50 s，72℃，90 s反應(yīng)，30個(gè)循環(huán)，最后60℃延伸10 min，長(zhǎng)度584 bp。

NameSequence(5'-3')SizeGAPDH-F5'-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3'22GAPDH-R5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3'21TGF beta'-F5'-CAACAATTCCTGGCGTTACCT-3' 21TGF beta 1-R5'-AAAGCCCTGTATTCCGTCTCC-3'21PDGF a-F5'-CTGAGGATGCCTTGGAGACAAAC-3'23PDGF a-R 5'-TCTTGCAAACTGCGGGAATG-3'20

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般狀況 在實(shí)驗(yàn)各組中，對(duì)照組大鼠的一般狀態(tài)良好，能夠正常進(jìn)食及飲水，毛色光澤，活動(dòng)、反應(yīng)靈敏，排尿正常，排便呈麥粒狀。余實(shí)驗(yàn)各組在造模過(guò)程中，飲用30%食用酒精飲料后出現(xiàn)暫時(shí)的興奮，后精神欠佳，進(jìn)食和活動(dòng)逐漸減少；模型組大鼠毛色蓬亂缺少光澤，體型消瘦，煩躁易怒，弓背喜臥，精神不振，大便較稀，飲食和進(jìn)水均劣于其他各組；熊去氧膽酸組和扶正化瘀抗纖方組精神、進(jìn)食方面較模型組好，上述情況較輕，其中扶正化瘀抗纖方組中的大鼠優(yōu)于熊去氧膽酸組。

3.2 大鼠肝臟組織病理學(xué)觀察 對(duì)照組大鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞胞質(zhì)豐富，大小排列均勻，竇狀間隙未見(jiàn)擴(kuò)張，肝板結(jié)構(gòu)清楚，呈條索狀，由中央靜脈向外放射性分布，匯管區(qū)無(wú)炎性浸潤(rùn)；模型組肝細(xì)胞索排列紊亂，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞明顯，匯管區(qū)增大，肝細(xì)胞可見(jiàn)不同程度的壞死以及較為廣泛脂肪變性，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)多發(fā)炎性浸潤(rùn)，細(xì)胞腫脹，排列擁擠，部分區(qū)域可見(jiàn)空泡，并有廣泛的纖維增生，部分纖維間隔形成；扶正化瘀抗纖方組部分可見(jiàn)細(xì)胞空泡或脂肪變性，可見(jiàn)纖維增生，未見(jiàn)纖維間隔形成；熊去氧膽酸組肝小葉結(jié)構(gòu)基本存在，有部分細(xì)胞腫脹變性，病變區(qū)域較少，炎性浸潤(rùn)明顯少于模型組。如圖1所示。

3.3 大鼠肝纖維化程度 各組大鼠肝纖維化程度結(jié)果顯示：對(duì)照組中沒(méi)有肝纖維化發(fā)生，模型組大鼠均有不同程度的肝纖維化及出現(xiàn)早期肝硬化征象；扶正化瘀抗纖方組和熊去氧膽酸組肝纖維化發(fā)生程度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同時(shí)期大鼠肝纖維化程度

3.4 RT-PCR檢測(cè)肝組織中TGF-β1mRNA及PDGF mRNA的表達(dá) RT-PCR結(jié)果顯示：對(duì)照組大鼠肝組織TGF-β1mRNA有少量表達(dá)，與各組相比，模型組中TGF-β1mRNA表達(dá)量顯著增多(P<0.01)，各治療組與模型組相比表達(dá)量明顯下調(diào)，以扶正化瘀抗纖方組與模型組相比下降最為明顯(P<0.01)，熊去氧膽酸組表達(dá)優(yōu)于各模型組(P<0.05)。對(duì)照組大鼠肝組織PDGFmRNA有少量表達(dá)，模型組的表達(dá)含量明顯高于扶正化瘀抗纖方組和熊去氧膽酸組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

組別TGF-β1mRNAPDGF mRNA對(duì)照組0.958±0.0421.011±0.179模型組4.136±0.141*5.124±0.448*扶正化瘀抗纖方組1.518±0.144△◇2.023±0.090△◇熊去氧膽酸組2.148±0.194△#2.094±0.169△#

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.05；與中藥扶正化瘀抗纖方組比較，#P<0.05；與熊去氧膽酸組比較，◇P<0.05。

4 討論

復(fù)合致病因素利用CCl4慢性中毒，高脂肪、高膽固醇、高醇飲食等因素導(dǎo)致肝臟發(fā)生炎癥，逐漸形成肝纖維化并最終發(fā)展成為肝硬化，與臨床上多種慢性肝病最終發(fā)展為肝硬化相符合[11]。肝纖維化是多種肝臟疾病的結(jié)果，肝纖維化主要是由于肝臟組織中細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的合成與降解失衡所造成。研究表明，TGF-β1在參與調(diào)控活化的細(xì)胞因子中，能夠明顯抑制肝組織正常細(xì)胞的增殖，激發(fā)肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)的活化以促進(jìn)ECM的產(chǎn)生，并可調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的凋亡，是細(xì)胞因子中導(dǎo)致肝纖維化最強(qiáng)有力的[12]。

在HSC激活的早期，PDGF表達(dá)的增加是其重要標(biāo)志，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)PDGF及其受體在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的表達(dá)明顯高于正常的肝組織，并且其活性隨肝纖維化的程度加重而升高，呈正相關(guān)[13]，因此也是肝纖維化形成過(guò)程中關(guān)鍵的細(xì)胞因子。目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為肝纖維化的形成機(jī)制是由于肝臟組織和細(xì)胞受到炎癥刺激或發(fā)生變性壞死時(shí)，肝臟中蛋白多糖、膠原等ECM的合成大于降解，使肝臟纖維組織過(guò)度沉積。其中HSC的活化可導(dǎo)致大量ECM的合成，是形成肝纖維化的中心環(huán)節(jié)[14]。若進(jìn)一步發(fā)展，則可合并肝小葉結(jié)構(gòu)的改變、再生結(jié)節(jié)及假小葉的形成，最終發(fā)展為肝硬化(liver cirrhosis,LC)。因此，如何治療甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化是治療肝臟疾病的重要環(huán)節(jié)，而TGF-β1、PDGF是目前發(fā)現(xiàn)的重要致肝纖維化因子，在HSC活化、增殖及形成ECM的過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

眾多研究發(fā)現(xiàn)表明，慢性肝病、肝纖維化的中醫(yī)病理改變中以正虛血瘀、濕熱瘀毒為主[15-18]。而扶正化瘀抗纖方為導(dǎo)師廖志峰主任醫(yī)師臨床治療肝纖維化、肝硬化的經(jīng)驗(yàn)方，是由生黃芪、桃仁、丹參、水蛭、大黃、蟲(chóng)草組成的基本方，臨床運(yùn)用多以此隨證加減。其中桃仁、水蛭破血逐瘀，軟堅(jiān)散結(jié)為君藥，生黃芪、冬蟲(chóng)夏草補(bǔ)虛損、益精氣，丹參活血化瘀，大黃蕩滌積滯共為臣藥，合方共奏破血逐瘀，補(bǔ)氣散結(jié)，軟堅(jiān)消積之功效，臨床加減運(yùn)用此方已經(jīng)取得療效確切[19]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)扶正化瘀抗纖方可明顯抑制TGF-β1 、PDGF在肝纖維化發(fā)展過(guò)程中的表達(dá)，提示其作用機(jī)制可能與抑制致纖細(xì)胞因子的表達(dá)、減少肝星狀細(xì)胞的激活，從而減少肝組織中的細(xì)胞外基質(zhì)沉積有關(guān)，最終減緩了肝纖維化的發(fā)展進(jìn)程。