郝丹，周大亮，于熙瀅，張春茹，魏林

動脈粥樣硬化是心血管系統(tǒng)疾病發(fā)生的基礎，隨著人民生活水平的不斷提高，動脈粥樣硬化的發(fā)病率有增加的趨勢，動脈粥樣硬化發(fā)生機制中內皮細胞損傷、脂質浸潤、血栓的形成等均參與其中，而血管內皮細胞損傷是動脈粥樣硬化發(fā)生的開始[1,2]。氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）是損傷血管內皮細胞的重要因素，參與動脈粥樣硬化發(fā)生的整個過程，在體外用ox-LDL處理血管內皮細胞是常用的在體外研究動脈粥樣硬化血管內皮細胞損傷的模型[3]。p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）是一個重要的信號轉導通路，在細胞的生長、凋亡等過程中具有重要作用，并且在腦缺血再灌注、糖尿病、癌癥等疾病發(fā)生中有調控功能[4-6]。研究顯示，p38MAPK在大鼠動脈粥樣硬化斑塊組織中過度磷酸化，并且在血管內皮細胞中發(fā)現(xiàn)有p38MAPK的表達[7]。本實驗擬通過體外構建ox-LDL誘導血管內皮細胞損傷模型，用p38MAPK抑制劑處理細胞，探討p38MAPK在ox-LDL誘導血管內皮細胞損傷中的作用，以期為明確動脈粥樣硬化發(fā)病機制提供基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料人臍帶靜脈血管內皮細胞HUVEC-12為美國ATCC產品；p38MAPK抑制劑SB203580、ox-LDL為美國Sigma產品；乳酸脫氫酶（LDH）含量測定試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）含量測定試劑盒、丙二醛（MDA）含量測定試劑盒均為南京建成研究所產品；山羊抗兔IgG為北京中杉產品；兔抗p38MAPK抗體、兔抗剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved Caspase-3）抗體為美國Santa Cruz產品；兔抗p-p38MAPK抗體、兔抗β-actin抗體為美國Novus產品；0.25%胰蛋白酶消化液為美國Gibco產品；膜聯(lián)蛋白 V-FITC/碘化丙啶（PI）雙染細胞凋亡檢測試劑盒為上海優(yōu)寧維產品；BCA蛋白定量試劑盒購自美國Thermo；一氧化氮（NO）含量測定試劑盒為北京索萊寶產品；細胞間黏附分子-1（ICAM-1）含量測定試劑盒、白細胞介素-1β（IL-1β）含量測定試劑盒為上?？道噬锂a品。

1.2 細胞分組及培養(yǎng)人臍帶靜脈血管內皮細胞HUVEC-12復蘇以后，添加10%胎牛血清的DMEM配制成細胞懸浮液，種植到細胞培養(yǎng)瓶中，在5% CO2培養(yǎng)箱（37℃）中培養(yǎng)約3 d以后，細胞匯合度超過80%。用0.25%的胰蛋白酶消化傳代以后，用于后續(xù)實驗研究。HUVEC-12細胞分為對照組、ox-LDL組、實驗1組、實驗2組、實驗3組，其中ox-LDL組、實驗1組、實驗2組、實驗3組在實驗時在各組細胞培養(yǎng)液中添加

100 μg/ml的ox-LDL，同時實驗1組、實驗2組、實驗3組細胞分別先用5 μmol/L、15 μmol/L、30 μmol/L p38MAPK抑制劑SB203580預處理24 h以后再添加100 μg/ml的ox-LDL的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。各組細胞在分別孵育24 h以后，進行實驗檢測。對照組細胞不做任何處理，正常培養(yǎng)。

1.3 Western blot測定各組細胞中p38MAPK磷酸化水平將對照組、ox-LDL組、實驗1組、實驗2組、實驗3組細胞中的上清吸除以后，在每組血管內皮細胞中添加PBS洗滌2次以后，加入含有1% 苯甲基磺酞氟（PMSF）的裂解液，把細胞放在冰上，孵育30 min以后，以12000 g，4℃離心20 min。取上清溶液，保存在-20℃。用BCA法蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。配制蛋白凝膠，在上樣前在蛋白樣品中添加等體積的上樣緩沖液，用沸水煮沸反應5 min。取出凝膠，用30 mA電流電轉，把凝膠上的蛋白轉移到硝酸纖維素膜上。轉膜后用5%牛血清白蛋白在室溫中封閉1 h。再把膜放在含有1:600稀釋的p38MAPK、p-p38MAPK中，放在4℃過夜后取出。再把膜放在含有1:3000稀釋的二抗溶液中，在室溫中孵育結合2 h。按照說明書配制ECL發(fā)光液，化學發(fā)光后，曝光后，Image J分析條帶灰度值。

1.4 二硝基苯肼法、硫代巴比妥酸法、黃嘌呤氧化法分別測定培養(yǎng)液上清中LDH、MDA和勻漿液中SOD含量取對照組、ox-LDL組、實驗1組、實驗2組、實驗3組細胞和培養(yǎng)液上清，分別測定培養(yǎng)液上清中LDH、MDA含量及細胞勻漿液中SOD水平，具體的操作步驟分別參照試劑盒說明書。二硝基苯肼法測定培養(yǎng)液中LDH水平：LDH可以將乳酸催化生成丙酮酸，而丙酮酸可以與2，4-二硝基苯肼結合產生丙酮酸二硝基苯腙，丙酮酸二硝基苯腙在堿性環(huán)境中呈現(xiàn)棕紅色，根據比色法計算出LDH的活性。黃嘌呤氧化法測定勻漿液中SOD活性：黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)產生大量的超氧陰離子自由基，而SOD能夠抑制超氧陰離子自由基的產生，超氧陰離子自由基可以形成亞硝酸鹽，亞硝酸鹽在經過顯色劑作用以后呈現(xiàn)紫紅色，測定其吸光度可間接反應SOD的活力。硫代巴比妥酸法測定培養(yǎng)液中MDA水平：脂質過氧化可以產生大量的MDA，而MDA與硫代巴比妥酸結合后產生紅色的產物，檢測其在532 nm的吸收峰可以間接計算出MDA含量。

1.5 流式細胞術測定細胞凋亡取對照組、ox-LDL組、實驗1組、實驗2組、實驗3組細胞，加入胰蛋白酶消化以后，用PBS把各組血管內皮細胞懸浮以后，計數(shù)。取適量的細胞懸浮液（約含有106個細胞），1000 g離心10 min，把上清溶液吸除以后，再添加200 μl的Annexin V-FITC的結合緩沖液混勻以后，添加5 μl的Annexin V-FITC和PI，用流式細胞儀測定各組血管內皮細胞凋亡情況。同時收集各組細胞，用Western blot法測定各組細胞中Cleaved Caspase-3蛋白水平，以β-actin為內參，步驟同上。

1.6 比色法測定培養(yǎng)液中NO含量NO釋放以后可以變成NO2-和NO3-，而鎘粉可以把NO3-還原成NO2-，NO2-能夠同Griess反應產生有色的化合物，用分光光度計測定其在540 nm的吸光度，根據吸光度計算NO2-含量可以間接反應NO水平。取對照組、ox-LDL組、實驗1組、實驗2組、實驗3組細胞培養(yǎng)液，按照試劑盒步驟操作檢測NO含量。

1.7 ELISA法測定培養(yǎng)液中ICAM-1、IL-1β含量取對照組、ox-LDL組、實驗1組、實驗2組、實驗3組細胞培養(yǎng)液上清，用ELISA法測定培養(yǎng)液上清中ICAM-1、IL-1β含量，步驟參照各試劑盒說明書。

1.8 統(tǒng)計學分析所得的實驗數(shù)據均用軟件SPSS 21.0進行統(tǒng)計分析，計量資料以平均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組差異的比較用單因素方差分析，組間比較用LSD-t檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 p38MAPK抑制劑降低ox-LDL作用后的血管內皮細胞中p38MAPK磷酸化水平ox-LDL組細胞中的p38MAPK蛋白磷酸化水平高于對照組（P＜0.05）。ox-LDL誘導血管內皮細胞中p38MAPK蛋白磷酸化。而用p38MAPK抑制劑處理以后，各組細胞中的p38MAPK蛋白磷酸化水平均低于ox-LDL組（P＜0.05），并且隨著p38MAPK抑制劑作用濃度的升高，細胞中p38MAPK蛋白磷酸化水平降低（表1，圖1）。

2.2 p38MAPK抑制劑降低ox-LDL作用后的血管內皮細胞氧化損傷ox-LDL組細胞培養(yǎng)液中LDH、MDA水平高于對照組（P＜0.05），而細胞勻漿液中SOD水平低于對照組（P＜0.05）。ox-LDL誘導血管內皮細胞氧化損傷。而用p38MAPK抑制劑處理以后，各組細胞培養(yǎng)液中LDH、MDA水平均低于ox-LDL組，勻漿液中SOD水平高于ox-LDL組（P＜0.05），并且隨著p38MAPK抑制劑作用濃度的升高細胞培養(yǎng)液中LDH、MDA水平逐漸降低，勻漿液中的SOD水平逐漸升高（表2）。

2.3 p38MAPK抑制劑降低ox-LDL作用后的血管內皮細胞凋亡水平ox-LDL組細胞凋亡率和Cleaved Caspase-3/β-actin水平高于對照組（P＜0.05）（圖2、表3）。ox-LDL誘導血管內皮細胞凋亡。而用p38MAPK抑制劑處理以后，各組細胞凋亡率和Cleaved Caspase-3/β-actin水平均低于ox-LDL組（P＜0.05），且隨p38MAPK抑制劑作用濃度的升高細胞凋亡率和Cleaved Caspase-3/β-actin水平逐漸降低（表2）。

表1 各組血管內皮細胞中p38MAPK蛋白磷酸化水平（x±s）

圖1 Western blot測定各組血管內皮細胞中p38MAPK蛋白磷酸化水平

2.4 p38MAPK抑制劑促進ox-LDL作用后的血管內皮細胞合成NOox-LDL組細胞培養(yǎng)液中NO水平低于對照組（P＜0.05）。ox-LDL減少血管內皮細胞合成NO。而用p38MAPK抑制劑處理以后，各組細胞培養(yǎng)液中NO水平均高于ox-LDL組（P＜0.05），并且隨著p38MAPK抑制劑作用濃度的升高細胞分泌的NO水平逐漸升高（表4）。

2.5 p38MAPK抑制劑減少ox-LDL作用后的血管內皮細胞分泌ICAM-1、IL-1βox-LDL組細胞培養(yǎng)液中ICAM-1、IL-1β水平高于對照組（P＜0.05）。ox-LDL誘導血管內皮細胞合成黏附因子ICAM-1和炎癥因子IL-1β。而用p38MAPK抑制劑處理以后，各組細胞培養(yǎng)液中ICAM-1、IL-1β水平均低于ox-LDL組（P＜0.05），并且隨著p38MAPK抑制劑作用濃度的升高細胞分泌的ICAM-1、IL-1β水平逐漸降低（表5）。

表2 各組血管內皮細胞培養(yǎng)液中LDH、MDA和勻漿液中SOD水平（x±s）

圖2 各組血管內皮細胞凋亡及Cleaved Caspase-3水平檢測

表3 各組血管內皮細胞凋亡及Cleaved Caspase-3水平（x±s）

3 討論

動脈粥樣硬化的發(fā)生是一種發(fā)生于動脈組織的慢性疾病，高血壓、吸煙、肥胖等都是其發(fā)生的危險因素，血管內皮細胞功能損傷是動脈粥樣硬化發(fā)生的早期表現(xiàn)[8]。血管內皮細胞具有強大的內分泌功能，其具有傳遞信號、調節(jié)血管張力、調控血管壁的通透性、維持凝血功能等多種生物學作用[9]。ox-LDL作為一種重要的血管內皮損傷因子，其表達水平升高后可以促進動脈粥樣硬化的發(fā)生，ox-LDL可促進血管內皮細胞氧化損傷，誘導血管內皮細胞凋亡，是一種常用的體外研究動脈粥樣硬化的誘導因子[10,11]。

表4 各組血管內皮細胞培養(yǎng)液中NO含量（x±s）

表5 各組血管內皮細胞分泌的 ICAM-1、IL-1β水平（x±s）

p38MAPK是MAPK的一員，在血管內皮細胞損傷中具有重要作用。研究顯示，在血管內皮細胞受到過氧化氫刺激以后，細胞中的p38MAPK磷酸化水平升高，用杜鵑素處理后可減少血管內皮細胞氧化損傷，減少細胞凋亡，減弱p38MAPK的磷酸化[12]。在研究腦中風血管內皮細胞中發(fā)現(xiàn)，缺氧再灌注可以激活p38MAPK信號通路誘導細胞凋亡的發(fā)生[13]。近年來的研究表明，p38MAPK在動脈粥樣硬化中過度激活，用ox-LDL處理可誘導細胞內p38MAPK的過度磷酸化[14,15]。本實驗結果表明，ox-LDL處理以后的血管內皮細胞中p38MAPK磷酸化增多，這與上述實驗報道相符合。同時本實驗還表明，p38MAPK抑制劑預處理以后的血管內皮細胞經ox-LDL誘導后，細胞凋亡水平有所下降，細胞中凋亡執(zhí)行因子Caspase-3的活化水平降低，說明抑制p38MAPK可以減弱ox-LDL誘導的血管內皮細胞凋亡。

ox-LDL在動脈粥樣硬化組織中大量聚集，其可以促進內皮細胞中合成NO的酶移位，減少NO的合成和釋放，NO是一種血管舒張因子，能夠維持血管內皮的完整性，其可以抵抗血栓的形成、減少血小板聚集，同時NO還具有阻礙內皮細胞同單核細胞之間黏附的功能[16-18]。ICAM-1存在于血管內皮細胞、白細胞、上皮細胞等多種細胞的表面，其可以促進單核細胞與內皮細胞的黏附和遷移，是促動脈粥樣硬化發(fā)生因子[19]。MDA是脂質發(fā)生過氧化以后產生的一種分解產物，是常見的檢測脂質過氧化程度的一種指標[20]。SOD是唯一一個能夠特異性的清除體內氧自由基的金屬酶分子，其可以維持機體內的氧自由基的平衡，而氧自由基可以誘導血管內皮細胞損傷，是重要的抗動脈粥樣硬化發(fā)生的因子之一[21,22]。LDH原本存在于內皮細胞內，在細胞受到損傷以后，細胞的通透性發(fā)生改變，使的細胞內的LDH向細胞外漏出，檢測LDH釋放水平可以反映出細胞膜的損傷程度[23,24]。本實驗結果表明，ox-LDL處理以后的血管內皮細胞釋放的LDH、MDA水平增加，而SOD水平減少，細胞合成的NO水平降低，細胞分泌的黏附因子ICAM-1和炎癥因子IL-1β水平均增加，說明ox-LDL造成了血管內皮細胞氧化損傷，增加了炎癥因子和黏附因子的釋放，而抑制p38MAPK后的血管內皮細胞釋放的LDH、MDA減少，合成NO增加，細胞分泌的黏附因子ICAM-1和炎癥因子IL-1β減少，說明抑制p38MAPK可以減弱ox-LDL誘導的血管內皮細胞氧化損傷，減少單核細胞和內皮細胞的黏附，減輕炎癥反應。

p38MAPK在動脈粥樣硬化中過度磷酸化，抑制p38MAPK可以減弱ox-LDL誘導的血管內皮細胞氧化損傷，減少細胞凋亡，減輕炎癥反應，減少單核細胞和內皮細胞的黏附，發(fā)揮保護作用，這提示p38MAPK在動脈粥樣硬化血管內皮損傷中具有重要作用，在以后的實驗中會對其具體的機制進行探討。