柯瑾 梁玲 周田婷 朱培芳 喬宏亮 熊磊

摘要：目的建立廣藿香揮發(fā)油提取和包合工藝條件。方法采用L9（3）4正交設(shè)計(jì)法對(duì)揮發(fā)油的提取和包合工藝進(jìn)行考察。結(jié)果香訶止瀉顆粒劑廣藿香揮發(fā)油提取工藝優(yōu)化為：浸泡4 h，加10倍水，回流提取8 h;揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合工藝優(yōu)化為：揮發(fā)油按1∶20（V/V）比例用乙醇溶解，揮發(fā)油與β-環(huán)糊精包合的比例為1∶8，揮發(fā)油醇溶液緩慢加入8%的β-CD溶液，55 ℃超聲包合2 h。結(jié)論優(yōu)化的提取和包合工藝合理、可行、穩(wěn)定可控，可為申報(bào)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：香訶止瀉顆粒劑;廣藿香酮;β-環(huán)糊精包合（β-CD）

中圖分類號(hào)：R2842? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B? ? 文章編號(hào)：1007-2349（2018）06-0068-05

Study on Extraction and Inclusion Process of Volatile Oil from Xianghe Anti-diarrhea Granules

KE Jin1，Liang Ling1，ZHOU Tian-ting2，ZHU Pei-fang1，QIAO Hong-liang3，XIONG Lei1

（1 .Yunnan University of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650500，China;

2 .Puer Songsao Grass Six Flavors Pharmaceutical Co ，Ltd ，Puer 665000，China;

3. Jilin Zixin Hannya Pharmaceutical Co ，Ltd ，Qingshi132300，China）

【Abstract】Objective：To establish the extraction and inclusion conditions for the volatile oil of patchouli Methods：L9（3）4 orthogonal design method was used to investigate the extraction and inclusion of volatile oil Results：The optimal extraction process of the volatile oil of patchouli from Xianghe anti-diarrhea granules was as follows：soak for 4 h，add 10 times water and reflux for 8 h The optimal inclusion process of the volatile oil of β-cyclodextrin was as follows：volatile oil at 1：20（V/V）dissolved by ethanol，the 1：8 of ratio of volatile oil to β-cyclodextrin，followed by slowly adding 8% of β-cyclodextrin solution for 2 hours of inclusion at 55°C ultrasound condition Conclusion：The optimal extraction and inclusion process is reasonable，feasible，stable and controllable，and can lay the foundation for applying pharmaceutical agents

【Key words】Xianghe anti-diarrhea granules，patchosterone，β-cyclodextrin inclusion（β-CD）

香訶止瀉顆粒劑源于云南省名中醫(yī)熊磊治療小兒泄瀉的臨床效驗(yàn)方，臨床療效確切。本方具芳香化濕、運(yùn)脾止瀉之功，主治小兒脾氣不運(yùn)、濕濁內(nèi)阻之泄瀉[1]。由云南主產(chǎn)藥材藿香、葛根、訶子、石榴皮等9味中藥組成。中醫(yī)認(rèn)為，泄瀉病變主要在脾胃，尤其與脾的運(yùn)化功能失調(diào)關(guān)系密切[2]。脾主升清，胃主降濁，若脾胃失常，清氣不升，濁氣不降，清濁相并，下走大腸則至泄瀉。前人亦有“無(wú)濕不成瀉”、“濕多成五瀉”之說(shuō)，故治療上總以運(yùn)脾化濕為基本原則[3]。

香訶止瀉湯中廣藿香味辛、性微溫、入脾胃經(jīng)，具有芳香化濁，化濕止嘔之功[4];訶子性平、味酸澀，酸能收斂，澀能止瀉[5]，與廣藿香共為君藥，兩藥相配，共湊健脾化濕、溫胃化濁、澀腸止瀉之功，且有標(biāo)本兼治之妙。葛根味辛甘、性涼，入脾胃經(jīng)，具有生津止渴，升陽(yáng)止瀉之功[6]，茯苓健脾利水滲濕[7]，車前子滲濕止瀉，能“利小便實(shí)大便”[8]，三藥共為臣藥。其余藥物能行氣、化濕、消痞，分別針對(duì)嘔吐、痞脹、疼痛等泄瀉伴隨癥狀起輔助治療作用。諸藥合用，共湊健脾除濕、運(yùn)脾化濁、行氣止痛、溫中固澀之效，使?jié)袢テ⑦\(yùn)則腹瀉自愈。

劑型選擇為療效確切、服用方便、便于攜帶、成本低、口感好、兒童順應(yīng)性好的顆粒劑，既保持了傳統(tǒng)的中醫(yī)藥用藥特色，又能最大限度地提取并保留處方中藥揮發(fā)油不在煎煮過(guò)程中的揮散，本研究對(duì)方中君藥廣藿香揮發(fā)油的提取和包合進(jìn)行研究。

1 儀器與試藥

1.1.儀器Agilent1200高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）;C18色譜柱（ZOR BAX SAX-C18 46×250 mm，5 μm）;萬(wàn)分之一分析天平（上海菁海儀器有限公司）;電子秤（余姚市金諾天平儀器有限公司）;超聲波清洗機(jī)（YL-040S型，上海冠特超聲儀器有限公司）;電子調(diào)溫電熱套（PHTW型，鞏義市器華儀器有限責(zé)任公司）;多頭磁力加熱攪拌器（HJ-4B型，常州國(guó)華電器有限公司），電熱恒溫干燥箱（DHG-9071A型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2.藥材與試劑廣藿香選用《中國(guó)藥典》（2015版一部）收載的正品（批號(hào)：150201），購(gòu)自云南泰華豐功藥業(yè)有限公司。β-CD（純度≥990%，上海瑞永生物科技有限公司）;廣藿香酮（純度>98%，批號(hào)為151014，成都普菲德生物技術(shù)有限公司）。乙腈（色譜純，默克股份兩合公司;磷酸、乙醇（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）;純凈水（娃哈哈公司）。

1.3.試驗(yàn)方法

1.3.1.廣藿香酮含量測(cè)定方法研究[10]

1.3.1.1.色譜條件色譜柱：C18色譜柱（ZOR BAX SAX-C18，46×250 mm，5 μm）流動(dòng)相：乙腈-02%磷酸溶液（60∶40，V/V），等度洗脫15 min;檢測(cè)波長(zhǎng)：310 nm;流速：1 mL/min;柱溫：35 ℃。

1.3.1.2.對(duì)照品溶液的制備取廣藿香酮適量，加乙醇制成1 mL含22 μg的溶液，045 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

1.3.1.3.供試品溶液的制備取廣藿香油適量，加乙醇制成1 mL含500 μg的供試品溶液，045 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

1.3.1..4線性關(guān)系考察精密吸取對(duì)照品溶液1，2，4，8，12，16，20 μL，測(cè)定峰面積，以峰面積（Y）對(duì)進(jìn)樣量μg（X）進(jìn)行線性回歸。

1.3.1.5.精密度考察精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)測(cè)定6次，記錄峰面積。

1.3.1.6.重現(xiàn)性考察取適量廣藿香油，按供試品溶液制備方法平行操作6份，測(cè)定廣藿香酮峰面積，計(jì)算廣藿香酮含量。

1.3.1.7.穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取同一供試品溶液，于0，2，4，8，12 h分別進(jìn)樣，測(cè)定并記錄峰面積。

1.3.1.8.加樣回收率試驗(yàn)同一批廣藿香油（含量：365%）取6份，每份005 g，精密稱定。分別精密加入一定量的廣藿香酮對(duì)照品溶液（約為樣品中廣藿香酮含量的10倍量），按供試品溶液制備方法制備樣品，分別測(cè)定廣藿香酮峰面積，計(jì)算回收率。

1.3.1.9.耐用性考察改變柱溫、流速、波長(zhǎng)、流動(dòng)相比例，考察峰面積的差異。

樣品的測(cè)定 取3份樣品，每份01 g，按供試品溶液制備方法制備樣品，測(cè)定樣品中廣藿香酮的含量。

1.3.2.揮發(fā)油提取工藝研究[11]

1.3.2.1.揮發(fā)油提取率考察廣藿香750 g，8倍量水，浸泡8 h，從出第一滴蒸餾水開(kāi)始計(jì)時(shí)，記錄不同時(shí)間點(diǎn)揮發(fā)油體積并計(jì)算提取率（揮發(fā)油提取率（%）=揮發(fā)油收得量（ mL）/藥材重量（g）×100）。

1.3.2.2.提取工藝正交考察經(jīng)預(yù)試驗(yàn)，以廣藿香油中廣藿香酮的含量和揮發(fā)油提取率為綜合評(píng)分指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，篩選藥材浸泡時(shí)間，加水量以及提取時(shí)間條件，以確定最佳提取條件，因素水平見(jiàn)表1。（綜合評(píng)分=廣藿香酮的含量/0289×30%+揮發(fā)油得率/001×70%）

1.3.2.3.驗(yàn)證試驗(yàn)取同一批廣藿香3份，每份200 g，加10倍水，浸泡4 h，提取8 h，測(cè)定揮發(fā)油提取率和廣藿香酮含量。

1.3.3.揮發(fā)油包合工藝研究[12]

1.3.3.1.包合物中揮發(fā)油的測(cè)定將已稱定重量的包合物置于圓底燒瓶中，加入200 mL蒸餾水，連接揮發(fā)油提取器。按2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》（四部）通則目次2204揮發(fā)油測(cè)定法項(xiàng)下操作，讀取揮發(fā)油體積，計(jì)算包合物的揮發(fā)油包封率（包封率（%）=包合物中揮發(fā)油回收量（ mL）/（揮發(fā)油加入量（ mL）×空白回收率）×100）。

1.3.3.2.揮發(fā)油空白回收率的測(cè)定量取揮發(fā)油10 mL，置于圓底燒瓶中，加入200 mL蒸餾水，按“222”方法蒸餾，記錄揮發(fā)油體積，計(jì)算空白回收率（空白回收率（%）=揮發(fā)油回收量（ mL）/量取揮發(fā)油量（ mL）×100）。

1.3.3.3.包合方法的篩選取2份β-CD制成8%的飽和水溶液，將1 mL廣藿香揮發(fā)油用20 mL乙醇溶解，恒溫50℃下分別在電動(dòng)攪拌、超聲狀態(tài)下將揮發(fā)油乙醇溶液慢慢滴入β-CD飽和水溶液中，包合2 h。待包合溶液冷卻至室溫后，放入冰箱冷藏過(guò)夜，抽濾，包合物用少量乙醇多次洗滌，置恒溫烘箱中（40℃）下干燥24 h，稱重，計(jì)算包合物得率和包封率

1.3.3.4.乙醇濃度的考察取1 mL廣藿香揮發(fā)油3份，分別用無(wú)水乙醇、乙醇、90%乙醇20 mL溶解，恒溫50℃下加入8%β-CD飽和溶液，超聲法包合2 h，計(jì)算得率和包封率。

1.3.3.5.乙醇用量的考察將1 mL廣藿香揮發(fā)油分別用10 mL、15 mL、20 mL乙醇溶解，照“1334”制備包合物，計(jì)算得率和包封率。

1.3.3.6.廣藿香揮發(fā)油包合的正交試驗(yàn)經(jīng)初步試驗(yàn)，以揮發(fā)油包封率為指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，篩選揮發(fā)油與β-CD的比例、β-CD的濃度、包合溫度、包合時(shí)間條件，以確定最佳包合條件，因素水平表見(jiàn)表2

1.3.3.7.驗(yàn)證試驗(yàn)稱取3份β-CD于錐形瓶中，照“1336”篩選最佳條件進(jìn)行包合，測(cè)定揮發(fā)油回收量，計(jì)算得率和包封率。

2 結(jié)果與分析

2.1.廣藿香揮發(fā)油提取工藝研究

2.1.1.廣藿香酮含量測(cè)定方法研究

2.1.1.1.線性關(guān)系考察線性回歸方程為：Y=68838X-45596，r =1。表明廣藿香酮進(jìn)樣量在00224～0448 μg時(shí)，其與峰面積呈良好的線性關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.1.1.2.精密度考察6次測(cè)定廣藿香酮峰面積RSD為018%，表明儀器精密度良好。

2.1.1.3.重復(fù)性考察廣藿香酮含量計(jì)算RSD為115%，廣藿香酮平均含量為365%，表面該方法重現(xiàn)性良好。

2.1.1.4.穩(wěn)定性考察 以廣藿香酮的峰面積計(jì)算RSD為033%，表明供試品溶液0～12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.1.5.加樣回收率考察平均回收率為9724%，RSD為175%。

2.1.1.6.耐受性考察該方法耐受性良好，結(jié)果見(jiàn)表3：

因?yàn)闄z測(cè)器屬于濃度型檢測(cè)器，當(dāng)樣品量一定時(shí)，檢測(cè)器瞬間響應(yīng)，峰高響應(yīng)值與流動(dòng)相流速無(wú)關(guān)，峰面積響應(yīng)值與流動(dòng)相流速成反比，峰面積與流速乘積為常數(shù);且08×8378≈12×5592，所以，該方法耐用性好。

2.1.1.7.樣品測(cè)定三批樣品廣藿香酮含量分別為364%、365%和365%，說(shuō)明該方法穩(wěn)定可控。

2.2.揮發(fā)油提取工藝研究

2.2.1.廣藿香揮發(fā)油提取率考察由表4和圖4可知藿香揮發(fā)油在提取8h以后就不再出油，所以在提取工藝研究中設(shè)8 h為最長(zhǎng)的提取時(shí)間。

2.2.2.揮發(fā)油提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果由表5可知B>C>A，由此可見(jiàn)提取時(shí)間對(duì)揮發(fā)油得率和藿香油的廣藿香酮含量影響較大;初步確定最佳提取條件為A1B3C2，即浸泡時(shí)間為4 h，提取時(shí)間為8 h，加水量為10倍量。

2.2.3.驗(yàn)證試驗(yàn)三批樣品揮發(fā)油得率分別為08%、08%、08%，廣藿香酮含量分別為258%、256%、258%，說(shuō)明此提取條件穩(wěn)定可行。

2.3.揮發(fā)油包合工藝研究

2.3.1.揮發(fā)油空白回收率考察本實(shí)驗(yàn)空白回收率為90%。

2.3.2.包合方法考察超聲法的包合效果比電動(dòng)攪拌法稍好，所以采用超聲法包合結(jié)果見(jiàn)表6。

2.3.4.乙醇濃度考察用乙醇溶解揮發(fā)油制備包合物的包封率高于用90%乙醇和無(wú)水乙醇，因此，選擇乙醇作廣藿香揮發(fā)油溶劑，結(jié)果見(jiàn)表7。

2.3.5.乙醇用量考察將1 mL揮發(fā)油用20 mL乙醇溶解包合效果最佳，因此確定為包合條件，結(jié)果見(jiàn)表8。

2.3.6.正交試驗(yàn)結(jié)果由表9可知，A>B>C>D，因此得出結(jié)論：各因素對(duì)包合物揮發(fā)油包封率的影響大小為：揮發(fā)油與β-CD比例>β-CD濃度>包合溫度>包合時(shí)間。確定最佳包合條件為A3B1C3D3，即最佳包合條件為揮發(fā)油：β-CD為1：8，β-CD濃度為8%，55℃包合2h。

2.3.7.驗(yàn)證試驗(yàn)該包合條件較穩(wěn)定，結(jié)果見(jiàn)表10。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究建立了香訶止瀉顆粒劑揮發(fā)油提取及包合工藝。通過(guò)正交試驗(yàn)篩選，確定香訶止瀉顆粒劑廣藿香揮發(fā)油提取工藝為：浸泡4 h，加10倍水，回流提取8 h;揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合工藝為：揮發(fā)油按1：20（V/V）比例用乙醇溶解，揮發(fā)油與β-環(huán)糊精包合的比例為1∶8，揮發(fā)油醇溶液緩慢加入8%的β-CD溶液，55 ℃超聲包合2 h。本工藝條件合理穩(wěn)定可控，為制劑研發(fā)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]聶堅(jiān)，謝宇環(huán)，陳柏君，等芳香類中藥在兒科臨床運(yùn)用及展望[J].云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，38（2）：87-100

[2]盧潤(rùn)生，石巖，楊宇峰論脾陽(yáng)不足致小兒泄瀉[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，19（1）：129-131

[3]葛濤濤，鄒勝男楊季國(guó)教授治療小兒泄瀉四法經(jīng)驗(yàn)[J].中醫(yī)兒科雜志，2016，12（4）：15-17

[4]徐雯，吳艷清，丁浩然廣藿香的藥理作用及機(jī)制研究進(jìn)展[J].上海中醫(yī)藥雜志，2017，51（10）：103-106

[5]王嘉倫，王培杰，易智威，等訶子的化學(xué)成分、藥理作用及炮制配伍應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥信息，2016，33（3）：123-126

[6]李昕，潘俊嫻，陳士國(guó)，等葛根化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2017，17（9）：189-194

[7]張鐘媛茯苓藥理作用研究進(jìn)展[J].繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育，2015，29（5）：108-109

[8]鄭秀棉，楊莉，王錚濤車前子的化學(xué)成分與藥理活性研究進(jìn)展[J].中藥材，2013，36（7）：1190-1196

[9]陳春玲，史雪敏中藥顆粒劑的發(fā)展現(xiàn)狀與未來(lái)趨勢(shì)[J].臨床醫(yī)藥文獻(xiàn)雜志，2017，4（54）：10662-10663

[10]陳海明，易宇陽(yáng)，彭紹忠，等高效液相色譜法測(cè)定廣藿香中廣藿香酮的含量[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，（6）：645-647

[11]王星星，李淼，康小東，等辛夷、紫蘇混合揮發(fā)油提取與包合工藝研究[J].藥學(xué)與臨床研究，2016，（3）：238-241

[12]黃敏，黃艷仙，蔣達(dá)洪，等β-環(huán)糊精超聲包合廣藿香揮發(fā)油的工藝研究[J].安徽大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，（4）：86-90