趙建清 王 杰 李 娜 高慶華, 3*

(1 塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300)(2 塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300)(3 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300)

無(wú)動(dòng)物源性添加劑稀釋液的研究，可以提高無(wú)動(dòng)物源性稀釋液的長(zhǎng)期保存效果，以及對(duì)研發(fā)不含動(dòng)物源物質(zhì)的羊低溫保存精液的新型稀釋液有很大幫助。無(wú)動(dòng)物源性稀釋液易制成粉劑，降低保存條件，減少成本,且成分明確，即非動(dòng)物源性添加劑稀釋液是今后研究的大方向。因?yàn)楹芏嘈袠I(yè)已經(jīng)制定了相關(guān)政策，限制使用動(dòng)物性原料[1]。而傳統(tǒng)綿羊精液低溫保存稀釋液主要是以動(dòng)物源性(卵黃)為抗冷保護(hù)劑，含動(dòng)物源的精液保存液雖有比較理想的保護(hù)效果,卻也有一定的弊端。國(guó)外有研究稱(chēng)精液稀釋液中的卵黃會(huì)與一種來(lái)自尿道球腺的蛋黃凝固酶發(fā)生作用，不利于精子細(xì)胞生存[2-3]。卵黃中對(duì)精子起保護(hù)作用的主要是卵磷脂[4-6]，研究以大豆卵磷脂(SL)替代卵黃的稀釋液，成為了現(xiàn)階段研究的熱點(diǎn)。大豆卵磷脂稀釋液不僅成分確定，而且適合規(guī)模化生產(chǎn)。目前綿羊精液稀釋液中添加大豆卵磷脂的報(bào)道較少，也還沒(méi)有統(tǒng)一的添加量，卵黃中卵磷脂的含量約為10%[7]，實(shí)驗(yàn)室TRIS專(zhuān)利卵黃稀釋液中卵黃占比約為23%，則TRIS專(zhuān)利卵黃稀釋液中卵磷脂含量約為5%。本試驗(yàn)擬利用TRIS專(zhuān)利稀釋液的基礎(chǔ)液，以添加5%濃度的大豆卵磷脂為中間濃度，設(shè)置不同濃度的大豆卵磷脂組，來(lái)進(jìn)行其對(duì)綿羊精液低溫保存效果。

1 材料與方法

1.1 稀釋液的制備與儲(chǔ)存

以TRIS專(zhuān)利稀釋液為基礎(chǔ)，用大豆卵磷脂代替卵黃進(jìn)行配制稀釋液，混合均勻，每5 mL分裝到試管中，在-80 ℃冰箱冷凍避光保存，稀釋精液前將稀釋液解凍備用。

TRIS專(zhuān)利卵黃稀釋液按照配方進(jìn)行制備，并在-80 ℃冰箱冷凍避光保存。

1.2 精液采集與保存

試驗(yàn)采用假陰道法采精，挑選12只3～4歲無(wú)繁殖障礙且體況良好的多浪羊盤(pán)羊高代雜交公羊，在采精前三個(gè)星期進(jìn)行補(bǔ)飼。試驗(yàn)中將稀釋液與采集的精液按照精液密度等溫混合，對(duì)稀釋后的精液進(jìn)行活率檢測(cè)，活率達(dá)到0. 7以上，將分裝的試管放在37 ℃盛有水的燒杯中，水浴在冰箱中1. 5 h降溫至0～4 ℃以內(nèi)，并保存在冰水混合物中。

1.3 精液品質(zhì)鑒定

精子活率檢測(cè)：在冰箱中拿出試管需進(jìn)行快速而輕的搖勻，取一滴精液滴在載玻片上，蓋上蓋玻片，先在顯微鏡下100倍視野中觀察精子，后在400倍下進(jìn)行檢測(cè)，觀察精子活率并記錄。

精子頂體完整率檢測(cè)：吸取10 μL精液滴于載玻片的一側(cè)，用邊緣光滑的另一張載玻片呈一定角度接觸液滴，拉向另一側(cè)而制成抹片，經(jīng)8 min自然風(fēng)干后，在福爾馬林磷酸鹽固定液中固定15 min，之后水洗干燥，用姬姆薩染液對(duì)抹片進(jìn)行染色90 min，再用蒸餾水沖洗與干燥，顯微鏡下觀察并記錄頂體完整的精子數(shù)。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 比較不同濃度大豆卵磷脂替代卵黃作為稀釋液中的防冷保護(hù)劑，在低溫保存不同天數(shù)精子活率情況。試驗(yàn)共分6個(gè)組：(A1, 1. 25%; A2, 2. 5%; A3, 5%; A4, 7. 5%; A5, 10%)大豆卵磷脂組與TRIS專(zhuān)利卵黃稀釋液(C)組將綿羊新鮮精液稀釋分裝并低溫保存，在第0 d、1 d、3 d、6 d、9 d、12 d對(duì)精子活率與頂體完整率進(jìn)行測(cè)定，選出大豆卵磷脂組中效果最優(yōu)組。

1.4.2 對(duì)234只母羊同期發(fā)情處理，用大豆卵磷脂效果最優(yōu)組與C組低溫保存至第9 d的精液(精子活率大于0. 5)對(duì)234只飼養(yǎng)管理?xiàng)l件一致，體況良好，無(wú)繁殖障礙的發(fā)情母羊進(jìn)行人工授精，大豆卵磷脂效果最優(yōu)組(112只)、C組(122只)，用B超在第40 d檢測(cè)受胎情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

受胎率用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，精子活率和精子頂體完整率用單因素方差分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。P<0. 05表示差異顯著，P>0. 05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度大豆卵磷脂稀釋液與卵黃稀釋液低溫保存綿羊精液不同時(shí)間的精子活率

由表1可知，自第6 d起A1組精子活率顯著高于A2、A3、A4、A5組(P<0. 05)，且精子活率隨著大豆卵磷脂濃度的增加而下降；雖然從第3 d開(kāi)始C組平均精子活率高于A1組，但A1組與C組精子活率在各時(shí)間點(diǎn)差異均不顯著(P>0. 05)；各組稀釋劑低溫保存綿羊精液的精子活率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，但A1、C兩組精子活率在第9 d為0. 53±0. 06和0. 55±0. 03均大于0. 5，滿足鮮精輸精要求。

表1 不同濃度大豆卵磷脂稀釋液與卵黃稀釋液低溫保存綿羊精液不同時(shí)間的精子活率

注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0. 05)，相同字母表示差異不顯著(P>0. 05)。

2.2 不同濃度大豆卵磷脂稀釋液與卵黃稀釋液低溫保存綿羊精液不同時(shí)間精子頂體完整率

由表2可知，精子頂體完整率均隨各組稀釋液保存時(shí)間的延長(zhǎng)而呈下降趨勢(shì)，且各組在第6 d到第9 d精子頂體完整率下降較快。雖從第1 d開(kāi)始A1組頂體完整率稍低于C組，但A1組與C組精子頂體完整率在各個(gè)相同時(shí)間點(diǎn)差異均不顯著(P>0. 05)。

表2 各組稀釋劑低溫保存綿羊精液不同時(shí)間精子頂體完整率(%)

注：同列比較無(wú)字母出現(xiàn)差異不顯著(P>0. 05)。

2.3 兩組稀釋液低溫保存綿羊精液第9 d人工授精受胎率

由表3可見(jiàn)，A1組低溫保存綿羊精液，在第9 d人工授精112只，有72只妊娠，受胎率達(dá)到64. 30%；C組第9 d人工授精122只，有80只妊娠，受胎率為65. 60%。由此可以確定，大豆卵磷脂稀釋液與卵黃稀釋液保存至第9 d的精液受胎率相近(P﹥0. 05)。

表3 兩組稀釋液低溫保存綿羊精液第9 d人工授精受胎率

注：同列比較無(wú)字母出現(xiàn)差異不顯著(P﹥0. 05)。

3 討論

從本試驗(yàn)結(jié)果可以看出，1. 25%濃度的大豆卵磷脂稀釋液從保存時(shí)間，精子活率隨時(shí)間的變化規(guī)律，精子頂體完整率以及經(jīng)大豆卵磷脂稀釋液保存后的精液人工授精情況，都可以達(dá)到卵黃稀釋液的效果，因此1. 25%濃度的大豆卵磷脂稀釋液能夠進(jìn)行綿羊精液低溫長(zhǎng)時(shí)間有效保存。

大豆卵磷脂稀釋液是近年稀釋液研究的熱點(diǎn)，F(xiàn)orouzanfar等[8]在冷凍保存綿羊精液試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)用1%大豆卵磷脂效果高于15%卵黃，證明大豆卵磷脂可以替代卵黃。Depaz等[9]用大豆卵磷脂在低溫與常溫下保存綿羊精液，結(jié)果表明精子在卵黃中的運(yùn)動(dòng)性較差。本試驗(yàn)在0 ℃冰水混合物中保存綿羊精液，發(fā)現(xiàn)使用1. 25%大豆卵磷脂替代卵黃保存精子效果顯著高于其他濃度(P<0. 05)，與蔡虹[10]等3%的添加量，孟娜娜[11]等0. 375%最優(yōu)添加量有一定偏差。所以證明為了確保精子的運(yùn)動(dòng)處于最好的狀態(tài)，大豆卵磷的添加劑量必須有一定的限度。

本試驗(yàn)A1組與C組精子活率在第12 d分別為0. 46±0. 09和0. 49±0. 07，試驗(yàn)結(jié)果優(yōu)于孟娜娜等[11]，略低于陳曉麗等[12]49. 51±1. 08。在第9 d時(shí)，A1組的精子活率為0. 53±0. 06，說(shuō)明大豆卵磷脂稀釋液在低溫保存綿羊精液9 d內(nèi)精子活率滿足輸精要求。A1組與C組在各個(gè)相同時(shí)間點(diǎn)精子頂體完整率差異均不顯著(P>0. 05)，A1組在第6 d頂體完整率為83. 1±1. 2，略低于王杰等[13]保存6 d頂體完整率。頂體完整率隨時(shí)間推移逐漸下降，且下降速率逐漸變大[14]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。

本試驗(yàn)低溫保存第9 d人工授精受胎率達(dá)到64. 30%與65. 60%，試驗(yàn)結(jié)果優(yōu)于丁瑜[15]使用大豆卵磷脂冷凍稀釋液人工授精受胎率，可能是因?yàn)榫邮艿揭欢ǖ睦浯驌?，精子的受精能力有所減弱。本結(jié)果表明大豆卵磷脂稀釋液對(duì)精子保存能力與TRIS專(zhuān)利卵黃稀釋液差異不顯著(P﹥0. 05)，大豆卵磷脂稀釋液能夠?qū)d羊精液低溫長(zhǎng)時(shí)間保存。

本試驗(yàn)在設(shè)計(jì)時(shí)，就以5%大豆卵磷脂濃度組為中間點(diǎn)，因?yàn)檫@與卵黃中卵磷脂的含量相當(dāng)，結(jié)果也證明了5%大豆卵磷脂組的保存效果，但試驗(yàn)結(jié)果卻為1. 25%大豆卵磷脂濃度組更好，其原因可能是：大豆卵磷脂的濃度的高低會(huì)影響精子的活力和復(fù)蘇率，在較高濃度的溶液中對(duì)精子運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生阻力較大，造成大量能量消耗，從而精子的存活率、活力等都大大降低。也可能是因?yàn)槁蚜字a(chǎn)廠家、純度等不同以及不同品種之間具有一定差異造成。所以推測(cè)是否在1. 25%濃度下還有更優(yōu)的濃度組，需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

A1組(濃度為1. 25%的大豆卵磷脂稀釋液)低溫保存綿羊精液精子活率均高于其他濃度組(P<0. 05)；A1組低溫保存綿羊精液精子活率第9 d(0. 53±0. 06)、12 d(0. 46±0. 09)與C組第9 d(0. 55±0. 03)、12 d(0. 49±0. 07)差異不顯著(P﹥0. 05)，且頂體完整率相當(dāng)(P﹥0. 05)；A1組低溫保存第9 d的精液進(jìn)行人工授精,受胎率64. 3%與C組65. 6%差異不顯著(P>0. 05)。表明1. 25%濃度的大豆卵磷脂稀釋液能夠進(jìn)行綿羊精液低溫長(zhǎng)時(shí)間有效保存。