陳 虹， 楊桂秋， 吳文杰， 吳寒秋， 程 燕

(1.沈陽化工大學(xué) 制藥與生物工程學(xué)院， 遼寧 沈陽 110142； 2.中國檢驗檢疫科學(xué)院食品安全研究所， 北京 100176)

魚肝油是一種從鮫類動物Squahdae等無毒海魚肝臟中提出的一種脂肪油[1]，其中維生素D3是魚肝油中主要的營養(yǎng)物質(zhì)之一.維生素D3有助于促進(jìn)小腸粘膜對鈣的吸收，能夠預(yù)防佝僂病和骨樣組織鈣化障礙等疾病[2-3]，然而，維生素攝入過量也導(dǎo)致健康風(fēng)險[4].因此，測定魚肝油維生素對評價魚肝油品質(zhì)優(yōu)劣、合理使用魚肝油具有現(xiàn)實意義.

脂溶性維生素的檢測有很多種方法：液相色譜法[5-6]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[7-9]、分光光度法[10]、毛細(xì)管電動色譜法[11]等.最常見的檢測魚肝油中維生素D3含量的方法主要是液相色譜法.液相色譜法與分光光度法比較優(yōu)勢在于可以對復(fù)雜基質(zhì)樣品進(jìn)行在線分離并定量定性，能排除樣品基質(zhì)中部分干擾.液相色譜法相比于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法而言儀器設(shè)備經(jīng)濟(jì)實惠，操作和儀器維護(hù)相對簡單，可以滿足本實驗對目標(biāo)物的檢出限和精密度檢測要求.食品中維生素的檢測主要依據(jù)《GB 5413.9—2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中VA、VD、VE的測定》[12].然而國標(biāo)中試樣經(jīng)皂化后用石油醚提取，用正相色譜凈化，反相色譜分離，外標(biāo)法定量.該方法操作復(fù)雜，耗時長，而且干擾物質(zhì)較多，容易造成維生素被破壞，導(dǎo)致回收率下降.

文獻(xiàn)報道正相色譜檢測魚肝油中的維生素D3前處理簡單[13]，能夠簡化操作步驟.waters超高效合相色譜(UPC2)是2012年面世的新型正相色譜，它具有傳統(tǒng)高效液相色譜和超臨界流體色譜的優(yōu)點[14]，以二氧化碳為流動相主體，依靠CO2的溶劑化能力對目標(biāo)物進(jìn)行分離、分析[15]，具有有機(jī)溶劑使用量少、分析速度快、重現(xiàn)性好等優(yōu)點[16-17].合相色譜作為一種新技術(shù)能夠完全替代正相液相色譜，合相色譜分離成本僅為液相色譜的十分之一；其靈敏度比正相液相色譜高，分離效果更好，分析速度快，能夠分離液相色譜難以分開的同分異構(gòu)體組分，還能分析傳統(tǒng)液相色譜難保留或難洗脫的成分(比如多糖).合相色譜與氣相色譜相比，當(dāng)分析揮發(fā)油、油脂類樣品時，合相色譜能簡化前處理步驟，避免了衍生化，大大提高了檢測效率.目前國內(nèi)沒有應(yīng)用超高效合相色譜檢測魚肝油基質(zhì)中維生素D3含量的文獻(xiàn)報道.本文采用超高效合相色譜法測定魚肝油中維生素D3含量，樣品經(jīng)正己烷提取后上樣，能夠大大簡化樣品預(yù)處理步驟，縮短分析時間，具有預(yù)處理簡單、耗時短、靈敏度高、回收率高等優(yōu)點，為復(fù)合魚肝油制劑的質(zhì)量控制提供一種新方法.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑、材料

Waters超高效合相色譜，美國 waters公司，檢測波長設(shè)置為265 nm；Allegra X-22R 冷凍離心機(jī)，美國Beckman Coulter公司；VORTEX-5 渦旋混合器，海門市Kylin-Bell公司; 維生素D3，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98 %，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司; 甲醇、乙腈、異丙醇、正己烷，色譜純，美國Thermo Fisher 公司；6種魚肝油樣品，購于當(dāng)?shù)厮幍?中國，北京).

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液:準(zhǔn)確稱取維生素D310.0 mg，加入到10 mL容量瓶中，用正己烷定容到10 mL，待其完全溶解，配制成 1 g/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，避光儲存在-25 ℃冰箱中待用.

標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確吸取5 mL、2 mL、1 mL、500 μL、200 μL、100 μL、50 μL、20 μL、10 μL標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10 mL 容量瓶中，用正己烷定容成質(zhì)量濃度分別為500 mg/L、200 mg/L、100 mg/L、50 mg/L、20 mg/L、10 mg/L、5 mg/L、2 mg/L和1 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作液，置于棕色樣品瓶，避光儲存在-4 ℃冰箱中，平均每4 h重新配制一次.

1.3 超高效合相色譜條件

色譜柱:Waters Acquity UPC2Torus 1-AA(100 mm×3.0 mm，1.7 μm),流動相:A 為 CO2，B 為甲醇; 體積分?jǐn)?shù)為80 %的CO2等度洗脫.采集時間3 min;流速 1 mL/min; 進(jìn)樣量 1 μL; 柱溫 50 ℃ ; 檢測波長 265 nm; 動態(tài)背壓(ABPR):15.169 MPa.

1.4 樣品處理

前處理參考相關(guān)文獻(xiàn)[13]，采用正己烷直接提取稀釋上樣.準(zhǔn)確稱取 1.0 g魚肝油樣品于 50 mL 聚乙烯管中，加入 10 mL正己烷，用渦旋混勻后，高速冷凍離心機(jī)于 4 ℃ 下以7 500 r/min 離心 5 min，取 1 mL 上清液，經(jīng) 0.22 μm 濾膜過濾后，經(jīng)超高效合相色譜分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

比較3種Waters Acquity UPC2常用色譜柱： Waters Acquity UPC2BEH(150 mm×2.1 mm，1.7 μm),Waters Acquity UPC2Torus 1-AA柱(100 mm×3.0 mm,1.7 μm) 和Waters Acquity UPC2Torus 2-PIC柱(150 mm×2.1 mm,1.7 μm).3種色譜柱都能在5 min內(nèi)出峰完全.由表1可知：使用 BEH柱和2-PIC柱時，維生素D3的對稱因子是1.57和1.71，峰面積分別為31 428和33 728；而使用1-AA柱時，維生素D3的對稱因子是1.48，峰面積是30 240.對稱因子越接近1 說明峰型越對稱，峰型越好.由圖1可知：當(dāng)使用BEH和2-PIC柱時，維生素D3在1 min左右出峰，雜質(zhì)峰通常在1 min之前出現(xiàn).出峰過早容易與雜質(zhì)一起出峰，在實際檢測中影響檢測結(jié)果，所以，使用BEH和2-PIC柱不合適.使用1-AA柱時，維生素D3在1.8 min左右出峰，目標(biāo)物的峰與雜質(zhì)峰、溶劑峰等能夠很好地分開.綜上所述，使用1-AA柱時維生素D3的響應(yīng)更高，峰型更好，出峰時間更合適.因此，色譜柱選擇Waters Acquit UPC2Torus 1-AA柱.

表1 不同色譜柱下維生素D3的峰面積和對稱因子Table 1 Peak area and symmetry factors of vitamin D3 with different chromatographic columns

圖1 不同色譜柱上維生素D3色譜圖Fig.1 Chromatogram of vitamin D3 with different chromatographic columns

2.2 流動相中助溶劑的優(yōu)化

CO2超臨界流體作為超高效合相色譜的流動相，因為其極性過低，通常加入甲醇、乙醇、異丙醇和乙腈等有機(jī)溶劑作為助溶劑.助溶劑能夠調(diào)整流動相極性，改變流動相對目標(biāo)物的溶解能力，影響目標(biāo)化合物的保留時間并改善目標(biāo)化合物的峰型[18].比較4種常用助溶劑：甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈，考察助溶劑對維生素D3峰型及保留時間的影響，選擇最優(yōu)助溶劑.結(jié)果如圖2所示.

圖2 不同助溶劑下維生素D3色譜圖Fig.2 Chromatogram of vitamin D3 with different solvents

不同助溶劑對維生素D3的峰型影響不大，但是對維生素D3的保留時間影響明顯.當(dāng)使用甲醇為助溶劑時，維生素D3在1.5～2 min 之間出峰；當(dāng)使用助溶劑為乙醇、異丙醇和乙腈時，維生素D3的保留時間均大于2 min.因此，可以看出選擇甲醇為助溶劑能節(jié)省分析時間，故最終選擇甲醇為助溶劑.

2.3 系統(tǒng)背壓的優(yōu)化

系統(tǒng)背壓是超高效合相色譜重要參數(shù)之一.其主要作用是控制流動相密度和性能，改變流動相的洗脫能力和性能[15]. CO2超臨界流體的密度和黏度隨著背壓的增加而增加，會導(dǎo)致柱壓升高[17]，所以，選擇合適背壓非常重要.考察了12.411 MPa、13.790 MPa、15.169 MPa和16.548 MPa 4種背壓下CO2超臨界流體對目標(biāo)物保留時間和峰型的影響.結(jié)果如表2.由表2可知：當(dāng)背壓為12.411 MPa時，維生素D3的保留時間為1.24 min，對稱因子為1.34;當(dāng)背壓為15.169 MPa時,維生素D3的保留時間為1.19 min，對稱因子為1.19.通過比較保留時間和對稱因子，可以看出當(dāng)柱壓為15.169 MPa時，雖然和其他條件相比維生素D3的出峰時間相差不大，但是維生素D3峰型更好；而當(dāng)柱壓為16.548 MPa時，色譜柱壓力過高.通過對保留時間、峰型及色譜柱壓力的綜合考慮，最終選擇背壓為15.169 MPa.

表2 不同系統(tǒng)背壓下維生素D3的保留時間和對稱因子Table 2 Retention time and symmetry factors of vitamin D3 with different dynamic pressures

2.4 色譜柱溫度的優(yōu)化

溫度也能夠影響目標(biāo)物的峰型和保留時間.在30 ℃、40 ℃、50 ℃下考察柱溫對目標(biāo)物分離的影響.結(jié)果表明：隨著溫度的變化，維生素D3的保留時間并沒有明顯差異，但是，當(dāng)溫度為 30 ℃時，柱壓較高，基線噪音較大，重現(xiàn)性較差；當(dāng)溫度為40 ℃時，基線噪音有所減??；當(dāng)溫度為 50 ℃時，基線噪音減小，基線平穩(wěn)，具有較好的重現(xiàn)性.所以，色譜柱最終溫度選擇 50 ℃.

2.5 流速的選擇

流速是影響目標(biāo)物峰型和保留時間的重要因素之一.隨著流速的增大，目標(biāo)物的出峰時間提前，峰型變得尖銳；但是流速過大容易造成柱壓過高，影響峰型，縮短色譜柱的使用壽命.實驗在 0.8 ～ 1.8 mL/min 范圍內(nèi)對流速進(jìn)行優(yōu)化.結(jié)果如圖3所示.

圖3 不同流速下的維生素D3色譜圖Fig.3 Chromatogram of vitamin D3 with different flow velocities

當(dāng)流速為1.8 mL/min、1.5 mL/min和1.2 mL/min 時，維生素D3的保留時間小于1 min，出峰時間過早，在檢測樣品時容易與雜質(zhì)一起出峰，對樣品中維生素D3含量的精確度造成干擾；當(dāng)流速為0.8 mL/min 時，維生素D3的色譜峰過寬.綜上所述，選擇1 mL/min為最佳流速.

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 線性、檢出限及定量限

選取500 mg/L、200 mg/L、100 mg/L、50 mg/L、20 mg/L、10 mg/L、5 mg/L、2 mg/L和1 mg/L的維生素D3標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照優(yōu)化好的最佳色譜條件進(jìn)行測定，繪制樣品質(zhì)量濃度(x，mg/L) 與峰面積(y，mV ·s) 標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果如表3 所示.該方法在5 ～ 200 mg/L 時線性關(guān)系良好.檢出限、定量限如表3 所示.

表3 維生素D3的線性回歸方程、線性范圍、 檢出限、定量限Table 3 Linerregression,liner range,LOD,LOQ of vitamin D3

2.6.2 回收率和精密度

稱取1.0 g的魚肝油樣品于離心管中，分別加入5 mg/kg、10 mg/kg，50 mg/kg的維生素D3標(biāo)準(zhǔn)工作液，靜置一段時間后，樣品經(jīng)正己烷提取，過膜上機(jī)，在上述優(yōu)化好的色譜條件下進(jìn)樣檢測，計算其加標(biāo)回收率.低、中、高3個加標(biāo)水平分別重復(fù)測定6次，結(jié)果如表4.維生素D3在3個加標(biāo)水平中回收率分別為87.4 %、90.7 %和89.3 % ，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD) 為 3.2 %、1.0 %、0.3 %.

表4 回收率及精密度Table 4 Recovery and precision

2.6.3 實際樣品檢測

對6個不同品牌的魚肝油樣品進(jìn)行分析，檢測結(jié)果見表5. 由表5的結(jié)果顯示： 不同品牌的魚肝油中維生素D3的含量不同，這可能與魚肝油原料的來源、處理、加工工藝等因素有關(guān).

表5 不同品牌魚肝油中維生素D3的含量Table 5 Content of six kinds of Cod Liver Oil and vitamin D3

3 結(jié) 論

建立了超高效合相色譜(UPC2) 對魚肝油中維生素D3的檢測方法，考查了色譜柱、助溶劑、系統(tǒng)背壓、色譜柱溫度、流速等因素，選定了最佳實驗條件.該方法分析時間短，維生素D3在2 min出峰完全，實驗步驟簡單，安全環(huán)保，為魚肝油中維生素D3的檢測提供了技術(shù)支持，為魚肝油的質(zhì)量評價提供新方法.