李 兵，張 嬋，林 芳，李自明，周 劍

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430030）

帕金森病多常見(jiàn)于老年人，屬于一種神經(jīng)退行性功能障礙病變，臨床病癥主要為震顫麻痹，病理特征表現(xiàn)在多巴胺能神經(jīng)元損傷[1]。早期研究表明機(jī)體受到氧化應(yīng)激刺激時(shí)，機(jī)體氧化/抗氧化系統(tǒng)失衡，抗氧化能力減弱，導(dǎo)致自由基過(guò)得堆積，引起機(jī)體的嚴(yán)重?fù)p傷。其中活性氧（ROS）是氧化應(yīng)激損傷的主要產(chǎn)物之一，并且在帕金森病發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[2]。發(fā)現(xiàn)核轉(zhuǎn)錄因子（Nrf2）可以通過(guò)介導(dǎo)抗氧化反應(yīng)元件（AER）活性來(lái)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激途徑[3]。于是，探討Nrf2/AER信號(hào)通路的調(diào)控作用對(duì)帕金森病的發(fā)病機(jī)制的研究具有重大意義。早期也有研究發(fā)現(xiàn)葛根素對(duì)6-羥多巴胺所致帕金森病大鼠具有保護(hù)作用[4]，而且葛根素還可通過(guò)Nrf2/ARE信號(hào)通路抵抗氧化應(yīng)激對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷的神經(jīng)保護(hù)[5]。因此，本文旨在研究葛根素對(duì)BV-2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用，并對(duì)其可能調(diào)控Nrf2/ARE信號(hào)通路活化這一機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料及方法

1.1 材料及試劑 小神經(jīng)膠質(zhì)BV-2細(xì)胞購(gòu)買于南京科默生物細(xì)胞庫(kù)；葛根素（武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司，純度 98%，批號(hào)：23521-698-23）；CCK8試劑盒（上海威奧生物科技有限公司，批號(hào)：CJ-150-25）；丙二醛（MDA）試劑盒（上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司，批號(hào)：SHP-1230-24）；一氧化氮（NO）試劑盒（江蘇澤雨生物科技有限公司，批號(hào)：HTC-4203-54）；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（北京默沙克生物科技有限公司，批號(hào)：SJ-1540-93）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司，批號(hào)：C15740）；SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒（武漢谷歌生物科技有限公司，批號(hào)：20170512）；RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco公司，批號(hào)：RT-1630-21）；βactin、HO-1、SOD1、Jak2、p-Jak2、State3 及 p-State3一抗均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；對(duì)應(yīng)二抗購(gòu)自武漢谷歌生物有限公司。

1.2 儀器 酶標(biāo)儀（南京德鐵儀器公司，型號(hào)：HBS-1096A）；單人超凈臺(tái)（濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司，型號(hào)：BBS-V800）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海旦鼎國(guó)際貿(mào)易有限公司，型號(hào)：SANYO）；雙色紅外激光成像系統(tǒng)（美國(guó) BIO-RAD，批號(hào)：LI-COR ODYSSEY）。

1.3 BV-2細(xì)胞培養(yǎng) 將單人超凈工作臺(tái)及相關(guān)實(shí)驗(yàn)物品紫外光照消毒30 min，復(fù)蘇BV-2細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，1640完全培養(yǎng)基（10%胎牛血清，1%的100 U/mL青霉素及100 mg/mL鏈霉素）于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2 d換液1次，培養(yǎng)3～4 d進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行消化、離心、重懸、計(jì)數(shù)后，取適量細(xì)胞數(shù)接種于96孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜，分為空白對(duì)照組、H2O2誘導(dǎo)模型組、H2O2+5μmol/L葛根素組、H2O2+10μmol/L葛根素組、H2O2+20μmol/L葛根素組，培養(yǎng)24 h后吸干舊培養(yǎng)基，每孔加入100μL含10μL CCK8試劑的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，然后在波長(zhǎng)450 nm處的酶標(biāo)儀中測(cè)定每孔吸光度值。

1.5 細(xì)胞勻漿MDA、NO及SOD檢測(cè) 取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行消化、離心、重懸、計(jì)數(shù)后，取適量細(xì)胞數(shù)接種于6孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜，分為空白對(duì)照組、H2O2誘導(dǎo)模型組、H2O2+5μmol/L葛根素組、H2O2+10μmol/L葛根素組、H2O2+20μmol/L葛根素組，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞制備成勻漿，按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行MDA、NO水平及SOD活性檢測(cè)。

1.6 免疫印跡檢測(cè)蛋白水平 取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行消化、離心、重懸、計(jì)數(shù)后，取適量細(xì)胞數(shù)接種于6孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜，分為空白對(duì)照組、H2O2誘導(dǎo)模型組、H2O2+5μmol/L葛根素組、H2O2+10μmol/L葛根素組、H2O2+20μmol/L葛根素組，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞、裂解、離心、收集上清、檢測(cè)蛋白濃度。然后每孔上樣量50μg，進(jìn)行電泳分析、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗過(guò)夜、洗膜、孵育二抗、洗膜及蛋白表達(dá)分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0．05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 葛根素對(duì)BV-2細(xì)胞存活率的影響 采用CCK8試劑盒分析了葛根素對(duì)BV-2細(xì)胞存活率的影響，結(jié)果如表1所示。結(jié)果顯示：?jiǎn)渭兊腍2O2刺激可明顯降低細(xì)胞的存活率，相對(duì)于正常對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；而經(jīng)過(guò)不同劑量葛根素干預(yù)24 h后，可見(jiàn)葛根素可明顯提高細(xì)胞的存活率，并隨著藥物劑量升高細(xì)胞的相對(duì)存活率升高的越明顯，表現(xiàn)出濃度依賴性，并且各藥物組與H2O2誘導(dǎo)組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），藥物組兩兩之間的比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。

表1 不同組間BV-2細(xì)胞存活率的比較（n=6）Tab.1 Comparison of the survival ratesof BV-2 cellsin different group(n=6)

2.2 葛根素對(duì)BV-2細(xì)胞氧化應(yīng)激產(chǎn)物的影響 相關(guān)試劑盒分析了葛根素對(duì)BV-2細(xì)胞氧化應(yīng)激產(chǎn)物含量的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示：?jiǎn)渭兊腍2O2干預(yù)可明顯誘導(dǎo)MDA、NO的釋放及降低SOD的活性，相對(duì)于正常對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；經(jīng)過(guò)不同濃度葛根素干預(yù)后，勻漿中 MDA、NO的水平顯著減少，而SOD酶活性則明顯升高，與H2O2誘導(dǎo)組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），并且隨著葛根素劑量的升高，3種指標(biāo)與H2O2誘導(dǎo)組之間的差異越顯著，表現(xiàn)出濃度依賴性。

表2 不同組別間細(xì)胞氧化應(yīng)激產(chǎn)物的比較（n=6）Tab.2 Comparision of oxidativestressparametersin cells among the groups（n=6）

2.3 葛根素對(duì)Nrf2活化與轉(zhuǎn)位的影響 H2O2干預(yù)組BV-2細(xì)胞中細(xì)胞核內(nèi)Nrf2的表達(dá)顯著低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。隨著不同劑量的葛根素干預(yù)后，胞核內(nèi)Nrf2的表達(dá)顯著升高，與 H2O2干預(yù)組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。如圖1所示。

2.4 葛根素對(duì)織Nrf2下游靶基因GCLC、NQO1和HO-1蛋白表達(dá)的影響 H2O2干預(yù)組BV-2細(xì)胞中GCLC、NQO1和HO-1蛋白的表達(dá)顯著低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。隨著不同劑量的葛根素干預(yù)后，細(xì)胞中GCLC、NQO1和HO-1蛋白的表達(dá)顯著升高，與H2O2干預(yù)組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。如圖2所示。

圖1 葛根素對(duì)Nrf2核轉(zhuǎn)位的影響（n=6）Fig.1 Effect of puerarin on Nrf2 translocation in the BV-2 cell(n=6)

圖2 葛根素對(duì)GCLC、NQO1和HO-1蛋白的影響（n=6）Fig.2 Effect of puerarin on theexpression of GCLC,NQO1 and HO-1 in the BV-2 cell(n=6)

3 討論

當(dāng)前有關(guān)研究顯示，葛根素具有廣泛的藥理作用，如在治療高脂血癥、糖尿病、老年性癡呆、心臟缺血再灌注損傷等疾病都表現(xiàn)出良好的療效[6]，并且其針對(duì)不同的疾病治療機(jī)制也各不相同。在葛根素改善心臟缺血/再灌注損傷過(guò)程中，主要通過(guò)誘導(dǎo)PI3K/AKT信號(hào)通路活化進(jìn)一步上調(diào)eNOS基因表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。氧化應(yīng)激屬于大量自由基堆積引發(fā)的損傷，引起機(jī)體氧化/抗氧化系統(tǒng)失衡，而且氧化應(yīng)激還是導(dǎo)致衰老和病態(tài)的一個(gè)重要原因[7]。誘導(dǎo)抗氧化因子間協(xié)調(diào)作用能夠幫助恢復(fù)抗氧化系統(tǒng)功能，從而有效的對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷。H2O2是誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷的良好誘導(dǎo)劑，雖然小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是大腦的神經(jīng)性免疫細(xì)胞，對(duì)炎性因子比較敏感，并且還能夠進(jìn)一步誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷。然而，文章主要探討葛根素對(duì)BV-2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響，采用H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激模型比較單一，可以降低其他炎性反應(yīng)的影響。文章采用H2O2誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，發(fā)現(xiàn)H2O2誘導(dǎo)組細(xì)胞產(chǎn)生的氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA及NO顯著升高，抗氧化酶SOD活性顯著降低，說(shuō)明氧化應(yīng)激損傷模型構(gòu)建成功。經(jīng)過(guò)不同濃度葛根素干預(yù)損傷細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，不同劑量的葛根素可明顯增加細(xì)胞的存活率、降低氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA及NO的釋放及增強(qiáng)SOD酶活性，提示葛根素對(duì)氧化應(yīng)激損傷的BV-2細(xì)胞具有較好的保護(hù)作用。

前期研究證實(shí)葛根素能夠促進(jìn)腦組織內(nèi)源性抗氧化劑活性，達(dá)到清除腦組織堆積的自由基，緩解氧化應(yīng)激損傷，改善神經(jīng)元的損傷[8-9]。但葛根素作用的具體機(jī)制尚不是很清楚，已有研究說(shuō)明人體內(nèi)多種抗氧化酶均含有一個(gè)相同的啟動(dòng)子序列，即抗氧化反應(yīng)元件（ARE）[10]。其中轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2（Nrf2）與ARE結(jié)合在抗氧化應(yīng)激損傷中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。Nrf2/ARE信號(hào)通路為細(xì)胞內(nèi)作用的抗氧化防御機(jī)制，即當(dāng)機(jī)體受到受到外界刺激時(shí)發(fā)生細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的變化，其中Nrf2能磷酸化進(jìn)而與Keap1解偶聯(lián)，進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而與相關(guān)基因的ARE序列結(jié)合編碼靶基因的轉(zhuǎn)錄[11]。本文研究發(fā)現(xiàn)葛根素可明顯增強(qiáng)Nrf2的轉(zhuǎn)位，并誘導(dǎo)其下游靶基因GCLC、NQO1及HO-1蛋白的表達(dá)。綜上所述，葛根素可明顯降低BV-2細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，其作用機(jī)制可能與Nrf2/ARE信號(hào)通路的活化有關(guān)。