鄭 丁 ，時(shí)昭紅，郭 潔 ，張 書 ，付麗鶴 ，劉 凡 ，涂蓓蕾

（1．湖北中醫(yī)藥大學(xué)，武漢 430065；2．武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，武漢 430022）

非酒精性脂肪肝?。∟AFL D）是指除酒精和其他明確的肝損害因素外，以肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積為主要特征的臨床病理綜合征。西方發(fā)達(dá)國家發(fā)病率為20%～30%，中國成人發(fā)病率約15%，且發(fā)病呈年輕化的趨勢，對人們的生命健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅[1-2]。目前臨床上沒有一種藥物被證實(shí)治療NAFLD直接有效，所以尋找新的藥物尤為迫切。大量實(shí)驗(yàn)研究表明[3-5]，用高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD模型大鼠肝線粒體出現(xiàn)不同程度損傷，肝組織ATP含量顯著降低，肝臟出現(xiàn)明顯的能量代謝障。ATP合酶是ATP的生成的關(guān)鍵酶，由F0和F1兩部分組成，其F0由ATP合酶F0亞基6（ATPase6）、ATP合酶F0亞基8（ATPase8）編碼，所以通過提高ATPase6、ATPase8的表達(dá)可以增加ATP的合成。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[6-8]，蔥白提取物能明顯改善NAFLD模型大鼠肝脂肪變性，其中有效成分主要是黃酮類化合物、甾體類化合物、不飽和脂肪酸類化合物、硫化合物等。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)[9]黃酮類化合物通過抗氧化作用恢復(fù)線粒體能量代謝發(fā)揮作用?；谏鲜隼碚撆c研究基礎(chǔ)，筆者以蔥白提取物干預(yù)NAFLD模型大鼠，通過蘇木精-伊紅（HE）染色法觀察肝臟組織結(jié)構(gòu)變化，采用 Real time PCR觀察肝臟 ATPase6、ATPase8 mRNA的表達(dá)，探討其治療NAFLD可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物 健康雄性SD大鼠50只，級別SPF級，體質(zhì)量（180～220）g，由湖北省疾病控制中心提供，許可證號：SCXK（鄂）2008－0005。

1.2 藥物 高脂飼料：72．1%基礎(chǔ)飼料+2%膽固醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）+10%豬油（市場自購）+5%蔗糖（市場自購）+0．5%脫氧膽酸鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）+0．2%甲硫氧嘧啶（上海復(fù)星朝暉藥業(yè)有限公司）；蔥白提取物制劑（由武漢市中西結(jié)合醫(yī)院制劑中心提供，批號：20110902），用色拉油調(diào)勻后配置成5 g/L濃度的懸混液。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒（上海嵐派生物科技有限公司），膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）試劑盒（溫州東歐生物工程有限公司），ATPase6、ATPase8及內(nèi)參GAPDH的特異性引物（由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)與合成），總RNA提取試劑盒（北京天根生化科技公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及Real time PCR試劑盒（成都博瑞克生物技術(shù)有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 DYY-7C電泳儀電源（北京六一儀器廠），ZX6006臺式高速離心機(jī)（法國Jouan公司）；TS-1型水平搖床（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（北京市長風(fēng)儀器儀表有限公司）；164-5050型電泳儀（美國Bio-Rad公司）；ABI7500型熒光定量PCR儀（美國Thermo公司）；Gel Doc EQ型凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.5 分組與給藥 將50只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分籠飼養(yǎng)于SPF級動物房內(nèi)，溫度控制在17～24℃，濕度控制在22%～24%。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為5組，每組10只，除正常組給予普通飼料，其余4組給予高脂飲食，自由進(jìn)食飲水，造模10周后，低、中、高劑量組分別給予25 mg/（k g·d）、50 mg/（k g·d）、75 mg/（kg·d）蔥白提取物灌胃，正常組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃，除正常組外，期間正常組給予普通飼料，其余4組繼續(xù)給予高脂飲食，每日1次，連續(xù)4周。

1.6 肝臟組織學(xué)檢查 在肝右葉相同位置距邊緣1cm處取適量肝組織，用福爾馬林固定24h后做HE染色，在光鏡下觀察肝組織的病理變化。參照范建高《脂肪性肝病》給肝臟脂肪變性程度進(jìn)行分級[10]。

1.7 血清中ALT、AST、TC、TG含量的測定 用1%戊巴比妥腹腔注射麻醉后開腹經(jīng)腹主動脈取血，放置室溫20 min后3 500 rpm離心8 min取血清，然后按照試劑盒操作方法步驟通過生化檢測儀測定各組大鼠血清中ALT、AST、TC、TG含量。

1.8 Real time PCR檢測ATPase6、ATPase8 mRNA的表達(dá) 采用Trizol提取RNA后，用紫外分光光度計(jì)測定RNA的濃度和純度。按試劑盒說明書步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增反應(yīng)。PCR引物設(shè)計(jì):Rat PGC-1aF:5'-AATGCAGCGGTCTTAGCACT-3，Rat PGC-1aR:5'-GTGTGAGGAGGGTCATC，片段長度 168 bp；βactinF：5'-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3'，β-actin R:5'-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3'片段長度186bp。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性50℃、2min，95 ℃、10 min；40 個(gè)循環(huán)中 95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，根據(jù)目的產(chǎn)物PGC-1αmRNA和內(nèi)參照β-actin CT值來反映其相對含量。

1.9 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)變化 模型組在確認(rèn)造模是否成功時(shí)處死1只，蔥白中、高劑量組在造模的過程中各意外死亡1只。與正常組比較，模型組肝脂肪變性明顯（P<0.05），與模型組比較，蔥白低、中、高劑量組肝脂肪變性均不同程度減輕（P<0.05）；與蔥白低劑量組比較，蔥白中、高劑量組肝脂肪變性減輕明顯（P<0.05），蔥白中、高劑量組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1，見圖1。

表1 各組大鼠肝脂肪變性程度Tab.1 Degree of hepatic steatosisin each group of rats

2.2 各組大鼠血清ALT、AST、TC、TG水平 與正常組比較，模型組血清ALT、AST、TC、TG水平表達(dá)明顯升高（P<0.05），與模型組比較，蔥白低、中、高劑量組血清ALT、AST、TC、TG水平均不同程度降低（P<0.05）；與蔥白低劑量組比較，蔥白中、高劑量組血清 ALT、AST、TC、TG 水平降低明顯（P<0.05），蔥白中、高劑量組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠肝臟ATPase6、ATPase8 mRNA的表達(dá) 與正常組比較，模型組ATPase6、ATPase8mRNA表達(dá)明顯降低（P<0.05），與模型組比較，蔥白低、中、高劑量組ATPase6、ATPase8 mRNA均不同程度升高（P<0.05）；與蔥白低劑量組比較，蔥白中、高劑量組 ATPase6、ATPase8 mRNA 升高明顯（P<0.05），蔥白中、高劑量組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

3 討論

NAFLD的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前較為公認(rèn)的是“二次打擊”學(xué)說。“第一次打擊”是指以胰島素抵抗為基礎(chǔ)，TG在肝臟蓄積；“第二次打擊”是指氧化磷酸化的激活、呼吸鏈的損傷導(dǎo)致能量代謝障礙、細(xì)胞因子的活化，從而引起肝細(xì)胞炎癥性壞死[11]。細(xì)胞處于氧化應(yīng)激的狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)的氧化-抗氧化體系平衡被破壞，肝內(nèi)活性氧（ROS）的產(chǎn)生超過抗氧化系統(tǒng)的清除能力，導(dǎo)致線粒體損傷[12]。線粒體是細(xì)胞能量代謝的中心，是β脂肪酸氧化、三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化和電子呼吸鏈傳導(dǎo)的場所。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)[3-4]，采用高脂誘導(dǎo)的NAFLD模型大鼠出現(xiàn)肝線粒體損傷，且肝臟脂肪變程度越重，其線粒體功能損傷越明顯。線粒體受損，機(jī)體能量產(chǎn)生和儲備障礙，這既是脂肪肝的結(jié)果，也是導(dǎo)致進(jìn)一步損傷的重要原因，形成惡性循環(huán)。因此，提高與恢復(fù)線粒體低劑量能量功能將成為治療脂肪肝的新方法[13]。

正常情況下，機(jī)體通過線粒體電子傳遞鏈產(chǎn)生ATP提供機(jī)體所需的能量。呼吸鏈酶在線粒體內(nèi)膜上，在線粒體電子傳遞過程中承擔(dān)電子傳遞作用。ATP合酶主要有F0和F1兩部分組成。其中，F(xiàn)1具有催化ATP合成或水解活性的作用，而F0的主要功能則是構(gòu)成離子通道，便于質(zhì)子流通過，對于ATP產(chǎn)生具有導(dǎo)向作用[14]。F0的兩個(gè)主要亞基由線粒體DNA（mtDNA）ATPase6、ATPase8編碼。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組ATPase6、ATPase8表達(dá)明顯減少，給予蔥白提取物干預(yù)后，低、中、高劑量組ATPase6、ATPase8表達(dá)較模型組均升高。ALT的水平反映肝細(xì)胞的受損程度，AST可反映線粒體的受損情況。模型組與正常組相比，AST、ALT的表達(dá)明顯升高，給予蔥白提取物干預(yù)后，低、中、高劑量組AST、ALT的表達(dá)較模型組明顯降低。

圖1 各組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)變化（HE，×400）Fig.1 Hepatic morphologic in each group of rats（H E，×400）

表 2 各組大鼠血清 ALT、AST、TC、TG 水平（x±s）Tab.2 Levelsof serum ALT,AST,TC and TG in each group of rats（x±s）

表3 各組大鼠ATPase6、ATPase8 mRNA的表達(dá)（±s）Tab.3 Expression of ATPase6 and ATPase8 mRNA in each group of rats（±s）

表3 各組大鼠ATPase6、ATPase8 mRNA的表達(dá)（±s）Tab.3 Expression of ATPase6 and ATPase8 mRNA in each group of rats（±s）

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與蔥白低劑量組比較，△P<0.05。

分組 動物數(shù) 劑量[mg/(kg·d)]ATPase6 mRNA ATPase8 mRNA正常組 10 - 1.00±0.07 1.00±0.08模型組 09 - 0.31±0.04* 0.29±0.07*蔥白低劑量組 10 25 0.61±0.08# 0.60±0.06#蔥白中劑量組 09 50 0.86±0.06#△ 0.92±0.10#△蔥白高劑量組 09 75 0.88±0.04#△ 0.90±0.08#△

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，NAFLD的發(fā)生與“痰”、“瘀”密切相關(guān)，痰瘀之邪聚而不散，漸積于肝則痞塊乃成，臨床上以“祛痰降濁、活血化瘀”為治法，部分患者療效仍不盡理想，張介眉教授在多年的臨床實(shí)踐中總結(jié)出采用“通陽法”來治療NAFLD取得很好的療效，為NAFLD的治法提供了另一種思路[15-16]。采用“通陽法”治療NAFLD的思路來源于清代溫病大家葉天士，葉天士指出：“欲除濁陰，急急通陽”，陽氣通則痰濁瘀血可除，本清源斷而陰濁清。關(guān)于蔥白的通陽作用，歷代醫(yī)家多有論述，張仲景謂蔥白不離于陰，以通陰中之陽，其形態(tài)中空，通陽最速。戶菲菲等[17-18]在實(shí)驗(yàn)中證實(shí)蔥白提取物可以減少HSC模型大鼠肝組織Ⅳ的過度沉積而起到暢通有形之痰瘀阻塞的作用。從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來看，模型組與正常組相比，肝臟出現(xiàn)明顯脂肪變性，TC、TG水平明顯升高，給予蔥白提取物干預(yù)后，低、中、高劑量組肝脂肪變性明顯減輕，TC、TG水平明顯降低。

綜上所述，蔥白提取物能夠改善NAFLD模型大鼠肝脂肪變性，其機(jī)制可能與提高ATPase6、ATPase8的表達(dá)，改善肝線粒體ATP合成有關(guān)。