孫小童，代翠紅，崔 杰，羅成飛，李新玲，張延明，程大友

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150086； 2.哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150020)

0 前言

多糖是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的天然高分子聚合物，在維持生命活動(dòng)的正常運(yùn)作中起著重要的作用[1-2]。多糖不僅可以作為生物體的能量來源，在生物合成反應(yīng)以及激素激活、細(xì)胞增殖、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等生命過程中也能夠發(fā)揮重要的作用[3-4]，它幾乎參與了細(xì)胞中的所有活動(dòng)而對(duì)細(xì)胞沒有消極影響，它作用于機(jī)體能夠降低血糖、延緩衰老、保護(hù)肝臟、抗腫瘤抗癌等，其安全性高效果好，是一類非常理想的營(yíng)養(yǎng)素。市面上已經(jīng)有許多用于強(qiáng)身健體的多糖制劑，有些多糖制作的藥物也已應(yīng)用于臨床，效果甚佳。此外，由于多糖的來源廣泛，且有著良好的吸附性，保水性和粘結(jié)性，一些研究人員嘗試使用植物多糖進(jìn)行環(huán)境管理，這也是多糖領(lǐng)域新的研究方向[5]。

甜菜是溫帶氣候地區(qū)用于制糖的主要田間農(nóng)作物?，F(xiàn)在，世界上有大約30%的糖是以甜菜為原料制取的。甜菜渾身是寶，甜菜的莖葉可作為理想的飼料，甜菜根中還含有豐富的礦物質(zhì)和維生素，但并沒有被大規(guī)模的開發(fā)利用[6]。食用紅甜菜是栽培甜菜中的變種之一，于生產(chǎn)生活方面都有著巨大的用途，一方面，它可作為原材料生產(chǎn)食品、添加劑、保健品以及天然染色劑等，另一方面，食用紅甜菜的顏色鮮紅美觀，可用來作為觀賞植物。目前，紅甜菜的主要生產(chǎn)地區(qū)是英國(guó)、北美洲和中美洲[7]，國(guó)內(nèi)培育的紅甜菜品種數(shù)目較少，推廣力度也不大，利用效率有待提高，而且，目前對(duì)紅甜菜的大部分研究都是圍繞著甜菜紅色素來開展的[8-10]。研究表明，食用紅甜菜塊根中的多糖含量也很豐富[11]，且具有很強(qiáng)的活性功能和較高的醫(yī)療保健價(jià)值，但尚需開發(fā)[12-13]，因此對(duì)紅甜菜多糖的提取及純化方法進(jìn)行初步研究，以期為進(jìn)一步利用和開發(fā)紅甜菜多糖奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 生物材料

一品紅紅甜菜，由黑龍江省哈爾濱市糖業(yè)研究所提供。

1.1.2 試劑

蒸餾水、無水乙醇、丙酮、纖維素酶、檸檬酸、氫氧化鈉、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清白蛋白、磷酸、氯仿、正丁醇、三氯乙酸、活性炭。

1.1.3 儀器

電熱鼓風(fēng)干燥箱：101-2A型，天津市泰斯特儀器有限公司；電子分析天平：ELB300，日本SHIMADZU島津；電熱恒溫水槽：DK-8D型，上海一恒科技有限公司；低速大容量離心機(jī)：TLXJ-ⅡC型，上海安亭科學(xué)儀器廠；紫外分光光度計(jì)：UV-200型，尤尼柯(上海)儀器有限公司；氣浴恒溫振蕩器：THZ-82型，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的預(yù)處理

將一品紅紅甜菜去葉去莖，保留塊根，將塊根洗凈、去皮，切成細(xì)絲，平鋪于鐵制托盤內(nèi)，在電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干，直到紅甜菜絲呈酥脆易碎狀(脫水率：84.15%)，粉碎機(jī)粉碎，過60目篩，得紅甜菜干燥粉末。

1.2.2 紅甜菜粗多糖的提取

1.2.2.1 熱水浸提法工藝流程

紅甜菜干粉→加入蒸餾水使紅甜菜干粉質(zhì)量∶蒸餾水體積=1∶25→90℃水浴浸提2.5 h→離心(3 000 r/min，10 min)→收集沉淀重復(fù)上述步驟→合并兩次提取的上清液→60℃水浴濃縮→醇沉→離心(3 000 r/min，10 min)→棄上清，沉淀經(jīng)無水乙醇，丙酮反復(fù)洗滌→干燥→紅甜菜粗多糖

1.2.2.2 酶提取法工藝流程

紅甜菜干粉→95% 乙醇熱處理( 40℃，1 h)→離心(3 000 r/min，10 min)→取沉淀干燥→加入蒸餾水和纖維素酶(酶用量5 000 U/g)并調(diào)節(jié)pH值到4.8，使預(yù)處理后的紅甜菜干粉質(zhì)量∶酶解液體積=1∶30，在50℃的溫度下酶解1 h→滅酶(90℃，1 h)→離心(3 000 r/min，10 min)→醇沉→離心(3 000 r/min，10 min)→棄上清，沉淀經(jīng)無水乙醇，丙酮反復(fù)洗滌→干燥→紅甜菜粗多糖

1.2.3 乙醇沉淀?xiàng)l件的確定

取紅甜菜粉末，加入蒸餾水使紅甜菜干粉質(zhì)量∶蒸餾水體積=1∶25，90℃水浴浸提2.5 h，在3 000 r/min的條件下離心10 min，保留上清液，重新對(duì)沉淀物進(jìn)行提取，合并兩次提取的上清液，將其置于60℃的水浴鍋中濃縮，可得紅甜菜粗多糖濃縮液[14]。

1.2.3.1 醇沉溫度的確定

取4個(gè)錐形瓶，分為兩組，每組兩瓶，每組加入預(yù)先制備的紅甜菜粗多糖濃縮液10 mL，再分別加入乙醇至各瓶?jī)?nèi)乙醇終濃度為80%，密封，第一組置于4℃冰箱，第二組置于25℃室溫條件下，醇沉12 h后離心，用無水乙醇和丙酮反復(fù)洗滌沉淀物，干燥后測(cè)多糖含量。比較不同溫度對(duì)紅甜菜多糖沉淀的影響。

1.2.3.2 醇沉?xí)r間的確定

取5個(gè)錐形瓶，標(biāo)號(hào)1，2，3，4，5。分別加入預(yù)先制備的紅甜菜粗多糖濃縮液10 mL，再分別加入乙醇至各瓶?jī)?nèi)乙醇終濃度為80%，密封，放入4℃冰箱內(nèi)進(jìn)行醇沉，5組的醇沉?xí)r間分別為12 h、18 h、24 h、30 h、36 h，5組樣品經(jīng)過醇沉后離心，用無水乙醇和丙酮反復(fù)洗滌沉淀物，干燥后測(cè)多糖含量。比較不同的醇沉?xí)r間對(duì)紅甜菜多糖沉淀的影響。

1.2.3.3 醇沉乙醇終濃度的確定

取5個(gè)錐形瓶，標(biāo)號(hào)1，2，3，4，5。分別加入預(yù)先制備的紅甜菜粗多糖濃縮液10 mL，然后加入乙醇至每瓶中乙醇的最終濃度分別為70%、75%、80%、85%、90%，密封，放入4℃冰箱內(nèi)進(jìn)行醇沉，醇沉12 h后離心，用無水乙醇和丙酮反復(fù)洗滌沉淀物，干燥后測(cè)多糖含量。比較不同的乙醇終濃度對(duì)紅甜菜多糖沉淀的影響。

1.2.4 多糖含量的測(cè)定

(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取10 mg干燥恒重的葡萄糖，100 mL容量瓶中稀釋定容，即得100 ug/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液[15]。

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取8只試管，按照表1準(zhǔn)確吸取質(zhì)量濃度100 ug/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液及蒸餾水，然后加入5%苯酚1 mL，充分搖勻后，緩慢的滴入5.0 mL濃硫酸，保持恒溫放置20 min。將0號(hào)用作空白調(diào)零，在490 nm 處測(cè)定其吸光度。 將吸光度作為縱坐標(biāo)(Y)，葡萄糖對(duì)照品溶液的溶度(mg/mL)作為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸數(shù)據(jù)處理，求得回歸方程為Y=8.276 2X+0.004 6，R2=0.990 7。結(jié)果顯示在所設(shè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

(2)紅甜菜多糖含量測(cè)定

將提取得到的紅甜菜多糖溶解在適量的蒸餾水中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線中的測(cè)量方法測(cè)量溶液的吸光度并將其帶入回歸方程以計(jì)算待測(cè)溶液的多糖濃度。

多糖提取率計(jì)算公式為：

多糖提取率(%)=[(C×V×N)/M]×100%

式中：C為將待測(cè)溶液的帶入回歸方程后計(jì)算得到的紅甜菜多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；V為待測(cè)液定容體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；M為紅甜菜干粉質(zhì)量，mg。

1.2.5 紅甜菜粗多糖的脫蛋白

經(jīng)過提取后的紅甜菜粗多糖依舊含有少量蛋白質(zhì)雜質(zhì)，利用Sevage法和TCA法對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的純化，以蛋白質(zhì)的脫除率和多糖的損失率作為考察指標(biāo)，比較兩種方法的脫蛋白效果[16]。

1.2.5.1 Sevage法脫蛋白

取20 mL紅甜菜粗多糖溶液，按照提取液體積1/4的量加入Sevage試劑(氯仿∶正丁醇=4∶1)，搖床振蕩20 min，離心(3 500 r/min，8 min)，吸取上層水相，棄去氯仿層和沉淀，再將上清液重復(fù)上述步驟除蛋白質(zhì)，測(cè)定每次脫蛋白后蛋白質(zhì)和多糖的含量，計(jì)算每次脫蛋白后的蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率。

1.2.5.2 TCA法脫蛋白

取20 mL紅甜菜粗多糖溶液均分為5份，加入三氯乙酸，使5份樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2%、4%、6%、8%、10%，置于4℃冰箱中12 h，離心(3 500 r/min，8 min)，取上清液棄沉淀，測(cè)各份樣品中蛋白質(zhì)和多糖的含量，計(jì)算每份樣品的蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率。

1.2.5.3 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，并通過考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。

(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制考馬斯亮藍(lán)G-250：稱取考馬斯亮藍(lán)G-250 50 mg，將其溶解于25 mL50%的乙醇中，再加入50 mL85%的磷酸，蒸餾水定容到500 mL容量瓶中備用。

配制牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取10 mg牛血清白蛋白，將其溶于蒸餾水中，并稀釋到100 mL容量瓶中，即得100 ug/mL的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液[17]。

表2 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作步驟

取6只試管，按照表2準(zhǔn)確吸取質(zhì)量濃度為100 ug/mL的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液及蒸餾水，向各管中加入配制好的考馬斯亮藍(lán)G-250溶液5.0 mL ，充分搖勻后靜置5 min。將0號(hào)用作空白調(diào)零，于595 nm 處測(cè)量吸光度。 將吸光度作為縱坐標(biāo)(Y)，蛋白質(zhì)對(duì)照品溶液濃度(mg/mL)作為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸數(shù)據(jù)處理，求得回歸方程為Y=8.498 6X+0.038 6R2=0.974 1。結(jié)果顯示在所設(shè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

圖2 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

(3)樣品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

將樣品溶解，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線中的測(cè)量方法測(cè)量樣品溶液的吸光度，采用回歸方程計(jì)算待測(cè)溶液的蛋白質(zhì)濃度。

蛋白質(zhì)脫除率的計(jì)算方法：

蛋白質(zhì)脫除率(%)=[(C0-C1)/C0]×100%

式中：C0為樣品脫蛋白前的濃度；C1為樣品脫蛋白后的濃度。

多糖損失率的計(jì)算方法：

多糖損失率(%)=[(M0-M1)/M0]×100%

式中：M0為脫蛋白前溶液中紅甜菜多糖的含量；M1為脫蛋白后溶液中紅甜菜多糖的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法提取紅甜菜多糖的結(jié)果

利用熱水浸提法提取紅甜菜粗多糖得率為2.9%，而酶法提取紅甜菜粗多糖得率可達(dá)4.7%，但將提取干燥后的紅甜菜粗多糖稱重，發(fā)現(xiàn)熱水浸提法提取的紅甜菜粗多糖質(zhì)量要比酶法提取的紅甜菜粗多糖質(zhì)量更大。這說明酶法提取紅甜菜粗多糖純度更高雜質(zhì)更少，其效果優(yōu)于熱水浸提法，但酶法的成本要高于熱水浸提法，且實(shí)際操作比熱水浸提法更復(fù)雜，故提取紅甜菜多糖可根據(jù)實(shí)際需求和實(shí)驗(yàn)條件選擇兩種方法。

2.2 不同醇沉條件對(duì)紅甜菜多糖得率的影響

醇沉在熱水浸提法是至關(guān)重要的一步，熱水提取后的紅甜菜粗多糖溶液中有著大量可以溶解在乙醇中的淀粉、鞣質(zhì)、無機(jī)鹽、水溶性色素等雜質(zhì)。多糖不溶于乙醇，故可讓紅甜菜多糖在乙醇中沉淀并被分離。

2.2.1 不同醇沉溫度對(duì)紅甜菜多糖得率的影響

溫度對(duì)紅甜菜多糖的沉淀有著一定的影響，且根據(jù)多糖的一般性質(zhì)來看，應(yīng)是溫度越低，沉淀效果越好。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有條件，設(shè)置了2個(gè)沉淀溫度，4℃和25℃。

圖3 不同醇沉溫度對(duì)紅甜菜多糖得率的影響

由圖3可見，相對(duì)于25℃常溫而言，4℃醇沉的效果更好，紅甜菜多糖的得率更高。醇沉溫度低有利于多糖的沉降。多糖析出的速度在低溫時(shí)更快，短時(shí)間內(nèi)析出的多糖能夠集合沉降，也更有利于多糖的分離。

2.2.2 不同醇沉?xí)r間對(duì)紅甜菜多糖得率的影響

本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了5個(gè)醇沉?xí)r間，以12 h為起點(diǎn)，6小時(shí)為間隔，目的是探究最佳醇沉?xí)r間，使紅甜菜多糖能夠完全沉淀，且避免時(shí)間的浪費(fèi)。

圖4 不同醇沉?xí)r間對(duì)紅甜菜多糖得率的影響

由圖4可見，不同醇沉?xí)r間對(duì)粗多糖得率的影響較小，當(dāng)醇沉?xí)r間達(dá)到24 h時(shí)，可使多糖的析出量達(dá)到最大化，醇沉?xí)r間超過24 h后，多糖的得率不再隨醇沉?xí)r間的延長(zhǎng)而增長(zhǎng)，可見過長(zhǎng)的醇沉?xí)r間對(duì)多糖提取并沒有作用，故熱水浸提法中的最佳醇沉?xí)r間為24 h。

2.2.3 不同乙醇終濃度對(duì)紅甜菜多糖得率的影響

乙醇沉淀終濃度對(duì)多糖的沉淀有著一定的影響，且根據(jù)多糖的一般性質(zhì)來看，應(yīng)該是乙醇沉淀終濃度越高，沉淀效果越好。較低的乙醇終濃度醇沉效果較差，故本實(shí)驗(yàn)以70%的乙醇終濃度為起點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，設(shè)置了5個(gè)乙醇終濃度。

圖5 不同乙醇終濃度對(duì)紅甜菜多糖得率的影響

從圖5中可以看出，多糖的得率隨著醇沉淀中乙醇終濃度的增加而增加，并且在70%-80%的范圍內(nèi)增幅較大。乙醇沉淀終濃度超過80%時(shí)，多糖得率的變化非常小，且高濃度乙醇的配制比較困難，從經(jīng)濟(jì)角度來考慮，高濃度醇沉也會(huì)提高實(shí)驗(yàn)的成本，故可選擇80%作為最佳的乙醇沉淀終濃度。

2.3 紅甜菜多糖脫蛋白結(jié)果及分析

2.3.1 Sevage法中脫蛋白次數(shù)對(duì)紅甜菜多糖的影響

按照1.2.5.1的方法共進(jìn)行了6次脫蛋白實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖6所示。

圖6 Sevage法不同脫蛋白次數(shù)對(duì)紅甜菜多糖的影響

從圖6可以看出，蛋白質(zhì)的去除率隨脫蛋白的次數(shù)而增加，且1-4次時(shí)脫蛋白率隨次數(shù)增長(zhǎng)比較明顯4次后脫蛋白的速率不再顯著增加，可能是因?yàn)榧t甜菜粗多糖中的大部分蛋白質(zhì)已被除去。每一次脫蛋白都會(huì)使樣品中的紅甜菜多糖損失，脫蛋白次數(shù)越多，紅甜菜多糖損失的也越多。綜合蛋白質(zhì)的脫除率和紅甜菜多糖的損失率，Sevage法脫蛋白的最佳次數(shù)應(yīng)為4次，這一條件下，脫蛋白的效果較好，脫蛋白率可達(dá)67.4%，多糖損失率為8.84%。

2.3.2 TCA法中TCA用量對(duì)紅甜菜多糖的影響

按照1.2.5.2的方法得到的不同濃度TCA脫蛋白效果如圖7所示。

圖7 TCA法中TCA用量對(duì)紅甜菜多糖的影響

由圖可知，脫蛋白率和紅甜菜多糖損失率均隨著TCA濃度的增加而增加。當(dāng)TCA濃度為2%-8%時(shí)，脫蛋白率隨TCA濃度增長(zhǎng)較明顯。當(dāng)TCA的濃度為8%時(shí)，脫蛋白率為78%，而紅甜菜多糖損失率只有8.55%；TCA的濃度為10%時(shí)，脫蛋白率可達(dá)到78.9%，這時(shí)，脫蛋白率不再明顯增加且紅甜菜多糖損失率大大提高，比TCA濃度8%時(shí)增加了7.09%，故綜合考慮TCA脫蛋白法中TCA 濃度在8%較為合適。

3 結(jié)論

熱水浸提法與酶法相比，酶法的多糖得率更高，但其成本也更高，在熱水浸提法中可通過適當(dāng)增加提取次數(shù)提高多糖得率。熱水浸提法操作簡(jiǎn)單，成本低，適合實(shí)際生產(chǎn)中大量提取紅甜菜多糖。

乙醇沉淀法是多糖提取分離中一個(gè)非常重要的步驟，本實(shí)驗(yàn)確定了紅甜菜多糖提取最佳醇沉工藝為：醇沉溫度為4℃，乙醇沉淀的最終濃度為80%，醇沉?xí)r間為24 h，這種條件下，紅甜菜多糖得率可達(dá)到4.15%，當(dāng)醇沉?xí)r間超過12 h后，醇沉?xí)r間對(duì)紅甜菜多糖得率的影響甚微，可根據(jù)實(shí)際操作情況適當(dāng)縮減。

Sevage法脫蛋白實(shí)驗(yàn)中最佳脫蛋白次數(shù)為4次，TCA法脫蛋白實(shí)驗(yàn)中TCA的最佳濃度為8%。兩種脫蛋白方法相比，TCA方法操作簡(jiǎn)便，脫蛋白效果好，更適合作為純化紅甜菜多糖的脫蛋白方法。

4 展望

目前，與紅甜菜多糖的生物活性相關(guān)的研究較少，進(jìn)一步探索紅甜菜多糖的生物活性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值有利于提高紅甜菜的利用價(jià)值。

紅甜菜作為一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和醫(yī)療價(jià)值很高的植物，目前的應(yīng)用還是不夠廣泛。一些人將紅甜菜制成面包饅頭等主食，這種食用方式既保證了每餐能夠攝入足量的碳水化合物，還能同時(shí)攝入一定的礦物質(zhì)和維生素，大大發(fā)揮了紅甜菜的食用價(jià)值。在提取實(shí)驗(yàn)的預(yù)處理過程中，紅甜菜干粉散發(fā)出的味道清新香甜，顏色也鮮紅美觀，適合加工為沖劑制成紅甜菜飲品，或是制成片劑作為速食干嚼片等，其商業(yè)價(jià)值不容小覷。