張笑宇,段宏群，王悶靈，李紅麗，蘆阿虔，王 巖

(1.鄭州大學(xué)化工與能源學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.河南省洛陽市煙草公司，河南 洛陽 471000)

煙草是一種易產(chǎn)生連作障礙的農(nóng)業(yè)作物，隨著栽培年限的延長，連作障礙愈來愈顯著，長期烤煙連作對煙葉的產(chǎn)量和質(zhì)量都會產(chǎn)生很大影響[1-2]。輪作不僅是土壤耕作管理的重要措施，而且屬于生態(tài)防治土傳病害的范疇。在烤煙生產(chǎn)上，合理輪作既可以減輕土傳病害，又可以達到增產(chǎn)提質(zhì)的目的。

土壤中存在的大量微生物對于土壤營養(yǎng)元素循環(huán)、植物的生長發(fā)育和作物病蟲害防治等方面均起著極其重要的作用，同時土壤生物學(xué)性狀可以反映土壤質(zhì)量和肥力特征，是評價土壤健康的重要生物學(xué)指標[3]，土壤微生物群落對土傳病害的抑制能力是土壤生態(tài)系統(tǒng)平衡、健康和穩(wěn)定的另一個重要指標[4-5]。以往對于煙草不同種植模式的研究主要關(guān)注土壤養(yǎng)分、煙草農(nóng)藝性狀等變化[6-8]，對于根際土壤微生物區(qū)系的研究較少，同時對土壤微生物的研究大多采用傳統(tǒng)平板涂布分析方法，此方法僅能分離出不到1%的土壤微生物，而現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)為不可培養(yǎng)微生物分析提供了有利的手段，具有檢測限低、靈敏度高等優(yōu)勢。因此，論文采用高通量測序技術(shù)，研究連作和輪作對煙田根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、分布特征等的影響，明確煙田根際土壤微生物群落的變化規(guī)律，為利用生物技術(shù)提高煙田土壤健康的措施提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 煙田概況與材料

在充分調(diào)研的基礎(chǔ)上，2016年在洛陽市洛寧縣羅嶺鄉(xiāng)講理村和上戈鎮(zhèn)上坡村，選取長期輪作的煙田(玉米-煙草)Ro和連續(xù)種煙5年的煙田CC5。該煙區(qū)的主要土傳病害是黑脛病、根腐病和根結(jié)線蟲病，并且這3種病害易并發(fā)，因此，本研究過程在對煙田土傳病害進行調(diào)研時，將這3種病害進行合并統(tǒng)計。洛寧煙區(qū)4～9月平均溫度21.75℃，合計降水量425.56 mm，日照時間1 699.16 h，平均相對濕度75.31%，試驗田概況和土壤基本性狀如表1和表2所示。分別于移栽前、旺長期和成熟期采樣，按蛇型5點取樣法，取0～20 cm根際土壤，采用四分法將土壤混勻并編號[9]，將土樣帶回實驗室處理：部分風(fēng)干過篩用于土壤理化性狀測定，部分置于4℃冰箱保存，用于檢測實驗室可培養(yǎng)微生物數(shù)量；部分裝離心管-20℃冷凍保存，委托生工生物工程(上海)股份有限公司對土壤微生物多樣性進行測定和分析。

表1 試驗田概況

表2 煙田土壤理化性狀

1.2 試驗方法

1.2.1 土壤理化性質(zhì)測定方法

用常規(guī)方法測定土壤pH值和含水率；用重鉻酸鉀-油浴法測定土壤有機質(zhì)；用硫酸消解-凱氏定氮法測定土壤全氮；用乙酸銨提取-火焰光度法測定土壤速效鉀；用碳酸氫鈉提取-鉬銻抗比色法測定土壤有效磷；用堿解擴散法測定土壤堿解氮[10]。

1.2.2 可培養(yǎng)微生物數(shù)量的測定

土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量采用稀釋平板法[11]:細菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；真菌用孟加拉紅培養(yǎng)基；放線菌用高氏1號培養(yǎng)基。

1.2.3 微生物多樣性分析測定

土壤樣品送生工生物工程(上海)股份有限公司進行高通量多樣性測序分析。土壤樣本經(jīng)過預(yù)處理后，利用試劑盒提取DNA。對提取到的DNA利用瓊脂糖電泳檢測，檢查DNA的完整度，利用檢測試劑盒精確定量基因組DNA，確定PCR反應(yīng)加入的DNA量。以全部基因組DNA為模板，細菌16S rDNA引物分別為341F和805R；真菌18S rDNA引物分別為NS1和Fung，進行PCR擴增，采用瓊脂糖回收試劑盒對DNA進行回收。

OTU數(shù)表示煙田根際土壤中檢測到的物種數(shù)量。香濃指數(shù)衡量群落之間的差異性， Chao1指數(shù)是計算得到的土壤微生物物種總數(shù)[8]。

在本試驗分析中，屬水平和門水平群落結(jié)構(gòu)分布圖只顯示了物種豐度占比的前10位。

聚類樹狀圖通過樹枝結(jié)構(gòu)直觀地反應(yīng)多個樣本間的相似度和差異關(guān)系。

1.2.4 煙株發(fā)病情況調(diào)查

在煙株成熟期，按照GB/T 23222—2008煙草病蟲害分級及調(diào)查方法調(diào)查各小區(qū)煙株(每個小區(qū)調(diào)查100株)的病害發(fā)生情況。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均采用Excel 2013和SPSS 21軟件進行統(tǒng)計分析。多樣性基因測序由公司相應(yīng)軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 輪作和連作煙田根際土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量的變化

在煙株生長的過程中，輪作和連作煙田根際土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量結(jié)果如表3所示。由表3可知，煙田根際土壤中細菌、放線菌和真菌數(shù)量移栽前均較少，旺長期明顯增多，且放線菌的增幅遠高于細菌和真菌，到成熟期可培養(yǎng)微生物數(shù)量又有不同程度的下降。這主要是由于旺長期溫度適宜，煙株根系生長旺盛,根系分泌物增加，從而導(dǎo)致可培養(yǎng)微生物數(shù)量顯著增長[12]；成熟期煙株根系活力下降,根系分泌物減少，甚至分泌一些有毒物質(zhì)[13-14]，不利于微生物的生長，導(dǎo)致成熟期微生物數(shù)量下降。從表3還可知，在煙株生長過程中，輪作煙田根際土壤可培養(yǎng)細菌和放線菌的數(shù)量均高于連作煙田，且在旺長期細菌呈現(xiàn)顯著性差異。細菌是土壤中優(yōu)勢微生物，在土壤環(huán)境中對物質(zhì)和能量的轉(zhuǎn)化起主要作用，放線菌則可改善土壤團粒結(jié)構(gòu)，代謝產(chǎn)物中含有生長激素，且放線菌產(chǎn)生的抗生素能抑制病原菌，控制病蟲害發(fā)生[15]。因此，輪作煙田根際土壤中細菌和放線菌數(shù)量的提高對抑制土傳病害具有重要的意義。該輪作和連作煙田之間可培養(yǎng)細菌和放線菌的變化趨勢與李鑫等[16]的研究一致。輪作煙田根際土壤中可培養(yǎng)真菌在移栽前高于連作煙田，但未達到顯著性差異，到旺長期和成熟期則低于連作煙田，說明連作煙田根際土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)從細菌型逐漸向真菌型轉(zhuǎn)化，與張仕祥等[17]研究結(jié)果相同。

表3 煙田根際土壤中可培養(yǎng)微生物數(shù)量 (104cfu/g干土)

注：不同的小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。

2.2 不同煙田根際土壤微生物Alpha多樣性分析

Alpha多樣性也稱為生境內(nèi)物種多樣性，關(guān)注均勻生境下的物種數(shù)目[18]。利用Alpha多樣性分析中的OTU數(shù)、香濃指數(shù)和Chao1指數(shù)分析煙田根際土壤中微生物的多樣性。輪作煙田和連作煙田根際土壤微生物Alpha多樣性的結(jié)果如表4所示。

表4 煙田根際土壤微生物Alpha多樣性分析

由表4可知，在煙株生長過程中，輪作煙田根際土壤細菌的OTU數(shù)、香濃指數(shù)和Chao1指數(shù)均高于連作煙田。輪作煙田在移栽前真菌群落OTU數(shù)、香濃指數(shù)和Chao1指數(shù)均高于連作煙田；旺長期輪作煙田真菌群落OTU數(shù)高于連作煙田，香濃指數(shù)和Chao1指數(shù)則低于連作煙田；成熟期輪作煙田真菌群落OTU數(shù)、香濃指數(shù)高于連作煙田，而Chao1指數(shù)低于連作煙田。對Alpha多樣性分析可知，相較于煙草連作，輪作能夠提高微生物群落多樣性，與之前賈志紅等[19]的研究一致。

2.3 不同煙田根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)相似度分析

聚類樹狀圖反應(yīng)多個樣本間的相似度和差異性，輪作和連作煙田根際土壤微生物在屬水平上的群落聚類樹狀圖如圖1所示。

圖1不同煙田根際土壤微生物群落在屬水平上的聚類樹狀圖

從圖1a可以看出，移栽前輪作和連作煙田根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)比較相似，旺長期和成熟期不同土壤之間細菌群落結(jié)構(gòu)則存在較大的差異性。隨著煙株生長，輪作和連作煙田根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)趨于相似，而與移栽前差異較大。圖1b真菌群落結(jié)構(gòu)相似度的變化趨勢與細菌一致。

2.4 不同煙田根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分布規(guī)律

微生物在門水平上不同種植模式煙田根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)分布如圖2。輪作和連作煙田根際土壤優(yōu)勢菌門是Proteobacteria(變形菌門)，相對豐度在30.98%～54.84%，其次為Acidobacteria(酸桿菌門)相對豐度在10.35%～23.24%、Actinobacteria(放線菌門)相對豐度4.52%～10.51%。輪作煙田中Proteobacteria相對豐度在煙株生長過程中的變化趨勢與可培養(yǎng)細菌數(shù)量變化趨勢一致，呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，旺長期達到最高。

根據(jù)多樣性測序結(jié)果可知，移栽前輪作煙田與連作煙田根際土壤微生物在屬水平上分別檢測出細菌543類和429類，旺長期分別為421類和350類，成熟期分別為359類和369類。

不同種植模式煙田根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)分布如圖3所示，煙株生長發(fā)育的3個時期中Gp6、Gemmatimonas(芽單胞菌屬)、Sphingomonas(鞘脂單胞菌屬)和Pseudomonas(假單胞菌屬)、Citrobacter(檸檬酸細菌屬)均為優(yōu)勢菌屬。輪作和連作煙田上述6種優(yōu)勢細菌屬在移栽前的相對豐度分別占19.66%和21.85%，旺長期分別占30.95%和26.53%，成熟期分別占33.55%和26.01%，表明輪作和連作根際土壤優(yōu)勢細菌在屬水平上的差異較小，但在旺長期和成熟期土壤優(yōu)勢菌屬的相對豐度要高于移栽前。

圖2 不同種植模式煙田根際土壤細菌在門水平上的群落結(jié)構(gòu)分布圖

圖3 不同種植模式煙田根際土壤細菌在屬水平上的群落結(jié)構(gòu)分布圖

從圖3中還可知，在旺長期輪作煙田根際土壤中相對豐度為14.22%的Citrobacter，遠遠高于連作煙田(相對豐度為3.01%)。有文獻表明Citrobacter作為益生菌能夠抑制番茄青枯病的發(fā)生[20]。因此，推斷Citrobacter對煙草土傳病害的發(fā)生也存在一定的抑制作用。Sphingomonas是土壤主要有益菌之一，可促進煙株根際吸收營養(yǎng)，抵抗多種病原菌，還有研究表明，鞘脂單胞菌屬中某些菌株具有固氮和脫氫特性，在維持土壤氮平衡方面起著重要作用[21]。輪作煙田根際土壤中Sphingomonas的相對豐度隨著煙株生長逐漸增加，并且高于連作煙田。旺長期和成熟期輪作煙田根際土壤中Pseudomonas(假單胞菌屬)豐度也高于連作煙田，Pseudomonas可抑制煙草黑脛病病原菌[22]，Serratia(沙雷氏菌屬)作為有益菌屬[23]也只存在于輪作煙田土壤中。

兩種不同種植模式煙田根際土壤真菌在門水平上的群落結(jié)構(gòu)分布如圖4所示。煙田根際土壤優(yōu)勢菌門有Ascomycota(子囊菌門)，相對豐度為15.40%～77.80%，其次是Basidiomycota(擔子菌門)，相對豐度為6.53%～33.28%，Cercozoa(絲足蟲類)相對豐度為1.85%～45.06%。移栽前煙田根際土壤中Ascomycota相對豐度遠高于旺長期和成熟期，這也解釋了真菌群落聚類樹狀圖移栽前與旺長期和成熟期真菌群落結(jié)構(gòu)差異性較大的原因。另外，輪作煙田旺長期和成熟期根際土壤中Ascomycota和Basidiomycota的相對豐度均高于連作煙田。

圖4 同種植模式煙田根際土壤真菌在門水平上的群落結(jié)構(gòu)分布圖

根據(jù)多樣性測序結(jié)果，移栽前輪作煙田與連作煙田根際土壤真菌在屬水平上分別檢測出250類和246類，旺長期分別為226類和199類，成熟期分別為235類和209類。

不同種植模式煙田根際土壤真菌在屬水平上的群落結(jié)構(gòu)分布如圖5所示，移栽前輪作和連作煙田根際土壤的優(yōu)勢真菌屬是Penidiella、Gibberella、Setomelanomma、Protostelium，總相對豐度分別占54.88%和64.25%。旺長期輪作煙田根際土壤優(yōu)勢真菌屬是Conocybe、Cryptococcu、Aspergillus、Penidiella、Gibberella、Pleospora，相對豐度占52.78%，連作煙田優(yōu)勢真菌屬為Rhogostoma、Pythium、Spizellomyces、Cystofilobasidium、Setomelanomma、Amb-18S-1092、Sterigmatomyces、Vermamoeba，相對豐度共占69.43%。成熟期輪作煙田根際土壤優(yōu)勢真菌屬為Conocybe、Penicillium、Turbinellus、Penidiella、Thielavia、Microascus、Brachyconidiellopsis，相對豐度共占40.39%，連作煙田優(yōu)勢真菌屬為Amb-18S-1092、Zoophagus、Sterigmatomyces、Vermamoeba、Pythium、Pseudogymnoascus、Absidia、Cystofilobasidium、Thielavia，相對豐度共占62.64%。由此可見，煙株移栽前輪作和連作煙田之間優(yōu)勢真菌屬的種類和相對豐度差異較小，但進入旺長期和成熟期后優(yōu)勢真菌屬則出現(xiàn)較大差異。

從圖5中還可以看出，輪作煙田根際土壤中有益菌Conocybe[24-25]在旺長期和成熟期的相對豐度分別為19.09%、14.28%，遠高于連作煙田，有研究表明，對青枯病病原菌有拮抗效果的真菌屬Aspergillus在旺長期相對豐度也高于連作煙田[26]。而Pythium作為根腐病的病原菌所在屬[27-28]，只存在于連作煙田中。

圖5 不同種植模式煙田根際土壤真菌在屬水平上的群落結(jié)構(gòu)分布圖

3 結(jié)論與討論

本文測定分析了玉米-煙草輪作煙田與煙草連作煙田根際土壤微生物數(shù)量和結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律。結(jié)果表明，在煙株生長過程中，實驗室可培養(yǎng)細菌、放線菌和真菌數(shù)量均呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢，并在旺長期達到最大。輪作煙田根際土壤可培養(yǎng)細菌和放線菌數(shù)量高于連作煙田。輪作煙田根際土壤可培養(yǎng)真菌的數(shù)量低于連作煙田，表明煙草連作導(dǎo)致了土壤微生物結(jié)構(gòu)從細菌型向真菌型的轉(zhuǎn)化。利用分子生物學(xué)方法研究輪作與連作煙田根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果表明，輪作煙田根際土壤細菌和真菌群落多樣性均高于連作煙田，煙草連作使得土壤微生物的群落趨向單一化。通過對微生物聚類樹狀圖分析發(fā)現(xiàn)，輪作和連作煙田在旺長期和成熟期微生物群落結(jié)構(gòu)差異較大，進一步對微生物群落結(jié)構(gòu)組成分析發(fā)現(xiàn)，輪作煙田根際土壤中有益細菌如Citrobacter、Sphingomonas、Pseudomonas、Serratia等相對豐度均高于連作煙田。旺長期和成熟期輪作煙田真菌在門水平上Ascomycota和Basidiomycota相對豐度高于連作煙田，在屬水平上Conocybe(錐蓋傘屬)、Aspergillus(曲霉屬)等拮抗菌相對豐度也高于連作煙田，而在連作煙田根際土壤中出現(xiàn)Pythium(腐霉屬)病原菌屬，該菌屬在輪作煙田中并未出現(xiàn)。