劉慧銘 王圓圓 郭兵

[摘要]腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是機體內(nèi)重要的能量感受調(diào)節(jié)器，廣泛存在于真核生物中。AMPK不僅能調(diào)節(jié)能量代謝，還有促進自噬、誘導(dǎo)凋亡、調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和抗炎癥等作用。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，AMPK可以通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、抑制多條致纖維化信號通路等來防止腎臟纖維化的發(fā)生。因此，AMPK有望成為腎臟纖維化防治的新方法。AMPK及其抑制腎臟纖維化的相關(guān)機制將為臨床上腎臟纖維化的防治提供新的靶點和依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]腺苷酸活化蛋白激酶；糖尿??；腎臟纖維化；氧化應(yīng)激

[中圖分類號] R339.21 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）9（b）-0027-04

[Abstract] Adenylate-activated protein kinase （AMPK） is an important energy-sensing regulator in the body， and is widely present in eukaryotes. AMPK can not only regulate energy metabolism， but also promote autophagy， induce apoptosis， regulate oxidative stress and anti-inflammatory effects. More and more studies have found that AMPK can prevent renal fibrosis by regulating oxidative stress and inhibiting multiple fibrotic signaling pathways. Therefore， AMPK is expected to become a new method for the prevention and treatment of kidney fibrosis. AMPK and its related mechanisms for inhibiting renal fibrosis will provide new targets and basis for clinical prevention and treatment of renal fibrosis. This article gives a brief review of the relationship between AMPK and kidney fibrosis.

[Key words] Adenylate-activated protein kinase； Diabetes； Renal fibrosis； Oxidative stress

腎臟纖維化是各種腎臟疾病終末期的主要病理特征和最終通路，其本質(zhì)為機體失敗的自身損傷修復(fù)過程，目前尚無特異性治療方法。腎臟固有細胞的激活、增殖甚至分化轉(zhuǎn)換導(dǎo)致細胞外基質(zhì)的大量沉積和腎小球硬化是腎臟纖維化形成的關(guān)鍵。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是重要的能量感受器，能調(diào)節(jié)機體能量的代謝平衡。近年來研究顯示，糖尿病治療藥物二甲雙胍可以通過激活A(yù)MPK來抑制腎臟纖維化；同時也有文獻報道，AMPK的其他激動劑如5-氨基4-酰胺咪唑核糖核苷酸（5-Aminoimidazol-4-carboxamde1-β-D-ribofuranoside，AICAR）可以通過激活A(yù)MPK達到抑制腎臟纖維化的作用。因此，AMPK抑制腎臟纖維化的相關(guān)機制已成為臨床上腎臟纖維化防治的研究熱點，以期為抗擊腎臟纖維化提供新的藥物靶點。本文就AMPK和腎臟纖維化的關(guān)系進行簡要綜述。

1 AMPK的結(jié)構(gòu)和活性調(diào)節(jié)

1.1 AMPK的結(jié)構(gòu)

AMPK復(fù)合物存在于幾乎所有的真核生物中，不同物種的AMPK蛋白均以一種異源三聚體復(fù)合物的形式存在，由一個催化亞基（α1或α2）、支架β亞基（β1或β2）和調(diào)節(jié)性γ亞基（γ1，γ2和γ3）構(gòu)成的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合物，且所有亞基都由獨立的基因編碼。AMPKα亞基含有參與復(fù)合物形成的N端激酶結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域， N端是催化核心部位， 其Thr172 位點的磷酸化被作為AMPK激活的標(biāo)志。AMPK的β亞基在其N端部分含有碳水化合物結(jié)合模塊（CBM），其C端部分有參與結(jié)合AMPKα和AMPKγ亞基的αγ-亞基結(jié)合序列（αγ-SBS）結(jié)構(gòu)域， β亞基的C末端部分充當(dāng)與α和γ亞基相互作用的支架，可以連接α、γ亞單位一起形成AMPK異構(gòu)體的核心部位。γ亞基有4個串行重復(fù)的CBS區(qū)域，以相鄰兩個CBS區(qū)域為一個Bateman結(jié)構(gòu)域，用于選擇性結(jié)合AMP或ADP。

1.2 AMPK的活性調(diào)節(jié)

AMPK的激活通常依賴α亞基N端“激活環(huán)”中保守的172位蘇氨酸殘基（Thr172）發(fā)生磷酸化，但這并非絕對，在Scott等[1]的實驗中，在Thr172未被磷酸化的情況下，小分子藥物A769662依然能夠激活A(yù)MPK且其活性水平近似磷酸化Thr172的狀態(tài)。AMPK的激活一般認為有兩種方式： ①AMP變構(gòu)激活A(yù)MPK：AMP或模擬細胞AMP的小分子通過連接到γ亞基引發(fā)了AMPK復(fù)合物的構(gòu)象變化，從而進一步磷酸化AMPKα亞基中Thr-172位點激活A(yù)MPK，而AMP與AMPKγ的結(jié)合也使得AMPK Thr172 位點不易被磷酸酶脫磷酸化而失活。②AMPK上游激酶AMPKK：絲氨酸-蘇氨酸激酶11（serine/threonine kinase11，LKB1）、轉(zhuǎn)化生長因子β 激活蛋白激酶1（TGF-β-activated kinase 1，TAK1）和鈣離子/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶激酶β（calmodulin-dependent proteinkinase kinase β，CaM KKβ），均通過磷酸化α亞基上Thr172位點激活A(yù)MPK。關(guān)于AMPK的激活劑近年來研究廣泛[2]，主要分為直接激活劑和間接激活劑。直接激活劑包括AICAR、噻吩并吡啶酮（A-769662）和苯并咪唑（化合物911）衍生物、水楊酸鹽以及Compound-13等等；而間接激活劑，實際上AMPK可以被任何能導(dǎo)致AMP或鈣積累的調(diào)節(jié)劑激活，這些激活劑被歸類為間接激活劑，如雙胍類、噻唑烷二酮（也可稱作格列酮類）、多酚（如白藜蘆醇、槲皮素和小檗堿等）、人參皂苷、α-硫辛酸等。

2 AMPK的生物學(xué)功能

AMPK不僅能調(diào)節(jié)能量代謝，還有促進自噬、誘導(dǎo)凋亡、調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和抗炎癥等作用。AMPK磷酸化激活下游靶蛋白而增強產(chǎn)能代謝反應(yīng)并抑制耗能代謝途徑，從而維持細胞能量穩(wěn)態(tài)。AMPK是自噬通路的上游分子，相關(guān)研究顯示，AMPK可以通過直接磷酸化蛋白激酶復(fù)合物ULK1和脂質(zhì)激酶復(fù)合物PI3KC3/VPS34來激活自噬[3]，從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。誘導(dǎo)細胞凋亡方面，活化的AMPK可磷酸化腫瘤抑制蛋白p53上的絲氨酸15位點（Ser15），促使p53在線粒體聚集并誘導(dǎo)細胞凋亡；AMPK還可以磷酸化激活c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK），JNK進而激活轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）促進促凋亡蛋白Bim轉(zhuǎn)錄最終誘導(dǎo)細胞凋亡，而JNK也可直接磷酸化激活Bim來調(diào)節(jié)凋亡。激活A(yù)MPK可以減少活性氧的積累，從而減輕氧化應(yīng)激的作用，并通過增加還原型輔酶Ⅱ的合成以及限制其分解，最終達到保護細胞免受氧化應(yīng)激的破壞[4]。AMPK的抗炎效應(yīng)多伴有對核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的抑制作用，AMPK主要通過下游沉默信息調(diào)節(jié)因子SIRT1、轉(zhuǎn)錄因子FoxO3a、抑癌基因p53、過氧化物酶體增殖活化受體γ輔助活化因子1α等間接調(diào)節(jié)NF-κB活性， 抑制炎性因子表達以發(fā)揮抗炎作用[5]。

3 AMPK在纖維化過程中的作用

纖維化是由原發(fā)性炎性損傷、效應(yīng)細胞的調(diào)節(jié)和ECM分泌三個緊密相連的過程組成的動態(tài)反應(yīng)，其實質(zhì)是效應(yīng)細胞對各種因素導(dǎo)致組織細胞損傷引起的炎癥的增生修復(fù)過程。在纖維化的第一階段，受損的細胞釋放細胞因子如IL-1和腫瘤壞死因子（TNFα）等，細胞因子募集炎癥細胞介導(dǎo)炎癥反應(yīng)并促進纖維化。C1q/腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白-6（CTRP6）是一種新發(fā)現(xiàn)的脂聯(lián)素旁系同源物，其通過激活A(yù)MPK抑制了TGF-β1和α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的表達，而用AMPK抑制劑處理后消除了CTRP6對TGF-β1誘導(dǎo)的心肌纖維化的保護作用，提示AMPK改善了炎癥誘導(dǎo)的纖維化[6]。在細胞因子與生長因子持續(xù)不停地刺激下，效應(yīng)細胞（如成纖維細胞、肝星狀細胞和間充質(zhì)細胞等）呈現(xiàn)持續(xù)活化增殖狀態(tài)并合成大量的細胞外基質(zhì)（extracellular matrixc，ECM）成分，而受損細胞可發(fā)生表型轉(zhuǎn)換轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，此階段是纖維化發(fā)生的重要階段。Lu等[7]用TGF-β誘導(dǎo)腎成纖維細胞分泌I型膠原蛋白，而二甲雙胍通過激活A(yù)MPK下調(diào)Smad3從而下調(diào)結(jié)締組織生長因子（CTGF）抑制了膠原的產(chǎn)生，最終抑制間質(zhì)纖維化?？滤_奇B3病毒誘導(dǎo)新生兒心臟成纖維細胞增殖和膠原分泌增加，而通過AICAR激活A(yù)MPK可抑制柯薩奇B3病毒誘導(dǎo)的心臟纖維化[8]。Qiu等[9]發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)、體外敲低AMPKα2后，β-catenin和Smad3上調(diào)，增強了腎臟上皮細胞向間充質(zhì)轉(zhuǎn)換（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和腎纖維化。這些發(fā)現(xiàn)提示敲低AMPK或抑制AMPK活性可加重組織器官的纖維化，而激活A(yù)MPK可抑制組織器官纖維化的發(fā)生發(fā)展，AMPK在纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。

4 AMPK抑制腎臟纖維化的相關(guān)機制

4.1 AMPK與氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激是氧化與抗氧化防御機制的失衡，導(dǎo)致多種信號通路的異常激活，從而產(chǎn)生大量的活性氧和脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物，最終導(dǎo)致組織過氧化損傷。腎臟纖維化的發(fā)生、發(fā)展與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。氧化應(yīng)激反應(yīng)不僅導(dǎo)致腎臟內(nèi)環(huán)境改變和腎固有細胞受損，持續(xù)的過氧化刺激促進細胞外基質(zhì)的沉積加快腎臟纖維化進程。更重要的是，氧化應(yīng)激過程中產(chǎn)生大量的活性氧類（reactive oxygen species，ROS）作為重要的細胞內(nèi)第二信使，活化多條致腎臟纖維化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括TGF-β1/Smads、 PI3K/Akt/mTOR、MAPK、ERK等信號通路來促進腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展。AMPK在高糖刺激下失活引起ROS生成增多，ROS激活ERK1/2信號通路誘導(dǎo)腎成纖維細胞增殖和活化加快腎纖維化進程[10]。Shin等[11]使用抗氧化劑，包括N-乙酰半胱氨酸（NAC，ROS清除劑），NOX抑制劑（apocynin），線粒體電子抑制劑轉(zhuǎn)移鏈亞單位I（mitoQ）緩解了TGF-β1誘導(dǎo)的人腹膜間皮細胞的EMT，并發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可通過激活A(yù)MPK來調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激，增強抗氧化物如超氧化物歧化酶（superoxide orgotein dismutase，SOD）的活性和表達，減少ROS的生成，從而緩解人腹膜間皮細胞的EMT和纖維化。Hong等[12]發(fā)現(xiàn)，在糖尿病腎病中，細胞外超氧化物歧化酶（EC-SOD）通過激活A(yù)MPK發(fā)揮腎臟保護作用，包括改善db/db小鼠的蛋白尿、系膜擴張和間質(zhì)纖維化等。

4.2 AMPK與PI3K/Akt /mTOR信號通路

PI3K/Akt/mTOR信號通路是一條介導(dǎo)腎臟纖維化的信號通路[13]。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，蛋白激酶B（Akt）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能夠磷酸化數(shù)種蛋白，下游效應(yīng)蛋白為雷帕霉素靶體蛋（mammalian targetofrapamycin，mTOR）。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其蛋白復(fù)合物mTORC1激活可以調(diào)節(jié)下游代表性信號分子4E結(jié)合蛋白（4EBP）和磷蛋白70 S6激酶（p70S6K），從而促進蛋白合成和細胞增殖，導(dǎo)致腎小球肥大、系膜基質(zhì)沉積以及腎小球基底膜增厚，加重腎臟纖維化進程。在高糖刺激體外培養(yǎng)的腎小管上皮細胞和用STZ造模后的糖尿病大鼠腎臟皮質(zhì)中均發(fā)現(xiàn)mTORC1/p70S6K高度活化和EMT，而AMPK激活劑槲皮素可以在體內(nèi)和體外抑制mTORC1/p70S6K活化從而抑制腎小管上皮細胞向間充質(zhì)轉(zhuǎn)換和腎臟纖維化[14]。Dong等[15]研究發(fā)現(xiàn)，AMPK可以通過下調(diào)mTOR來緩解高糖刺激誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞EMT，提示AMPK可能通過mTOR通路發(fā)揮對腎臟纖維化的抑制作用。

4.3 AMPK與足細胞的自噬

足細胞為高度特化的細胞，參與腎小球濾過膜的構(gòu)成，對于基膜更新、維持基膜通透性等有重要功能，足細胞損傷或缺失將促使腎小球硬化。正常生理狀態(tài)下的足細胞具有較高的自噬活性，通過溶酶體降解衰老的細胞器、大分子蛋白和有害物質(zhì)，并將降解產(chǎn)物送至胞漿重新利用，以維持自身動態(tài)平衡。AMPK影響自噬的主要通路有兩條，即細胞質(zhì)中AMPK-mTOR信號通路和細胞核內(nèi)AMPK-SKP2-CARM1信號通路。在葡萄糖缺乏時，AMPK通過直接磷酸化Ser 317和Ser 777位點直接激活ULK1來促進自噬[16]，在細胞核內(nèi)，AMPK磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a來抑制SKP2的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1（CARM1）蛋白水平升高，CARM1通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子EB（TFEB）對自噬相關(guān)基因和溶酶體基因發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活自噬的功能[17]。用遺傳學(xué)方法敲除小鼠中LC3基因以抑制自噬，導(dǎo)致腎臟中膠原蛋白的表達和沉積增加，促進腎纖維化[18]，腎臟自噬受損與糖尿病腎病的發(fā)病有關(guān)，自噬的恢復(fù)具有腎臟保護作用[19-20]。哺乳動物mTOR可以抑制自噬[21]，而激活A(yù)MPK可抑制mTOR信號通路并促進多種細胞的自噬。Jin等[22]實驗表明，小檗堿可以通過促進AMPK活化增強足細胞自噬并防止了高糖引起的足細胞損傷。Kim 等[23]研究顯示脂聯(lián)素通過脂聯(lián)素受體通過激活細胞內(nèi)Ca2+/LKB1-AMPK/過氧化物酶體增殖物激活受體-α（PPARα）途徑改善足細胞損傷，對糖尿病腎?。―N）發(fā)揮腎臟保護作用。

4.4 AMPK的下游靶蛋白（tuberin）

tuberin是由一種抑癌基因TSC2編碼的生長抑制蛋白，該基因胚系突變可導(dǎo)致結(jié)節(jié)性硬化癥。tuberin被證實為AMPK的下游靶蛋白，AMPK可以通過直接磷酸化其特定殘基如Ser1387將其激活[24]。Thakur等[25]的研究表明，在TGF-β1轉(zhuǎn)基因小鼠的腎皮質(zhì)中，AMPK和tuberin的磷酸化均顯著降低，同時伴有纖連蛋白、α-SMA的升高以及鈣粘蛋白的降低，纖維化指標(biāo)明顯，這種變化與TGF-β刺激下的腎小管上皮細胞變化一致，加入AMPK激動劑如二甲雙胍后，可以增加tuberin的活化并逆轉(zhuǎn)TGF-β誘導(dǎo)的纖維化效應(yīng)，提示活化的AMPK通過磷酸化tuberin的Ser1387位點來發(fā)揮抑制纖維化的效應(yīng)。

5總結(jié)與展望

目前糖尿病終末期腎病患者的數(shù)量依舊在穩(wěn)步增加且尚無有效治療方案，因此開發(fā)有效的抗腎臟纖維化藥物就顯得尤為重要。AMPK可以通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、自噬和抑制多條致纖維化信號通路來防止糖尿病腎臟纖維化的發(fā)生，積極探索AMPK的下游靶點將有助于明確AMPK的調(diào)節(jié)腎臟纖維化的具體機制。然而，目前關(guān)于AMPK抗纖維化的下游靶蛋白并未完全明確，AMPK的具體抗纖維化作用機制尚未完全探索清楚。明確AMPK的抗纖維化詳細機制及其更多的下游靶點的發(fā)現(xiàn)將為抗纖維化藥物的藥物篩選靶點提供有力支撐，對防治腎臟纖維化具有重大意義。

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