張 碩，劉穎昳，周 智，徐 琦，吳佳俊，翟新驗(yàn)，楊 林

(中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心OIE豬繁殖與呼吸綜合征參考實(shí)驗(yàn)室，北京 102618)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)(又名豬藍(lán)耳病)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV)引起的以母豬繁殖障礙、早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎及仔豬呼吸綜合征為特征的高度接觸性傳染病[1]。PRRSV可根據(jù)基因型分為美洲型和歐洲型，按臨床表現(xiàn)差異，美洲型PRRSV可分為經(jīng)典PRRSV和高致病性PRRSV。高致病性PRRSV以高度接觸性傳播、全身出血、肺部實(shí)變和母豬繁殖障礙為特征，仔豬、育肥豬和成年豬均可發(fā)病和死亡，其中仔豬發(fā)病率可達(dá)100%、病死率可達(dá)50%以上，母豬流產(chǎn)率可達(dá)30%以上[2]。

2006年在我國(guó)豬群中暴發(fā)高致病性豬藍(lán)耳病疫情，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，為了對(duì)該病進(jìn)行有效的防控，許多單位開始研發(fā)針對(duì)高致病性豬藍(lán)耳病的疫苗。2007年研發(fā)出高致病性豬藍(lán)耳病滅活疫苗用于該病的防控。2009年高致病性豬藍(lán)耳病活疫苗研發(fā)成功，并開始廣泛使用，并逐漸替代之前的滅活疫苗和經(jīng)典株活疫苗，進(jìn)而有效控制了高致病性PRRS的傳播和再流行[3]。該病大范圍暴發(fā)流行逐漸降低，呈零星散發(fā)或小范圍流行，尤其是在原種豬場(chǎng)，該病基本鮮有報(bào)道，因此，許多原種豬場(chǎng)開始停止使用高致病性豬藍(lán)耳病活疫苗進(jìn)行該病的免疫防控。

為了解和掌握原種豬場(chǎng)豬藍(lán)耳病疫苗使用情況及最新的病原流行情況，對(duì)2014年-2016年全國(guó)原種豬場(chǎng)PRRS疫苗的免疫策略和病原陽(yáng)性情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、檢測(cè)和分析。根據(jù)免疫策略將全國(guó)和各個(gè)地區(qū)豬場(chǎng)分為不免疫、免疫高致病性PRRS活疫苗、免疫經(jīng)典PRRS活疫苗3個(gè)組別，分析不同免疫策略情況下該病病原陽(yáng)性情況，進(jìn)而掌握疫苗免疫與疫病流行之間的相關(guān)性，根據(jù)豬場(chǎng)免疫策略和PRRS病原陽(yáng)性情況給出該病的防控建議。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 總核酸提取試劑盒(MAGMAX-96 viral isolation kit )，ABI公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒(E.Z.N.A.?Gel Extraction kit )，OMEGA公司產(chǎn)品；一步法熒光RT-PCR試劑盒(One step prime scriptTMRT-PCR Kit (Perfect real time))，TaKaRa公司產(chǎn)品；AMV reverse transcriptase、RNase inhibitor、GoTaqDNA polymerase、pEASY-T3 Cloning kit試劑盒，Promega公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要儀器 Tissuelyser Ⅱ組織研磨儀，QIAGEN公司產(chǎn)品；KingFisher96磁珠純化儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；Tpersonal型PCR儀，德國(guó)Biometra公司產(chǎn)品；PAC300型電泳儀，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；MCO-175二氧化碳培養(yǎng)箱，日本三洋電機(jī)株式會(huì)社產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 調(diào)研 2014年-2016年分別在全國(guó)94、87和87家原種豬場(chǎng)進(jìn)行調(diào)研，內(nèi)容包括PRRS免疫策略、疫苗種類和毒株等。根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，將豬場(chǎng)分為不免疫、免疫高致病株、免疫經(jīng)典株3個(gè)組進(jìn)行分析。采樣的原種豬場(chǎng)分布在安徽、北京、福建、甘肅、廣東、廣西、海南、河北、河南、黑龍江、湖北、湖南、吉林、江蘇、江西、遼寧、內(nèi)蒙、山東、山西、陜西、上海、四川、天津、新疆、云南、浙江、重慶等27個(gè)省市自治區(qū)，2015和2016年采樣地區(qū)未包括甘肅。各省市自治區(qū)按照如下劃分區(qū)域并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析：東北地區(qū)：遼寧、吉林、黑龍江；華北地區(qū)：河北、山西、內(nèi)蒙古、北京、天津；華東地區(qū)：山東、江蘇、安徽、浙江、臺(tái)灣、福建、江西、上海；華中地區(qū)：河南、湖北、湖南；華南地區(qū)：廣東、廣西、海南；西南地區(qū)：云南、貴州、四川、西藏；西北地區(qū)：新疆、陜西、寧夏、青海、甘肅。

1.2.2 采樣 使用扁桃體采樣器采集母豬、公豬和后備母豬扁桃體。每個(gè)豬場(chǎng)采集樣品40份，樣品原則上來(lái)源于不少于3棟豬舍的豬只，其中包含種公豬5頭，經(jīng)產(chǎn)母豬25頭(1胎～2胎5頭，3胎～4胎10頭，5胎～6胎10頭)，后備母豬10頭(40 kg～60 kg 5頭，90 kg～110 kg 5頭)。

1.2.3 檢測(cè) 扁桃體樣品研磨后，2000 r/min離心5 min，上清液提取核酸。采用PRRSV OIE參考實(shí)驗(yàn)室建立的PRRSV通用RT-PCR方法對(duì)扁桃體樣品進(jìn)行檢測(cè)(PRRSV通用型檢測(cè)，簡(jiǎn)稱通檢，是指不分型的PRRSV檢測(cè)，包括美洲型PRRSV和歐洲型PRRSV)，引物序列為：上游：5′-GAATGGCCAGCCAGTCAATC-3′，下游：5′-GTCGCCCTAATTGAATAGGTGAC-3′，擴(kuò)增基因片段位于ORF6～ORF7基因的保守位點(diǎn)，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為436 bp。反應(yīng)體系為ddH2O 12.5 μL，5×Green buffer 5.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.5 μL，10 μmol/L Primer 1.5 μL，Gotaq DNA聚合酶1.0 μL，AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.2 μL，RNAi酶抑制劑0.3 μL。反應(yīng)程序：42℃ 45 min；94℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。通檢陽(yáng)性樣品進(jìn)行基因分型的鑒定。所有PRRSV通用RT-PCR反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物回收后，連接至pEASY-T3載體，轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌中，送上海英淮捷基貿(mào)易有限公司北京實(shí)驗(yàn)室測(cè)序，通過(guò)序列測(cè)定結(jié)果進(jìn)行病毒分型。

2 結(jié)果

2.1 PRRS疫苗的使用情況

2014年-2016年全國(guó)原種豬場(chǎng)PRRS疫苗的使用情況見圖1。全國(guó)地區(qū)包括采樣的27個(gè)省市自治區(qū)，2015和2016年未包括甘肅省；地區(qū)劃分如下：東北地區(qū)：遼寧、吉林、黑龍江；華北地區(qū)；河北、山西、內(nèi)蒙古、北京、天津；華東地區(qū)：山東、江蘇、安徽、浙江、臺(tái)灣、福建、江西、上海；華中地區(qū)：河南、湖北、湖南；華南地區(qū)：廣東、廣西、海南；西南地區(qū)：云南、貴州、四川、西藏；西北地區(qū)：新疆、陜西、寧夏、青海、甘肅。全國(guó)范圍內(nèi)，未進(jìn)行PRRS疫苗免疫的豬場(chǎng)2014年14個(gè)(14.89%)，2015年25個(gè)(28.74%)，2016年22個(gè)(25.29%)，比例在2015年上升，2016年略有下降；免疫高致病性株疫苗的豬場(chǎng)2014年35個(gè)(37.23%)，2015年34個(gè)(39.08%)，2106年25個(gè)(28.74%)，比例在2016年略下降，而免疫經(jīng)典株疫苗的比例從2014年到2015年下降后(47.87%到32.18%)，于2016年上升(45.98%)。

同時(shí)對(duì)我國(guó)不同地區(qū)豬藍(lán)耳病疫苗的使用情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，圖1表明，東北、華北、華東、西南4個(gè)地區(qū)免疫高致病性PRRS疫苗的場(chǎng)數(shù)量整體逐年降低；華中、西北地區(qū)數(shù)量保持不變；華南地區(qū)有一定波動(dòng)。而不免疫和免疫經(jīng)典PRRS活疫苗的豬場(chǎng)比例在各地區(qū)上升，但是二者在不同年份間波動(dòng)較大。

2.2 PRRS病原陽(yáng)性情況

2014年-2016年全國(guó)原種豬場(chǎng)PRRS病原陽(yáng)性情況如圖2。從全國(guó)來(lái)看，2014通檢陽(yáng)性場(chǎng)22個(gè)(23.40%),2015年為22個(gè)(24.24%)，2016年為33個(gè)(37.93%)。2014與2015年整體PRRS通檢陽(yáng)性率持平(23.40%和24.24%)，在2016年上升至37.93%(圖2A)。

在免疫不同疫苗的豬場(chǎng)中，通檢和變異株檢出陽(yáng)性率有所差異。在免疫高致病性PRRS活疫苗的豬場(chǎng)中，2014年、2015年和2016年的通檢陽(yáng)性場(chǎng)數(shù)量和陽(yáng)性率(免疫陽(yáng)性場(chǎng)數(shù)量/免疫場(chǎng)數(shù)量)分別為11(31.43%)、9(26.47%)和8(32.00%)；進(jìn)一步測(cè)序得知，變異株陽(yáng)性場(chǎng)數(shù)量和陽(yáng)性率分別為10(28.57%)、5(14.70%)和4(16.00%)。在免疫經(jīng)典PRRS活疫苗的豬場(chǎng)中，2014年、2015年、2016年的通檢陽(yáng)性場(chǎng)數(shù)量和陽(yáng)性率分別為9(20.00%)、5(17.86%)和17 (42.50%)；其中變異株陽(yáng)性場(chǎng)數(shù)量和陽(yáng)性率分別為7(15.56%)、1(3.6%)和12(42.86%)。在不免疫的豬場(chǎng)中，2014年、2015年和2016年的通檢陽(yáng)性場(chǎng)數(shù)量和陽(yáng)性率分別為2(14.29%)、6(24.00%)和8(36.36%)；變異株陽(yáng)性場(chǎng)數(shù)量和陽(yáng)性率分別為2(14.29%)、5(20.00%)和4(18.18%)。

圖1 2014年-2016年各地區(qū)，全國(guó)PRRSV免疫策略和變化趨勢(shì)

Fig.1 The vaccination strategy and tendency of PRRSV in different regions of China among 2014-2016

從PRRS通檢結(jié)果分布來(lái)看，通檢陽(yáng)性場(chǎng)的數(shù)量在2016年有所上升(20家～31家)，在不免疫的豬場(chǎng)中出現(xiàn)通檢陽(yáng)性。從PRRS變異株結(jié)果分布來(lái)看，PRRS變異株陽(yáng)性的豬場(chǎng)數(shù)量在2016年有所增加(11家～20家)。在免疫經(jīng)典株豬場(chǎng)和不免疫的豬場(chǎng)中均出現(xiàn)變異株陽(yáng)性。而且其陽(yáng)性率高于免疫高致病性豬藍(lán)耳病疫苗的豬場(chǎng)。

3 討論

PRRSV具有特殊性，其變異性高，不同基因型毒株的疫苗之間交叉保護(hù)不完全，PRRSV經(jīng)典株活疫苗對(duì)高致病性毒株保護(hù)力較弱，從2006年發(fā)生的“豬高熱病”疫情中也可觀察到[4]。高致病性毒株減毒活疫苗可有效控制高致病性PRRS的發(fā)生與傳播，但值得注意的是，該弱毒苗所用毒株的毒力相對(duì)較強(qiáng)，在免疫時(shí)要嚴(yán)格控制劑量[5-7]。

A.全國(guó)地區(qū)PRRSV通檢陽(yáng)性和變異株陽(yáng)性情況；B.PRRSV通檢陽(yáng)性場(chǎng)數(shù)量根據(jù)免疫策略(不免疫、免疫高致病性PRRS活疫苗、免疫經(jīng)典PRRS活疫苗)的分布情況；C.PRRS變異株陽(yáng)性場(chǎng)數(shù)量根據(jù)免疫策略的分布情況。免疫策略包括不免疫、免疫高致病性PRRSV活疫苗、免疫經(jīng)典PRRSV活疫苗。

A.The nationwide positive incidence of PRRSV and HP-PRRSV；B.The nationwide PRRSV determination results based on different vaccination strategies；C.The nationwide HP-PRRSV determination results based on different vaccination strategies.There were three vaccination strategies:No vaccination (No vac),vaccination with live HP-PRRSV and vaccination with live PRRSV classical strain.

圖2 2014年-2016年全國(guó)原種豬場(chǎng)PRRS病原陽(yáng)性情況

注：“√”說(shuō)明這一免疫策略可用，包括不免疫、免疫經(jīng)典株或免疫變異株；“×”說(shuō)明這一免疫策略不適用。

Notes:"√" indicates that this strategy could be applied,such as no vaccination,vaccination with classic strain and vaccination with variant strain.“×” indicates that this strategy could not be applied.

在本研究中調(diào)研的若干家豬場(chǎng)中，有部分豬場(chǎng)病原陽(yáng)性情況與其采取的免疫策略不相匹配，存在一定風(fēng)險(xiǎn)。例如，在PRRS通檢陽(yáng)性豬場(chǎng)中，在2014年-2016年，分別有2、6和8家豬場(chǎng)未進(jìn)行免疫，考慮到PRRSV散毒期長(zhǎng)，很容易導(dǎo)致病毒擴(kuò)散，風(fēng)險(xiǎn)較高。在PRRSV變異株陽(yáng)性豬場(chǎng)中，2014年-2016年分別為7、1和12家豬場(chǎng)僅免疫PRRS經(jīng)典株活疫苗；而不免疫的豬場(chǎng)在2014年-2016年分別有2、5和4家。變異株種類繁多，部分毒株致病力較強(qiáng)，選擇不免疫和免疫PRRS經(jīng)典株活疫苗的豬場(chǎng)若出現(xiàn)PRRSV變異株陽(yáng)性，則風(fēng)險(xiǎn)較高。

豬場(chǎng)應(yīng)根據(jù)場(chǎng)內(nèi)PRRSV情況和生物安全風(fēng)險(xiǎn)選擇合適的PRRS免疫策略(表1)，免疫策略與病原陽(yáng)性情況的匹配程度決定豬場(chǎng)面臨的風(fēng)險(xiǎn)[8]。在場(chǎng)內(nèi)PPRSV控制較好、周邊生物安全風(fēng)險(xiǎn)較低的情況下，可考慮不免疫，并持續(xù)通過(guò)唾液等方式監(jiān)測(cè)病原。在場(chǎng)內(nèi)PRRSV僅通檢陽(yáng)性、未觀察到變異株陽(yáng)性的情況下，如果周邊生物安全風(fēng)險(xiǎn)較低，可考慮免疫經(jīng)典株減毒活疫苗，并持續(xù)監(jiān)測(cè)，確定場(chǎng)內(nèi)有無(wú)變異株感染。如果場(chǎng)內(nèi)PRRSV持續(xù)變異株陽(yáng)性，應(yīng)考慮測(cè)定毒株序列，選擇相應(yīng)毒株的減毒活疫苗，并嚴(yán)格按照疫苗說(shuō)明書使用。對(duì)PRRS的控制，最終應(yīng)實(shí)現(xiàn)凈化。在當(dāng)前基礎(chǔ)上，需先降低變異株陽(yáng)性率、經(jīng)典株陽(yáng)性率，然后根據(jù)情況保證生物安全，減少活疫苗的使用，淘汰陽(yáng)性種豬，最終才可能實(shí)現(xiàn)PRRS的凈化。

本研究對(duì)2014年-2016年全國(guó)原種豬場(chǎng)PRRS的免疫情況和病原陽(yáng)性情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，明確了豬場(chǎng)應(yīng)根據(jù)場(chǎng)內(nèi)的實(shí)際情況選擇合適的PRRS免疫策略，為PRRS的防控和疫苗合理使用提供理論依據(jù)。