賽福丁·阿不拉，德力拜爾·木拉提

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆維吾爾自治區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆烏魯木齊 830052)

天然多糖含有增強免疫、抗癌細胞、抗病毒等多種生物活性效果[1-2]。新疆阿魏(FerulasinkiangensisK.M.Shen)和藥桑(MorusnigraLinn )都是傳統(tǒng)的維吾爾藥材，新疆阿魏主要分布于我國的新疆，在民族醫(yī)藥中應用廣泛，可治療胃病、關(guān)節(jié)炎等，研究表明阿魏具有抗氧化，抗真菌和解痙降壓等作用[3-6]。藥桑的主要活性物質(zhì)有多糖、色素[7]、黃酮[8]等，研究表明藥桑的多種成分具有抗氧化作用[9]。Zhao X等[10]通過硫酸化修飾銀耳多糖，發(fā)現(xiàn)經(jīng)硫酸化修飾的銀耳多糖在1.563 μg/mL時對NDV感染的CEF的病毒抑制率顯著高于未修飾的銀耳多糖。本研究以新疆阿魏和藥桑的傳統(tǒng)用藥和現(xiàn)代藥理學研究為依據(jù)，考察新疆阿魏多糖和藥桑多糖及其硫酸化產(chǎn)物的體外抗新城疫病毒作用，研究修飾后其抗病毒活性是否得到提升，旨在得到新穎的高活性低毒性的硫酸化多糖，為新城疫病毒的防治提供理想的藥物，為維吾爾藥材的開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)依據(jù)，同樣也為維藥的開發(fā)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用雞胚 雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司。

1.1.2 藥品 新疆阿魏根購自新疆民族醫(yī)院，新疆藥桑購自新疆阿克蘇庫車，多糖及硫酸化修飾物由新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院臨床實驗室提供。

1.1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱，美國eppendorf公司產(chǎn)品；TE2000-U型倒置顯微鏡，Nikon公司產(chǎn)品；SHE-3000型酶標分析儀，北京賽爾福知心科技有限公司產(chǎn)品；MM-2型微量振蕩器，金壇市醫(yī)療儀器廠生產(chǎn)。

1.1.4 主要試劑 1640培養(yǎng)液、Hank's液，HyClone公司產(chǎn)品；小牛血清，江蘇恩莫阿賽生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；四甲基偶氮唑藍MTT溶液，Biosharp公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 多糖的制備 將新疆阿魏多糖(Ferulasinkiangensispolysaccharide，F(xiàn)SP)和藥桑多糖(Morusnigrapolysaccharide，MP)及4種修飾后多糖，分別是硫酸化新疆阿魏多糖取代度為0.7(sFSP0.7)、硫酸化新疆阿魏多糖取代度為1.9(sFSP1.9)、硫酸化藥桑多糖取代度為2.5(sMP2.5)及硫酸化藥桑多糖取代度為1.3(sMP1.3)，用PBS配制、高壓滅菌、0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 新城疫病毒制備 NDV中等毒力活疫苗Ⅰ系，用9日齡SPF雞胚接種并于48 h后收集尿囊液， Reed-Muench法[11]測定病毒對雞胚成纖維細胞(CEF)的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)為10-6，細胞維持液稀釋成10-4(100 TCID50)備用。

1.2.3 雞胚成纖維細胞的制備 無菌取出9日齡～11日齡雞胚，用Hank′s洗1遍，去除頭、四肢和內(nèi)臟。再用Hank′s洗2遍，在小燒杯中將組織剪碎，再用Hank′s液洗3遍。加入4 mL的2.5 g/L胰蛋白酶溶液，置37 ℃消化，每隔2 min～3 min輕輕搖晃燒杯，12 min后吸去胰蛋白酶溶液，終止消化。細胞計數(shù)調(diào)成1×106個/mL，加入到96孔細胞培養(yǎng)板，37℃、體積分數(shù)為5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.4 多糖安全濃度測定 將制備好的新疆阿魏多糖(FSP)、藥桑多糖(MP)、硫酸化多糖sFSP0.7、sFSP1.9、sMP2.5及sMP1.3分別自500 μg/mL濃度進行細胞維持液倍比稀釋為11個濃度梯度。待CEF均勻生長為單層后，棄去培養(yǎng)基，用Hank's液清洗2次，上藥，100 μL/孔，每個濃度重復4孔，設(shè)置對照(只添加細胞維持液)。72 h后，按MTT法[13]用酶聯(lián)免疫檢測儀測490 nm波長處的OD值。選擇OD值不小于細胞對照組的最大濃度作為該多糖的最大安全濃度。

1.2.5 多糖在成纖維細胞上抗新城疫病毒的作用 將FSP、MP及4種修飾后多糖sFSP0.7、sFSP1.9、sMP2.5及sMP1.3分別從安全濃度向下依次倍比稀釋5個濃度。待CEF長成單層后，棄去孔內(nèi)液體，用Hank's液洗3次，以3種方式加入各濃度多糖和病毒：①即先加多糖后接種病毒：每孔加入不同濃度的多糖100 μL，培養(yǎng)4 h后棄掉孔內(nèi)液體，加入病毒液100 μL；②先接種病毒后加多糖：每孔加入病毒液100 μL，培養(yǎng)2 h后棄掉孔內(nèi)液體，加入多糖100 μL；③多糖和病毒感作后加入：將病毒液分別加

入到各濃度的多糖溶液中37℃感作4 h，再加入到培養(yǎng)板中。同時設(shè)立細胞對照組(cell control，CC)和病毒對照組(virus control，VC)，3種加藥方式的細胞均培養(yǎng)72 h后，按MTT法測定OD490nm值，并按以下公式計算病毒抑制率[12]：

病毒抑制率%=(OD(多糖+病毒)-OD(病毒對照))/(OD(細胞對照)-OD(病毒對照))×100%

2 結(jié)果

2.1 多糖對成纖維細胞的最大安全濃度

sFSP0.7在0.488 μg/mL～0.977 μg/mL、sFSP1.9在0.488 μg/mL～1.953 μg/mL、sMP2.5在0.488 μg/mL～3.906 μg/mL、sMP1.3在0.488 μg/mL、FSP在1.953 μg/mL、MP在3.906 μg/mL時的OD490nm值與細胞對照組(CC)差異不顯著(P>0.05)，因此可選擇這些濃度范圍為該多糖的安全濃度(表1)。

2.2 先加多糖后接種病毒時NDV感染CEF的能力

檢測新疆阿魏多糖、藥桑多糖及其硫酸化修飾物對NDV的阻斷作用，MP、FSP在0.244 μg/mL～3.906 μg/mL、sFSP0.7在0.977 μg/mL、sMP1.3在0.031 μg/mL～0.488 μg/mL時的OD490nm值與病毒對照組(VC)差異顯著(P<0.05)(表2和表3)。表2中依次為先加多糖后加入病毒組、先加病毒后加入多糖組、多糖和病毒混合感作后加入組。

表1 FSP、MP及硫酸化多糖的安全濃度測定

注：同列數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，肩標相同字母或單字母標注表示差異不顯著(P>0.05); CC.細胞對照。

Note：In the same column，values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05)，while with the same or single letter superscripts mean no significant difference (P>0.05); CC.Cell control.

表2 FSP和MP多糖對各組細胞OD490 nm值的影響

注：同列數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，肩標相同字母或單字母標注表示差異不顯著(P>0.05); CC.細胞對照; VC.病毒對照。

Note：In the same column，values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05)，while with the same or single letter superscripts mean no significant difference (P>0.05); CC.Cell control; VC.Virus control.

表3 先加修飾后多糖對各組細胞OD490 nm值的影響

注：同列數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，肩標相同字母或單字母標注表示差異不顯著(P>0.05); CC.細胞對照; VC.病毒對照。

Note：In the same column，values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05)，while with the same or single letter superscripts mean no significant difference (P>0.05); CC.Cell control; VC.Virus control.

FSP、MP及4種修飾后多糖sFSP0.7、sFSP1.9、sMP2.5及sMP1.3組病毒抑制率，依次為20.04%、19.01%、23.67%、20.83%、19.33%、22.47%，其中sFSP0.7組最高，sFSP0.7和sMP1.3高于其他組,修飾前后無明顯差異(圖1)。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母或無字母標注表示差異不顯著(P>0.05)

Values with different small letters mean significant difference (P<0.05)，while with the same or no letters mean no significant difference (P>0.05)

圖1先加多糖后接種病毒時各組的病毒抑制率

Fig.1 The virus inhibitory rate in different groups after
pre-adding polysaccharides

2.3 先接種病毒后加多糖時NDV感染CEF的能力

檢測新疆阿魏多糖、藥桑多糖及其硫酸化修飾物對NDV的抑制作用，MP在0.244 μg/mL～3.906 μg/mL、FSP在0.122 μg/mL～0.488 μg/mL、sFSP0.7在0.061 μg/mL～0.977 μg/mL、sMP2.5在0.244 μg/mL～3.906 μg/mL時的A 490值顯著大于病毒對照組(VC)(P<0.05)(表2、表4)。FSP、MP及4種修飾后多糖sFSP0.7、sFSP1.9、sMP2.5及sMP1.3組病毒抑制率，依次為26.04%、43.54%、32.50%、43.12%、87.69%、10.77%，其中sMP2.5組增殖率高達87.69%且顯著高于其他組。FSP、MP多糖經(jīng)修飾后抗病毒活性顯著增強，尤其是sMP2.5多糖組效果較好(圖2)。

2.4 多糖和病毒混合感作后加入時NDV感染CEF的能力

檢測新疆阿魏多糖、藥桑多糖及其硫酸化修飾物對NDV的直接殺滅作用，MP在0.244 μg/mL～3.906 μg/mL、FSP在1.953 μg/mL～3.906 μg/mL、sFSP0.7在0.977 μg/mL、sFSP1.9除了1.953 μg/mL、sMP2.5除了1.953 μg/mL、sMP2.5在0.031 μg/mL～0.488 μg/mL時的OD490 nm值顯著大于病毒對照組(VC)(P<0.05)(表2、表5)。 FSP、MP及4種修飾后多糖sFSP0.7、sFSP1.9、sMP2.5及sMP1.3組病毒抑制率，依次為9.42%、14.55%、10.61%、12.70%、11.32%、20%(圖3)。

表4 后加多糖對各組細胞OD490 nm值的影響

注：同列數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，肩標相同字母或單字母標注表示差異不顯著(P>0.05); CC.細胞對照; VC.病毒對照。

Note：In the same column，values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05)，while with the same or single letter superscripts mean no significant difference (P>0.05); CC.Cell control; VC.Virus control.

表5 多糖和病毒同時作用對各組細胞A 490值的影響

注：同列數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，肩標相同字母或單字母標注表示差異不顯著(P>0.05); CC.細胞對照; VC.病毒對照。

Note：In the same column，values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05)，while with the same or single letter superscripts mean no significant difference (P>0.05); CC.Cell control; VC.Virus control.

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),相同字母或單字母標注表示差異不顯著(P>0.05)

Values with different small letters mean significant difference (P<0.05),while with the same or on letters mean no significant difference (P>0.05)

圖2先接種病毒后加多糖對各組病毒抑制率的影響

Fig.2 Effects of per-inoculating viruses and post-adding
polysaccharides on virus inhibitory rate in different groups

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),相同字母表示差異不顯著(P>0.05)

values with different small letters mean significant difference (P<0.05),while with the same or on letters mean no significant difference (P>0.05)

圖3多糖和病毒混合感作后加入對各組病毒抑制率的影響

Fig.3 Effects of mixed adding polysaccharides with NDV
on virus inhibitory rate in different groups

3 討論

多糖類是生物體內(nèi)重要生物大分子，多糖具有抗病毒，調(diào)節(jié)免疫，抗氧化功能等多種作用[12]。阿得力江等[13]為研究列當多糖抗新城疫病毒活性，通過MTT以3種加藥方式(先加多糖后接種病毒、先接種病毒后加多糖、多糖和病毒感作后加)加藥，檢測列當多糖對新城疫病毒的作用，結(jié)果表明，列當總多糖及4種分級多糖均具有抗NDV活性。本試驗中的藥桑多糖和新疆阿魏也是采取同樣的方法檢測其對雞新城疫病毒在雞成纖維細胞中增殖的抑制作用，實驗結(jié)果表明新疆阿魏多糖和藥桑多糖對在雞成纖維細胞上感染的雞新城疫病毒均有一定的抗病毒作用，且藥桑多糖的抗NDV作用強于新疆阿魏多糖。

硫酸多糖(sulfated polysaccharide)是一類羥基上帶有硫酸根的多糖，多糖的結(jié)構(gòu)修飾對于揭示多糖的構(gòu)效關(guān)系具有重要意義[14]。研究發(fā)現(xiàn)多糖經(jīng)硫酸化修飾后的產(chǎn)物硫酸酯化多糖相比未修飾的多糖，其活性得到了較大的改善。童微等[15]通過體外試驗研究發(fā)現(xiàn)，硫酸化和脫乙?；揎椀蔫F皮石斛多糖能夠增強RAW264.7巨噬細胞的免疫活性。宋旭等[16]探討硫酸化川明參多糖在體外對新城疫病毒的抑制作用，結(jié)果表明硫酸化川明參多糖 在體外具有顯著的抗新城疫病毒的活性，并且高于硫酸肝素。王歡等[17]用氨基磺酸法對黨參多糖進行硫酸化修飾，通過MTT法檢測了硫酸化修飾前后黨參多糖在體外抗Ⅰ型單純皰疹病毒的作用，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)硫酸化修飾后的黨參多糖對Ⅰ型單純皰疹病毒具有較好的預防及治療效果。前人研究表明硫酸化修飾可提高多糖的生物活性，但關(guān)于新疆阿魏多糖和藥桑多糖的硫酸化修飾鮮有報道，本實驗對阿魏多糖和藥桑多糖及其硫酸產(chǎn)物進行研究，考察硫酸化后是否可提升新疆阿魏和藥桑多糖的抗新城疫病毒活性，研究表明一定的修飾可提高藥桑多糖和新疆阿魏多糖的抗新城疫病毒活性。

多糖抗病毒機機制可能一是提高機體免疫能力，二是直接作用于病毒。加藥方式的不同使新疆阿魏多糖表現(xiàn)出不同的抗病毒活性。先加藥物后接種病毒的目的是觀察多糖能否進入細胞或吸附于細胞表面，以阻止病毒的吸附與侵入，先接種病毒后加多糖的目的是觀察藥物能否對已進入細胞內(nèi)的病毒起作用，抑制其生物合成及成熟釋放。病毒和多糖感作后加入細胞的目是觀察多糖有無直接殺滅病毒的作用。本文以3種加藥方式(先加多糖后接種病毒、先接種病毒后加多糖、多糖和病毒感作后加)加藥，考察各多糖對新城疫病毒的阻斷作用、抑制作用及直接殺滅作用。先加入多糖組結(jié)果顯示各多糖均有一定抗新城疫病毒作用，且各組病毒抑制率相差不多，表明各多糖對新城疫病毒有一定的阻斷作用；先加入病毒組顯示各多糖病毒抑制率均有上升，病毒抑制率有上升趨勢，尤其是sMP2.5達到了87.69%，抗病毒作用顯著，表明sMP2.5對新城疫病毒具有較強的抑制作用。多糖和病毒混合后加入這種加藥方式病毒抑制率沒有先加病毒組強。研究表明各多糖對新城疫病毒的阻斷作用和抑制作用較好，而直接殺死新城疫病毒作用較弱。與前人研究相似之處為硫酸化多糖可在一定程度提高多糖活性，F(xiàn)SP、MP經(jīng)硫酸化修飾后抗病毒活性顯著增強，尤其是sMP2.5多糖組效果較好，抗新城疫病毒作用最強。經(jīng)硫酸化修飾我們篩選到了sMP2.5這種具有較好抗病毒作用的硫酸化產(chǎn)物，具有進一步研究的價值。