劉金鳳，杜毅超，覃紹敏，白安斌，張振江，陳鳳蓮，吳健敏

(廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所 廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530001)

豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是導(dǎo)致母豬繁殖障礙的主要病原之一，感染豬常以初產(chǎn)妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、畸形胎、木乃伊胎、弱仔、延期回歸發(fā)情為特征。此外，PPV還可以引起仔豬皮炎、腹瀉、心肌炎及呼吸系統(tǒng)疾病[1-2]。疫苗免疫是防控PPV感染的有效手段，雖然傳統(tǒng)的滅活苗和弱毒苗已在臨床上廣泛應(yīng)用于PPV的防控，并取得了良好的效果，但滅活苗免疫效果不穩(wěn)定，免疫保護(hù)力低，并且存在滅活不徹底會導(dǎo)致散毒的風(fēng)險，弱毒苗存在毒株重組或毒力返強(qiáng)等缺點(diǎn)，因此開發(fā)安全高效的新型PPV疫苗對有效控制和徹底清除PPV具有重要的意義[3]。病毒樣粒子(virus-like particles，VLPs)形態(tài)與天然病毒結(jié)構(gòu)極為相似，能有效模擬天然病毒感染模式，通過MHCⅠ類分子和MHCⅡ類分子途徑進(jìn)行抗原提呈激活機(jī)體產(chǎn)生一系列的免疫應(yīng)答[4-5]，但VLPs不含核酸，消除了天然病毒毒力返強(qiáng)、產(chǎn)生免疫缺陷等風(fēng)險，具有極高的安全性，是一種理想的候選疫苗[6]。

近年來，PPV-VP2已被證實(shí)能在多種不同的表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)，并且能在體外自行組裝形成VLPs，同時具有良好的免疫原性。盡管PPV-VLPs研究取得了不少成果，但要實(shí)現(xiàn)PPV-VLPs疫苗的臨床推廣應(yīng)用，仍需就如何提高VLPs表達(dá)效率及免疫原性進(jìn)行深入研究。TAT蛋白是人類免疫缺陷病毒1(HIV-1)的方式激活因子，由86個氨基酸組成，能有效攜帶外源蛋白跨膜進(jìn)入細(xì)胞，發(fā)揮蛋白的生物活性。TAT蛋白中的一個富含11個堿性氨基酸、帶正電荷的多肽片段與TAT蛋白的轉(zhuǎn)導(dǎo)功能密切相關(guān)，稱之為TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域。據(jù)報道，TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域具有強(qiáng)大的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，能促進(jìn)融合蛋白跨膜導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)入MHCⅠ類分子介導(dǎo)的抗原呈遞途徑，并激發(fā)抗原特異性CTL應(yīng)答效應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)[7-9]；還能顯著提高外源蛋白高效、可溶性表達(dá)的水平[10]。本研究嘗試在PPV-VP2基因的N端融合TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域，用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，分析融合蛋白形成病毒樣粒子的可行性，以期為進(jìn)一步研制高效的VLPs疫苗提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株、細(xì)胞系 重組桿粒rBacmid-VP2、DH5α、PPV N毒株由廣西獸醫(yī)研究所診治中心實(shí)驗(yàn)室保存； DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞購自北京博邁德生物技術(shù)有限公司；pFastBac Ⅰ質(zhì)粒、Sf9昆蟲細(xì)胞系由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所惠贈。

1.1.2 主要試劑 Fast pfu DNA聚合酶為全式金公司產(chǎn)品、BamHⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶、DNA Marker為TaKaRa公司產(chǎn)品；蛋白Marker、DNA膠回收試劑盒、基因組提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒為天根生物公司產(chǎn)品；LipofectamineTM3 000 為 Invitrogen公司產(chǎn)品；胎牛血清、Grace's昆蟲培養(yǎng)基購為GIBCO公司產(chǎn)品；PPV單克隆抗體為洛陽普萊柯公司贈與；FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG為武漢博士德生物公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)合成 根據(jù)GenBank公布的PPV(GeneID：M32787.1)基因組序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增VP2基因特異性引物，人工合成TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域序列(表1)，引物由北京博邁德生物公司合成。其中引物P1、P4用于從病毒基因組擴(kuò)增VP2基因；P2、P4用于擴(kuò)增在VP2 N端引入第1段TAT序列的TAT-VP2基因，P3、P4用于擴(kuò)增在VP2 N端引入第2段TAT序列的TAT-VP2基因，P2、P3單下劃線部分為TAT序列，P3、P4雙下劃線部分引入的酶切位點(diǎn)。

表1 用于擴(kuò)增基因的引物及其序列

1.2.2 目的基因克隆及序列測定 以常規(guī)方法提取PPV病毒基因組DNA為模板，應(yīng)用Fast pfu DNA Polymerase聚合酶和引物P1和P2擴(kuò)增VP2基因，擴(kuò)增條件為：95℃ 2 min；95℃ 20 s，65℃ 30 s，72℃ 1 min，32個循環(huán)；72℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)加A反應(yīng)回收純化后進(jìn)行TA克隆構(gòu)建pMD-VP2重組質(zhì)粒并經(jīng)PCR、酶切鑒定及測序分析；以pMD-VP2質(zhì)粒為模板用P2、P4引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在VP2的N端引入第1段TAT序列。擴(kuò)增條件為：95℃ 2 min；95℃ 10 s，68℃ 1 min，32個循環(huán)；72℃延伸7 min?；厥占兓谝惠哖CR產(chǎn)物為模板，用P3、P4引物以相同條件進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，引入第二段TAT序列，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)加A反應(yīng)回收純化后進(jìn)行TA克隆構(gòu)建pMD-TAT-VP2重組質(zhì)粒并經(jīng)PCR、酶切鑒定及測序分析。

1.2.3 重組桿粒構(gòu)建 pMD-TAT-VP2重組質(zhì)粒和pFastBacⅠ空載體分別用BamHⅠ和NotⅠ進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)膠回收后，用T4連接酶將TAT-VP2基因插入pFastBac I載體中；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)大腸埃希菌DH5α細(xì)胞，提取重組質(zhì)粒，并進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定篩選陽性質(zhì)粒，并命名為pFast-TAT-VP2。用將pFast-TAT-VP2轉(zhuǎn)化含Bacmid和輔助質(zhì)粒的DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)3種抗生素(四環(huán)素、卡那霉素、慶大霉素)和藍(lán)白斑篩選，獲取陽性重組菌株并提取桿粒，桿粒經(jīng)M13引物 PCR鑒定正確后命名為rBacmid-TAT-VP2。

1.2.4 重組桿狀病毒制備及擴(kuò)增 按照LipofectamineTM3 000說明書操作方法，將重組桿粒rBacmid-TAT-VP2轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期的Sf9細(xì)胞，設(shè)rBacmid-VP2轉(zhuǎn)染組為陽性對照，轉(zhuǎn)染后27℃培養(yǎng)96 h，反復(fù)凍融細(xì)胞，4℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清獲得P1代重組細(xì)胞毒rBV-TAT-VP2和rBV-VP2，提取重組細(xì)胞毒基因組，以P1/P4特異性引物進(jìn)行PCR鑒定；將鑒定正確的P1代重組毒按照1∶10稀釋接種Sf9細(xì)胞進(jìn)行傳代，待細(xì)胞發(fā)生明顯病變后收獲P2代毒，以同樣傳代方法獲P3代毒，收獲的重組毒在-80℃保存。

1.2.5 表達(dá)產(chǎn)物間接免疫熒光鑒定 將rBV-TAT-VP2按1∶10接種96孔板培養(yǎng)的Sf9細(xì)胞，設(shè)非感染和rBV-VP2對照組，27℃培養(yǎng)48 h～72 h，細(xì)胞開始出現(xiàn)病變后，以80%預(yù)冷丙酮固定，PBST洗滌3次后50 g/L脫脂奶粉4℃封閉過夜，以1∶2 000稀釋的PPV單抗為一抗，在37℃下避光孵育1 h，以1∶1 000稀釋的FITC熒光標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，37℃孵育1 h，期間每一環(huán)節(jié)用PBST洗滌3次，于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 表達(dá)產(chǎn)物電鏡觀察 將重組桿狀病毒按1∶10接種Sf9細(xì)胞，27℃培養(yǎng)3 d～5 d至約75%細(xì)胞產(chǎn)生明顯病變后，反復(fù)凍融細(xì)胞離心去除細(xì)胞碎片，收集上清。將上清樣品滴于載樣銅網(wǎng)上，吸附2 min，去除多余樣品，然后滴加10 g/L磷鎢酸染色固定，進(jìn)行透射電鏡觀察。

1.2.7 表達(dá)產(chǎn)物血凝效價測定 將重組桿狀病毒按1∶10接種Sf9細(xì)胞，27℃培養(yǎng)3 d～5 d至約75%細(xì)胞產(chǎn)生明顯病變后反復(fù)凍融細(xì)胞離心收集上清；采集并處理豚鼠血，配置1%紅細(xì)胞懸液，采用微量血凝實(shí)驗(yàn)在96孔V型板上測定表達(dá)產(chǎn)物的血凝效價。

2 結(jié)果

2.1 TAT-VP2基因構(gòu)建及鑒定

以PPV基因組DNA為模板擴(kuò)增VP2基因，瓊脂糖凝膠電泳分析，可見預(yù)期大小約1.75 kb的目的條帶(圖1)；以純化的VP2基因?yàn)槟０?，?jīng)兩輪PCR擴(kuò)增出含兩段TAT序列的目的基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化回收后克隆到pMD-18T載體進(jìn)行酶切鑒定，可見預(yù)期大小約1.8 kb和2.7 kb的目的條帶(圖2)；測序分析結(jié)果與預(yù)期相符。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; 1～2.VP2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M.DNA Marker DL 2 000; 1-2.VP2 amplification products

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 15 000; 1～2.pMD-TAT-VP2雙酶切產(chǎn)物M.DNA Marker DL 15 000; 1-2：pMD-TAT-VP2 digestion products

2.2 重組桿粒rBacmid-TAT-VP2 的構(gòu)建及鑒定

pMD-TAT-VP2載體酶切回收目的片段，并將其插入pFastBac I載體，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體pFast-TAT-VP2，進(jìn)行PCR及雙酶切鑒定，結(jié)果與預(yù)期一致(圖3)；將pFast-TAT-VP2轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后提取重組桿粒rBacmid-TAT-VP2，并用通用引物M13F/R進(jìn)行PCR鑒定，可見約4.1 kb的目的條帶(圖4)，與預(yù)期結(jié)果相符，提示成功獲得重組桿粒rBacmid-TAT-VP2。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000; 1.pFastBac-TAT-VP2 PCR產(chǎn)物; 2.pFastBac-TAT-VP2 酶切產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 5 000; 1.pFastBac-TAT-VP2 PCR amplification products; 2.pFastBac-TAT-VP2 digestion products

圖3 pFast-TAT-VP2質(zhì)粒PCR及酶切鑒定

Fig.3 Identification of the recombinant pFast-TAT-VP2
by PCR and enzyme digestion

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000; 1.rBacmid-TAT-VP2 PCR產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 1 000; 1.rBacmid-TAT-VP2 PCR amplification products

圖4重組桿粒rBacmid-TAT-VP2 PCR鑒定

Fig.4 Identification of the recombinant rBacmid-TAT-VP2 by PCR

2.3 重組桿狀病毒rBV-TAT-VP2的獲得與病毒擴(kuò)增

重組桿粒rBacmid-TAT-VP2轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞后獲得P1代重組桿狀病毒，提取其DNA進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果可檢測到目的條帶，證實(shí)目的基因TAT-VP2成功整合到重組桿狀病毒基因組中。將鑒定為陽性的P1代重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞，培養(yǎng)96 h后，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的病變，細(xì)胞變大，變圓或不規(guī)則，上漂裂解，正常細(xì)胞則無明顯病變(圖5)。

A.正常Sf9細(xì)胞; B.感染rBV-VP2病變細(xì)胞; C.感染rBV-TAT-VP2病變細(xì)胞A.Normal Sf9 cells; B.cells infected with rBV-VP2 ; C.cells infected with rBV-TAT-VP2

2.4 表達(dá)產(chǎn)物間接免疫熒光鑒定

用P3代重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞48 h后，采用IFA方法檢測目的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示重組桿狀病毒表達(dá)產(chǎn)物可被PPV抗體特異性識別，熒光顯微鏡下可見綠色熒光，而未感染桿狀病毒的正常昆蟲細(xì)胞則無特異性熒光反應(yīng)(圖6)，表明TAT-VP2蛋白在重組桿狀病毒中成功表達(dá)。

A1.正常Sf9細(xì)胞(白光); A2.正常Sf9細(xì)胞(熒光); B1.rBV-VP2感染細(xì)胞(白光); B2.rBV-VP2感染細(xì)胞(熒光); C1.rBV-TAT-VP2感染細(xì)胞(白光); C2.rBV-TAT-VP2感染細(xì)胞(熒光)

A1.Normal Sf9 cells(light); A2.Normal Sf9 cells(fluorescence); B1.Cells infected with rBV-VP2(light); B2.Cells infected with rBV-VP2(fluorescence); C1.Cells infected with rBV-TAT-VP2(light); C2.Cells infected with rBV-TAT-VP2(fluorescence)

圖6表達(dá)產(chǎn)物間接免疫熒光鑒定

Fig.6 Indirect immunofluorescence identification of expressed products

2.5 表達(dá)產(chǎn)物電鏡觀察

重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞3 d～5 d后，收集細(xì)胞上清進(jìn)行電鏡觀察，結(jié)果觀察到形態(tài)大小與野生型PPV及VP2-VLPs相似的、直徑約20 nm的VLPs，表明TAT-VP2融合蛋白能在體外自行組裝形成VLPs(圖7)。

2.6 表達(dá)產(chǎn)物血凝效價測定

采用微量血凝試驗(yàn)測定表達(dá)產(chǎn)物的HA效價，結(jié)果顯示，TAT-VP2融合蛋白具有類似于全病毒的血凝活性，能有效凝集豚鼠的紅細(xì)胞，血凝效價達(dá)29。

A.VP2 蛋白形成的VLPs ; B.TAT-VP2蛋白形成的VLPs

A.VLPs formed by VP2 proteins; B.VLPs formed by TAT-VP2 proteins

圖7表達(dá)產(chǎn)物電鏡觀察

Fig.7 Electron microscopic observation of expressed products

3 討論

目前，PPV嚴(yán)重制約我國養(yǎng)豬業(yè)可持續(xù)發(fā)展，雖然PPV的致病機(jī)理還未研究透徹，但VP2蛋白已經(jīng)被證實(shí)是PPV的主要衣殼蛋白，包含了PPV主要的抗原表位，是中和抗體作用的主要靶蛋白，因此VP2是分子水平上診斷PPV的主要抗原，同時也是PPV基因工程亞單位疫苗研究的主要靶標(biāo)[11]。VP2能在大腸埃希菌、酵母、哺乳動物細(xì)胞及桿狀病毒系統(tǒng)中有效表達(dá)，并表現(xiàn)出良好的免疫原性。也有研究報道，單獨(dú)的VP2蛋白不添加佐劑作為免疫原時，其免疫效果并不理想，這可能與蛋白質(zhì)來源有關(guān)，也可能與蛋白不能高效進(jìn)入動物細(xì)胞因而不能進(jìn)入MHCⅠ類分子介導(dǎo)的抗原提呈途徑刺激產(chǎn)生細(xì)胞免疫有關(guān)[12-14]。

蛋白的結(jié)構(gòu)影響其免疫活性，不同表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的VP2蛋白免疫活性差異明顯。大量研究發(fā)現(xiàn)，大腸埃希菌表達(dá)的PPV-VP2蛋白由于蛋白的錯誤折疊及修飾不能自行組裝成VLPs，使用VP2蛋白的免疫效果不佳，而桿狀病毒表達(dá)的VP2蛋白能自行組裝形成VLPs并誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，表明VP2蛋白的VLPs形成與免疫保護(hù)效果密切相關(guān)[15-16]。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是以桿狀病毒為載體，昆蟲細(xì)胞為真核表達(dá)系統(tǒng)，目前已經(jīng)成為病毒疫苗研究的主要平臺。與大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)相比，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)能對表達(dá)的蛋白進(jìn)行正確折疊及磷酸化、糖基化等修飾，從而最大限度保留蛋白的天然生物活性；此外，桿狀病毒宿主范圍小，僅感染節(jié)肢動物，在哺乳動物細(xì)胞中不能復(fù)制，而且昆蟲細(xì)胞體外培養(yǎng)可不添加任何動物細(xì)胞相關(guān)的附屬物，因而與其他病毒真核表達(dá)系統(tǒng)相比具有更高的安全性。因此，該系統(tǒng)在構(gòu)建生產(chǎn)VLPs疫苗方面具有明顯的優(yōu)勢[17]。

細(xì)胞膜的屏蔽作用制約了動物蛋白疫苗的發(fā)展，提高外源蛋白的入膜效率，可能是提高蛋白疫苗免疫效果的有效途徑。蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域能引導(dǎo)與之融合表達(dá)的抗原在細(xì)胞間及細(xì)胞內(nèi)傳播，促進(jìn)CTL表位的加工和釋放，同時提高抗原表位的細(xì)胞提呈[18]。Chen H J等[19]研究表明，VP22蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域能顯著增強(qiáng)馬立克病毒(MDV)融合蛋白VP2在小鼠體內(nèi)的免疫應(yīng)答；Bolhassani A等[20]發(fā)現(xiàn)將VP22與利什曼原蟲的amastin蛋白編碼基因融合表達(dá)，能顯著提高amastin疫苗的免疫原性；Yu Z等[21]融合表達(dá)TAT-P53蛋白并轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)融合蛋白能有效進(jìn)入腫瘤細(xì)胞并發(fā)揮抗腫瘤作用；Leifert J A等[22]研究發(fā)現(xiàn)TAT的核心肽段與LCMV的核蛋白融合表達(dá)并不能提高全蛋白編碼抗原表位的提呈作用，不能增強(qiáng)細(xì)胞的免疫原性，但與核蛋白中NP396表位融合卻能極大程度提高NP396表位的細(xì)胞提呈作用?；赥AT的跨膜特性及PPV-VP2 VLPs組裝特性，本研究將TAT與PPV-VP2基因進(jìn)行融合，并通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，研究TAT-VP2形成病毒樣粒子的可行性。結(jié)果顯示，成功構(gòu)建了TAT-VP2融合基因的重組桿狀病毒rBV-TAT-VP2并在Sf9細(xì)胞中成功表達(dá)了重組蛋白TAT-VP2，間接免疫熒光證實(shí)融合蛋白能與PPV抗體結(jié)合，具有與PPV VP2蛋白相似的生物活性；電鏡觀察進(jìn)一步證實(shí)TAT-VP2蛋白能自行組裝成與PPV天然病毒粒子類似的VLPs，表明VP2 N端融合TAT不影響VP2蛋白的表達(dá)，不影響病毒樣粒子的有效組裝；血凝試驗(yàn)結(jié)果顯示融合TAT重組PPV-VLPs具有與全病毒相同的血凝活性。本研究證實(shí)TAT-VP2融合蛋白能在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)并能自行組裝形成病毒樣粒子，為后續(xù)研制高效PPV亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)。