戚雯雯，沈玉婷，陳楚英，陳金印,2，萬(wàn)春鵬

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，江西省果蔬保鮮與無(wú)損檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江西省果蔬采后處理關(guān)鍵技術(shù)與質(zhì)量安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江西南昌 330045)(2.萍鄉(xiāng)學(xué)院，江西萍鄉(xiāng) 337055)

柑橘果實(shí)組織柔嫩多汁并且富含糖分，在貯藏和運(yùn)輸過(guò)程中容易發(fā)生采后病害，綠霉病是引起柑橘果實(shí)腐爛的主要病害之一，其病原菌為指狀青霉(Penicillium digitatum)。目前，我國(guó)控制柑橘采后病害的方法主要是采用化學(xué)殺菌劑如多菌靈，抑霉唑和咪鮮胺等處理果實(shí)，但這很容易導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性，且果實(shí)殘留量大，對(duì)人體健康以及環(huán)境造成一定的危害。因此，為了保證果實(shí)產(chǎn)品的衛(wèi)生和安全，眾多學(xué)者都在積極探索能代替化學(xué)藥物的保鮮新技術(shù)，從植物中篩選，發(fā)現(xiàn)具有抗菌活性的天然產(chǎn)物，研發(fā)水果防腐保鮮劑來(lái)控制果實(shí)采后病害將是今后的發(fā)展方向和研究熱點(diǎn)[1～3]。

江香薷為唇形科植物江香薷(Mosla chinensis'jiangxiangru')的干燥地上部分，是2005版《中國(guó)藥典》收錄的正品香薷之一，江西省新余市渝水區(qū)和分宜縣以及宜春等地是該藥材的道地產(chǎn)區(qū)[4]。江香薷性辛，微溫，無(wú)毒，為常用治療感冒的中藥，現(xiàn)代研究表明，江香薷中主要含有揮發(fā)油類和黃酮類成分[4]，為兩類常見的抑菌活性成分。江香薷及其揮發(fā)油提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌等常見細(xì)菌有較好的抑菌活性[5,6]。百里香酚和香芹酚是江香薷揮發(fā)油的主要成分，其中香芹酚的相對(duì)含量為22.24%[6]。香芹酚對(duì)一些果蔬植物病原菌具有很好的抑制作用，香芹酚可以抑制楊梅致病菌的生長(zhǎng)[7]，還可以抑制桃軟腐病病原菌—葡枝根霉[8]，5%香芹酚水劑可以有效防治辣椒白粉病，減少化學(xué)農(nóng)藥的使用[9]；香芹酚包合物對(duì)蓮霧采后有較好的保鮮效果[10]。課題組前期基于抑制指狀青霉和意大利青霉篩選柑橘植物源保鮮劑發(fā)現(xiàn)江香薷對(duì)兩種病原菌均有抑制作用。江香薷提取物對(duì)指狀青霉的最低抑菌濃度（MIC）為12.5 mg/mL，最小殺菌濃度（MBC）為25.0 mg/mL；而對(duì)意大利青霉的 MIC和 MBC值分別為 25.0 mg/mL和 50.0 mg/mL。表明江香薷對(duì)指狀青霉更敏感，抑菌活性更強(qiáng)。本文進(jìn)一步研究其主要活性成分香芹酚對(duì)指狀青霉的抑菌機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 原料

指狀青霉菌（Penicillium digitatum），江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室提供；香芹酚（化學(xué)純99%），購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 L）；PDB培養(yǎng)液（即不加瓊脂的PDA培養(yǎng)基）；葡萄糖，瓊脂粉，蒽酮，乙酸乙酯，濃H2SO4，草酸，醋酸鉛，95%的乙醇等試劑均為分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

移液器，上海賽默飛世爾儀器有限公司；血球計(jì)數(shù)板，上海市求精生化試劑儀器有限公司；JY202電子天平，上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司；5804R冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf；DDS-307A電導(dǎo)率儀，上海精密科學(xué)儀器有限公司；IS-RDH1臥式恒溫振蕩器，美國(guó)精騏有限公司；YXQ-LS-70A立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；DK-S28電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；MIR-254恒溫培養(yǎng)箱，日本三洋公司；顯微鏡，尼康；T6新悅紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；HS-1300U潔凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌懸液的制備

無(wú)菌條件下，將指狀青霉菌接種到 PDA培養(yǎng)基上，于 28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一周，4 ℃保存?zhèn)溆茫ňN活化），用無(wú)菌水將指狀青霉菌洗入三角瓶，過(guò)濾，濾液搖勻在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，菌液濃度為107cfu/mL。

1.3.2 香芹酚對(duì)指狀青霉抑菌活性的測(cè)定

無(wú)菌條件下，吸取10 mL孢子懸浮液于90 mL PDA培養(yǎng)基中，混勻，倒入平板冷凝后，采用牛津杯法，觀察江香薷提取物香芹酚對(duì)指狀青霉抑菌活性，藥劑濃度分別為 2 mg/mL、4 mg/mL、6 mg/mL、8 mg/mL、10 mg/mL，以95%的乙醇作為對(duì)照，每種濃度重復(fù)三次，密封好后將平板放在 28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d后采用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑。

1.3.3 最低抑菌濃度及最小殺菌濃度的測(cè)定

在無(wú)菌條件下，采用二倍稀釋法[11]，將不同濃度的香芹酚加到融化的 PDA培養(yǎng)基中，搖勻，制成終濃度在0.0625～10 mg/mL之間的含藥培養(yǎng)基，空白對(duì)照為不加香芹酚的PDA培養(yǎng)基，重復(fù)三次。用直徑8 mm打孔器打取邊緣菌塊，并用接種環(huán)轉(zhuǎn)接到不同濃度的含藥培養(yǎng)基中央，使帶菌絲的一面充分接觸培養(yǎng)基，密封好后將放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。2 d后觀察，以無(wú)菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)皿的最低含藥濃度為最小抑菌濃度（MIC），將無(wú)菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)7 d后觀察，以無(wú)菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)皿的最低含藥濃度為最小殺菌濃度（MFC）。

1.3.4 香芹酚對(duì)指狀青霉孢子萌發(fā)率的影響

無(wú)菌條件下，用PDB將指狀青霉孢子洗下，過(guò)濾，使菌液濃度為107CFU/mL。將孢子懸浮液與不同濃度的香芹酚溶液用按9:1比例滴入凹玻片凹槽中，使其作用終濃度分別為 0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL和2.0 mg/mL，對(duì)照組加入等量95%的乙醇，每個(gè)處理重復(fù)三次，置于 28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，12 h后鏡檢，觀察孢子萌發(fā)情況，每個(gè)處理在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)100個(gè)左右孢子，計(jì)算孢子萌發(fā)率和抑制率。

萌發(fā)率（%）=100×萌發(fā)個(gè)數(shù)/總孢子個(gè)數(shù)

抑制率（%）=100×（η0-η1）/η0

式中：η0為對(duì)照組萌發(fā)率，η1為處理組萌發(fā)率。

1.3.5 香芹酚對(duì)指狀青霉菌絲形態(tài)的影響

無(wú)菌條件下，用PDB將指狀青霉孢子洗下，過(guò)濾，使菌液濃度為107CFU/mL。將孢子懸浮液與不同濃度的香芹酚溶液用按9:1比例滴入凹玻片凹槽中，使其作用終濃度為0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL和2.0 mg/mL，對(duì)照組加入等量95%的乙醇，每個(gè)處理重復(fù)三次，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2 d后在40倍顯微鏡下觀察菌絲的生長(zhǎng)情況。

1.3.6 香芹酚對(duì)指狀青霉細(xì)胞膜滲透性的測(cè)定

無(wú)菌條件下，將1 mL孢子懸浮液接種于99 mL PDB培養(yǎng)液中，搖床培養(yǎng)2 d (200 r/min，28 ℃)。稱取等量菌絲分別放入裝有不同濃度的香芹酚和95%的乙醇的三角瓶中，在搖床上繼續(xù)培養(yǎng)，在處理0、30、60、90、120、150 min取樣，4000 r/min離心10 min，取上清液，測(cè)定電導(dǎo)率。最后將菌絲沸水浴10 min，待冷卻至室溫后測(cè)定其電導(dǎo)率，每個(gè)處理重復(fù)三次，用相對(duì)電導(dǎo)率來(lái)表示細(xì)胞膜透性。

相對(duì)電導(dǎo)率（%）=100×(Ct-C0)/(Cd-C0)

式中：C0為0 min時(shí)的電導(dǎo)率，Ct為不同時(shí)刻電導(dǎo)率，Cd為沸水浴后電導(dǎo)率。

1.3.7 香芹酚對(duì)指狀青霉菌體可溶性糖含量的測(cè)定

無(wú)菌條件下，將1 mL孢子懸浮液接于99 mL PDB培養(yǎng)液中，搖床培養(yǎng)2 d (200 r/min，28 ℃)，加入不同濃度的香芹酚溶液，對(duì)照組加入等量95%的乙醇，繼續(xù)培養(yǎng)3 d后過(guò)濾，用無(wú)菌水沖洗菌絲體3遍并用濾紙吸干，稱取0.5 g菌絲，于研缽中研磨至糊狀，用蒸餾水將其轉(zhuǎn)入三角瓶中，于沸水浴中計(jì)時(shí)15 min后取出，待冷卻至室溫后定容至250 mL，再向其中加入2.5 mL 10%醋酸鉛溶液，搖勻，以沉淀其中的蛋白質(zhì)，待反應(yīng)完全后，加入0.5 g草酸，以除去過(guò)量的醋酸鉛溶液，搖勻后過(guò)濾。各取2 mL濾液于試管中，加入0.5 mL蒽酮和5 mL濃硫酸，震蕩后于沸水浴10 min，快速冷卻后于620 nm波長(zhǎng)的分光光度計(jì)下測(cè)定并記錄其吸光值，重復(fù)測(cè)定3次，以葡萄糖原液作標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=0.0057x-0.0114，R2=0.9936），按如下公式計(jì)算可溶性糖含量：

可溶性糖含量（%）=100×（A×V）/(VS×W×106)

式中：A為在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的含糖量（μg）；V為總體積（mL）；Vs為測(cè)定取樣體積（mL）；W為樣品重量（g）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理，并繪制圖表；用DPS7.05軟件繪制毒力測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)r、有效濃度及其置信區(qū)間；采用SPSS 17.0進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 香芹酚對(duì)指狀青霉的抑菌效果

江香薷活性成分香芹酚對(duì)指狀青霉有較好的抑菌效果，抑菌圈直徑與香芹酚濃度呈正相關(guān)，香芹酚濃度越高對(duì)病原菌的抑菌效果越好。這與許晴晴[12]在研究香芹酚對(duì)藍(lán)莓采后青霉菌病害抑制作用中結(jié)果一致。不同濃度處理之間及其與對(duì)照組之間的差異均極顯著。上述濃度為香芹酚對(duì)指狀青霉抑菌機(jī)理的研究做了初步篩選。

表1 香芹酚對(duì)指狀青霉的抑菌效果Table 1 Antifungal effect of carvacrol on Penicillium digitatum

2.2 香芹酚對(duì)指狀青霉菌的MIC及MFC

試驗(yàn)測(cè)得，香芹酚對(duì)指狀青霉的MIC和MFC分別為0.125 mg/mL、0.25 mg/mL，上述濃度為后續(xù)進(jìn)一步研究江香薷活性成分香芹酚對(duì)指狀青霉抑菌機(jī)理提供參考。

2.3 香芹酚對(duì)指狀青霉菌孢子萌發(fā)率的影響

由表2可知，香芹酚對(duì)指狀青霉菌的孢子萌發(fā)具有顯著的抑制作用，且隨香芹酚處理濃度的增加，孢子萌發(fā)數(shù)逐漸減少，抑制作用增強(qiáng)。不同濃度的處理均與對(duì)照組之間的差異極顯著（p＜0.01）。

香芹酚最大供試濃度2.0 mg/mL時(shí)，可完全抑制病原菌的孢子萌發(fā)。1.0 mg/mL的香芹酚處理病原菌時(shí)，對(duì)其孢子萌發(fā)抑制率可高達(dá)97.79%。香芹酚處理濃度對(duì)數(shù)與其孢子萌發(fā)抑制率的幾率值之間呈線性關(guān)系，其毒力回歸方程為 Y=7.7711+5.6695x，r=0.96，香芹酚處理的EC50、EC95為0.3245 mg/mL和0.6329 mg/mL。

綜上所述，香芹酚在一定濃度范圍能有效抑制指狀青霉菌的孢子萌發(fā)。

表2 香芹酚對(duì)指狀青霉菌孢子萌發(fā)率的影響Table 2 Inhibitory effect of carvacrol on spore germination in Penicillium digitatum

2.4 香芹酚對(duì)指狀青霉菌菌絲形態(tài)的影響

圖1 香芹酚對(duì)指狀青霉菌菌絲形態(tài)的影響Fig.1 Effect of carvacrol on the morphology of Penicillium digitatum

本試驗(yàn)用顯微鏡觀察經(jīng)香芹酚處理2 d后的指狀青霉菌菌絲形態(tài)（圖1），對(duì)照組的菌絲細(xì)長(zhǎng)平滑，表面平整（圖 1a），經(jīng)不同濃度香芹酚處理過(guò)的指狀青霉菌菌絲都呈現(xiàn)出不同的形態(tài)。處理濃度為 0.125 mg/mL時(shí)，菌絲表面較為平滑（圖1b）；處理濃度為0.25 mg/mL（MFC）時(shí)，菌絲表面凸起，相互纏繞(圖1c)；處理濃度為0.5 mg/mL時(shí)，菌絲膨大纏繞，有部分中空分支增多（圖1d）；處理濃度為1.0 mg/mL時(shí)，菌絲纏繞扭結(jié)，表面皺縮，菌絲大部分空腔（圖1e）。

2.5 香芹酚對(duì)指狀青霉菌細(xì)胞膜滲透性的影響

菌體細(xì)胞質(zhì)膜形成一道屏障，可允許K＋、Na＋、H＋等小分子物質(zhì)通過(guò)，這些小分子在維持胞膜功能、酶活性和菌體正常代謝方面起到至關(guān)重要的作用。這種對(duì)小分子物質(zhì)的滲透作用受控于膜結(jié)構(gòu)和成分[13]。

由圖2可看出，隨香芹酚處理時(shí)間的延長(zhǎng)，經(jīng)不同濃度處理的指狀青霉相對(duì)電導(dǎo)率都呈先上升后下降趨勢(shì)，但都顯著大于對(duì)照組。說(shuō)明香芹酚破壞了病原菌的細(xì)胞膜，使細(xì)胞膜的穩(wěn)定性發(fā)生變化，致使通透性增強(qiáng)，菌體內(nèi)的電解質(zhì)滲出，使?fàn)I養(yǎng)液電導(dǎo)率升高。處理的濃度越高，相對(duì)電導(dǎo)率值的最大值越大，這與Yang[14]等在研究提取物對(duì)意大利青霉菌抑菌機(jī)理中有相似結(jié)論。相對(duì)電導(dǎo)率最大值出現(xiàn)的時(shí)間與處理濃度有關(guān)，0.125 mg/mL處理的先達(dá)到峰值，隨后電導(dǎo)率逐漸降低，其他不同濃度處理在達(dá)到峰值后也都下降。

圖2 香芹酚對(duì)指狀青霉菌細(xì)胞膜滲透性的影響Fig.2 Effect of carvacrol on cell membrane permeability of Penicillium digitatum

2.6 香芹酚對(duì)指狀青霉菌可溶性糖含量的影響

由圖3可知，在整個(gè)培養(yǎng)期間，指狀青霉菌菌體內(nèi)的可溶性糖含量隨香芹酚處理濃度的升高呈下降趨勢(shì)。對(duì)照組可溶性糖含量為0.77%，MIC濃度（0.125 mg/mL）處理后含量為0.70%，經(jīng)1.0 mg/mL和2.0 mg/mL濃度處理后其含量分別只有0.47%和0.44%。各不同濃度處理均與對(duì)照組差異極顯著（p＜0.01），說(shuō)明一定濃度的香芹酚可以使指狀青霉菌菌體內(nèi)的含糖量降低，能抑制菌體生長(zhǎng)。不同處理之間也存在極顯著差異，表明在一定范圍內(nèi)，增大香芹酚濃度，能更好的抑制病原菌生長(zhǎng)繁殖，增強(qiáng)抑菌作用。與周夢(mèng)嬌[12]等在研究桂枝對(duì)柑橘病原真菌的抑菌機(jī)理時(shí)結(jié)果相似。

圖3 香芹酚對(duì)指狀青霉菌可溶性糖含量的影響Fig.3 Effect of carvacrol on soluble sugar content of Penicillium digitatum

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究結(jié)果初步表明，江香薷活性成分香芹酚對(duì)指狀青霉菌有較明顯的抑菌作用。香芹酚可有效降低指狀青霉菌的孢子萌發(fā)率，影響菌絲正常生長(zhǎng)形態(tài)，增加菌體細(xì)胞膜的滲透性，減少菌體內(nèi)可溶性糖含量，且香芹酚一定濃度范圍內(nèi)，增大處理濃度，能更加有效抑制孢子萌發(fā)，降低營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量，從而提高對(duì)病原菌的抑菌作用。其抑菌機(jī)理主要可能是，一定濃度的香芹酚可以破壞菌體細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)成分，使菌體內(nèi)電解質(zhì)滲出，影響菌體正常生長(zhǎng)代謝，并且處理后可降低微生物必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可溶性糖含量，導(dǎo)致病原菌無(wú)法滿足生命代謝活動(dòng)所需的能量，從而有效抑制指狀青霉菌生長(zhǎng)。江香薷內(nèi)含抑菌成分，是天然植物殺菌劑，具有很好的利用價(jià)值和開發(fā)前景，研究其活性成分香芹酚對(duì)指狀青霉菌的抑菌機(jī)理，為其在柑橘采后保鮮貯藏方面的應(yīng)用提供一定參考。