周 巍

(信陽農(nóng)林學院 實驗設備管理處，河南 信陽 464000)

側柏葉為柏科植物側柏Biota orientalis(L.)Endl的干燥枝梢和葉[1]。側柏為中國常青植物的代表，廣泛分布于全國各地區(qū)，如內(nèi)蒙古南部、廣東北部及廣西北部等，但在青海、新疆卻鮮于見到。常用于治療吐血、崩漏下血、須發(fā)早白等癥狀[2]。

近年來，從天然植物中提取植物揮發(fā)油的報道比較多，但對側柏葉揮發(fā)油相關報道相對較少。又因植物揮發(fā)油活性成分對微生物的抑菌作用情況受地區(qū)、氣候、環(huán)境等情況的影響，所以不同地區(qū)同種植物揮發(fā)油的化學組分有所差異。悉知側柏研究數(shù)據(jù)的借鑒意義因地而異[3]。

植物揮發(fā)油內(nèi)含合成香料成分和藥用成分，據(jù)此可用于人工香料的合成及藥品的研發(fā)。研究發(fā)現(xiàn)其還有抗氧化物質(zhì)、抗菌物質(zhì)等成分[4-5]。又因其幾乎沒有毒副作用，因此揮發(fā)油在人類日常生活中得到較為廣泛的運用，如食品、化妝品等領域[6-7]。據(jù)此，對揮發(fā)油的研究、開發(fā)利用是開拓未來市場的重中之重。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：側柏葉，產(chǎn)地信陽，2018年4月采自信陽農(nóng)林學院羊山校區(qū)，經(jīng)信陽農(nóng)林學院藥用植物教研室鑒定為柏科植物側柏葉。

試劑：牛肉膏蛋白胨、瓊脂、無水乙醚均為國產(chǎn)分析純

菌種：大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏菌(Salmonella Lignieres)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )、蘇玉金芽孢桿菌(Bacillus mucilaginosus)。

1.2 試驗儀器

5000 mL圓底燒瓶，電熱套，冷凝裝置，Agilent 6850/5975氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)，NIST14譜圖庫，電子分析天平(國產(chǎn))，培養(yǎng)皿，XFS-40CA電熱式壓力蒸汽滅菌器(浙江新豐醫(yī)療器械有限公司)，凈化工作臺(蘇凈集團安泰公司制造)，DNP-電熱恒溫培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠)。

1.3 試驗方法

1.3.1 側柏葉揮發(fā)油的提取工藝 工藝流程為：側柏葉破碎→水蒸氣蒸餾(冷凝)→分離取上層揮發(fā)油。

具體步驟如下：取2000 mL蒸餾水于5000 mL圓底燒瓶中，煮沸，清洗裝置中的殘留物。向清洗過的燒瓶中預先加入約1000 mL蒸餾水(防止直接加入側柏葉再加水后加熱時造成燒瓶糊底)，再加入適量的側柏葉，最后再加入適量的蒸餾水(蒸餾水的添加量不超過總容量的3/5)。1-2 h后，揮發(fā)油蒸餾完畢，因水油不相容，即可收集蒸餾出的揮發(fā)油。

1.3.2 菌種的活化 用電子天平準確稱量出牛肉膏0.3 g，蛋白胨1 g，NaCl 0.5 g，葡萄糖1 g于錐形瓶中，加入100 mL蒸餾水加熱攪拌使其完全溶解，測量溶解完全并冷卻下來的液體培養(yǎng)基的pH值，并用一定濃度的鹽酸溶液和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基溶液pH值至7～8，將配制完全的液體培養(yǎng)基分別以每支試管10 mL的量分裝至7只試管中，捆扎好，在XFS-40CA電熱式壓力蒸汽滅菌器中，進行溫度為121 ℃，時間為30 min的高壓蒸汽滅菌。將滅菌后已經(jīng)冷卻的液體培養(yǎng)基放入已經(jīng)進行過30 min紫外殺菌的凈化工作臺中，將保藏中的大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和蘇云金芽孢桿菌分別接種到兩支液體培養(yǎng)基中，把接種好的8支培養(yǎng)基放入DNP-電熱恒溫培養(yǎng)箱進行溫度為37 ℃、時間為24 h的恒溫培養(yǎng)，使菌種活化。

1.3.3 瓊脂培養(yǎng)基的配制 用電子天平準確稱量出32 g瓊脂于錐形瓶中，并加入1000 mL蒸餾水加熱并攪拌溶解，將完全溶解的瓊脂培養(yǎng)基包扎好，在XFS-40CA電熱式壓力蒸汽滅菌器中，進行溫度為121 ℃，時間為30 min的高壓蒸汽滅菌。

1.3.4 實驗用具的準備及滅菌 將抑菌活性試驗中將會用到的培養(yǎng)皿、涂布棒、鑷子、直徑6 mm的圓濾紙片、100 μL移液槍的槍頭分別用雙層報紙包裹，并用棉線捆扎好后放入XFS-40CA電熱式壓力蒸汽滅菌器中，進行溫度為121 ℃，時間為30 min的高壓蒸汽滅菌。

1.3.5 GC-MS分析條件 色譜柱為HP-5 ms毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25μm)；程序升溫,初始柱溫為60 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升溫速率升至230 ℃，保持1 min；載氣為高純氦氣，流速為1.0mL/min，進樣量為1.0 μL，不分流，進樣前揮發(fā)油用乙醚適當稀釋。EI離子源，電子能量70 eV，掃描范圍33～350 amu[8]。

2 結果與分析

2.1 化學成分分析鑒定

在上述條件下，試樣經(jīng)GC-MS聯(lián)用法分析，所得組分的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進入NIST14譜圖庫，經(jīng)過數(shù)據(jù)檢索及質(zhì)譜解析并與文獻核對，對擬合指標和質(zhì)譜數(shù)據(jù)進一步加以確認，確認了14個組分，占總峰面積的83.735%，同時通過面積歸一法從總離子流圖(圖1)中得出側柏葉揮發(fā)油中各化學組分的相對百分含量，分析鑒定結果見表1。

圖1 側柏葉揮發(fā)油的總離子流圖

序號名稱出峰時間占比分子式匹配度分子量1(蒎烯)(1R)-2,6,6-Trimethylbicyclo[3.1.1]hept-2-ene5.30148.713C10H1694136.132(2,2-二甲基-3-亞甲基二環(huán)[2.2.1]庚烷)Bicyclo[2.2.1]heptane, 2,2-dimethyl-3-methylene-, (1S)-5.5240.615C10H1697136.133Bicyclo[3.1.0]hexane, 4-methylene-1-(1-methylethyl)---3.096------4Bicyclo[3.1.0]hexane, 4-methylene-1-(1-methylethyl)---2.739------5(月桂烯).beta.-Myrcene6.1515.508C10H1691136.136(α-水芹烯).alpha.-Phellandrene6.4032.007C10H1694136.137Cyclopropane, 1,1-dimethyl-2-(3-methyl-1,3-butadienyl)---1.189------8(α-萜品烯)1,3-Cyclohexadiene, 1-methyl-4-(1-methylethyl)-6.5980.257C10H1695136.139(雙戊烯)Limonene6.8219.282C10H1693136.1310((Z)-3,7-二甲基-1,3,6-十八烷三烯)1,3,6-Octatriene, 3,7-dimethyl-, (Z)-7.0660.424C10H1695136.1311(萜品烯).gamma.-Terpinene7.2750.57C10H1695136.1312(萜品油烯)Cyclohexene, 1-methyl-4-(1-methylethylidene)-7.7652.969C10H1697136.1313(4-萜烯醇)Terpinen-4-ol9.1771.19C10H18O94154.1414Acetic acid, 1,7,7-trimethyl-bicyclo[2.2.1]hept-2-yl ester--1.62------15(1-石竹烯)Caryophyllene12.7373.077C15H2499204.1916.gamma.-Elemene--0.294------17(α-石竹烯)Humulene13.1982.014C15H2499204.1918Germacrene D--0.808------19Naphthalene, 1,2,3,5,6,8a-hexahydro-4,7-dimethyl-1-(1-methylethyl)-, (1S-cis)---0.275------20(氧化石竹烯)Caryophyllene oxide15.0070.675C15H24O98220.1821(柏木腦)Cedrol15.4686.434C15H26O95222.2總油量--83.735--

2.2 抑菌試驗

采用體外測試體系，接種過程全部在已經(jīng)進行過30 min紫外殺菌的凈化工作臺中進行。

將滅菌后的錐形瓶中的瓊脂培養(yǎng)基在未凝固前分裝至培養(yǎng)皿中，靜置等其凝固。將活化好的大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和蘇云金芽孢桿菌每種菌分別接種到3個培養(yǎng)基上，作平行對照，每個培養(yǎng)基接種100 μL菌懸液，用涂布棒將培養(yǎng)基中的菌懸液涂布均勻，靜置30 min后每個接種過的培養(yǎng)基中均勻放入3個浸泡過側柏葉揮發(fā)油的無菌小濾紙片。

將接種完全的培養(yǎng)基放入DNP-電熱恒溫培養(yǎng)箱進行37 ℃、24 h的恒溫培養(yǎng)，觀察結果。

大腸桿菌抑菌效果沙門氏菌抑菌效果金黃色葡萄球菌蘇云金芽孢桿菌

表2 側柏葉揮發(fā)油抑菌效果

“-”不抑制；“+”抑制，隨著“+”增加，抑菌效果增強

3 結論與討論

在本試驗中，利用GC-MS及體外測試體系的方法對信陽農(nóng)林學院羊山校區(qū)側柏葉揮發(fā)油進行了化學成分分析及抑菌試驗，結論如下：

從試驗中分離出20種成分，其中鑒定出的14種組分均為萜類物質(zhì)及其衍生物，占精油總量的83.735%。信陽農(nóng)林學院的側柏中的揮發(fā)油主要的化學成分是：蒎烯(48.713%)，雙戊烯(9.282%)，柏木腦(6.434%)，月桂烯(5.508%)等。

回瑞華[9]等在千山側柏葉揮發(fā)油中鑒定出30種化合物，占揮發(fā)油總量的98.67%，其主要成分萜類化合物(17個)占揮發(fā)油總量的62.99%。由此可知，中藥材的效果與其生長環(huán)境、地理條件有很大的關系。

很多萜類化合物具有重要的生理活性，是研究天然產(chǎn)物以及開發(fā)新藥的重要來源。如：蒎烯是藥品、化學原料的中間體，其衍生物可作為有用先導化合物進行進一步研究；也是合成香料的重要原料，也可用于日化品以及其它工業(yè)品的加香[10]。

從抑菌試驗結果看，側柏葉揮發(fā)油對大腸桿菌、沙門氏菌略有抑菌效果，而對金黃色葡萄球菌、蘇云金芽孢桿菌有明顯的抑制效果。

試驗表明，側柏葉有一定的藥用價值，可作為醫(yī)療工程及香料工程原料進行開發(fā)利用，本研究數(shù)據(jù)對于該植物開發(fā)利用有一定的指導作用。