陳仲萍 林俊 王群

[摘要]目的 探討TRPV5信號(hào)通路如何調(diào)控尿鈣的重吸收，影響尿鈣的濃度，從而影響到含鈣腎結(jié)石的形成。方法 將20只SD大鼠隨機(jī)抽取10只進(jìn)入結(jié)石組，10只進(jìn)入對(duì)照組。模型構(gòu)建成功后，測(cè)定大鼠24 h尿鈣濃度，并采用免疫組化和實(shí)時(shí)熒光定量PCR，分別檢測(cè)TRPV5及其mRNA在大鼠腎臟中的表達(dá)情況。結(jié)果 結(jié)石組大鼠24 h尿鈣濃度明顯高于對(duì)照組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；免疫組化顯示結(jié)石組大鼠腎臟組織的TRPV5蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示TRPV5mRNA表達(dá)量低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論 TRPV5表達(dá)下降或缺乏可使腎小管對(duì)鈣的重吸收減少，促進(jìn)含鈣腎結(jié)石的形成。

[關(guān)鍵詞]TRPV5；尿鈣；腎結(jié)石

[中圖分類號(hào)] R277.514 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2018）9（a）-0008-04

[Abstract] Objective To discuss how the TRPV5 signaling pathway regulates the reabsorption of urinary calcium， thus affecting the concentration of urinary calcium and thereby affecting the formation of calcium-containing kidney stones. Methods The twenty SD rats were randomly selected to take ten into the stone group， the others into the control group. After the success of the model building， the determination of 24 hours urinary calcium concentration in rats， and the expression of TRPV5 and its mRNA in rat kidney were detected by immunohistochemical and quantitative real time PCR. Results It was found that urinary calcine concentration of 24 hour in the stone group was significantly higher than that in the control group， the difference was statistically significant （P<0.01）. The expression of TRPV5 protein and its mRNA in the stone group were lower than in the control group， the difference was statistically significant （P<0.01）. Conclusion The decrease of TRPV5 expression or lack of TRPV5 can reduce the reabsorption of calcium in renal tubules and promote the formation of calcium kidney stones.

[Key words] TRPV5； Urinary Calcium； Kidney Stone

泌尿系結(jié)石是泌尿系統(tǒng)的常見病、多發(fā)病，由多種因素共同作用所致，尿鈣增高容易誘發(fā)或促進(jìn)含鈣尿路結(jié)石的形成。TRPV5是一種具有高度選擇性的受體活化性離子通道，并受鈣離子的反饋調(diào)節(jié)。其作為介導(dǎo)鈣離子跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的通道，在調(diào)控尿鈣水平中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但其具體的調(diào)控機(jī)制仍不清楚。本研究通過研究TRPV5信號(hào)系統(tǒng)是否參與影響尿鈣的重吸收，從而影響尿鈣的濃度，進(jìn)而影響到含鈣腎結(jié)石的形成，為進(jìn)一步防治含鈣腎結(jié)石提供新的思路。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 SD大鼠20只，體重約150 g，購于福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SCXK（閩）2012-0001]。隨機(jī)抽取10只大鼠進(jìn)入結(jié)石組，10只進(jìn)入對(duì)照組。

1.1.2動(dòng)物模型構(gòu)建 1%乙二醇配制：10 ml乙二醇加純水定容至1000 ml；2%氯化氨配制：10 g氯化氨加純水定容至500 ml。結(jié)石組大鼠每只每天給予1%乙二醇自由飲水，2%氯化氨灌胃2 ml/只。對(duì)照組給予正常水，余飼養(yǎng)條件相同，共飼養(yǎng)4周。喂養(yǎng)4周后，將大鼠放入代謝籠中收集24 h尿液后將大鼠處死，切取大鼠的一側(cè)腎臟用10%福爾馬林溶液固定，用于HE染色及免疫組化；切取大鼠的另一側(cè)腎臟保存在-80℃冰箱，用于Real-time PCR。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 24 h尿鈣檢查[11] 將收集到24 h大鼠尿流送生化自動(dòng)分析儀檢測(cè)尿鈣濃度。

1.2.2檢測(cè)腎結(jié)石大鼠模型構(gòu)建是否成功 取結(jié)石組大鼠一側(cè)腎臟做成石蠟切片后進(jìn)行HE染色，在光鏡下觀察有無結(jié)石結(jié)晶形成來判斷是否造模成功。

1.2.3免疫組化 取腎臟切片進(jìn)行免疫組化，檢測(cè)TRPV5在結(jié)石模型大鼠腎中的表達(dá)。

將兩組大鼠一側(cè)腎臟組織石蠟包埋后進(jìn)行切片，TRPV5多克隆抗體（ABCAM公司）作為一抗（1∶20）， 山羊抗兔二抗（北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司），PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，DAB顯色。用Image-Pro plus 6.0軟件做半定量分析，每個(gè)標(biāo)本選取5個(gè)不重疊視野分別測(cè)定光密度，并取平均值作為該例的OD值。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR 取兩組大鼠另一側(cè)腎臟的腎皮質(zhì)，提取出總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行Real-time PCR，檢測(cè)TRPV5在結(jié)石模型大鼠腎中的表達(dá)。

取大鼠腎臟組織約60 mg，按Trizol（美國Invitrogen公司）操作方法，抽取大鼠腎臟組織總RNA，檢測(cè)提示抽提的RNA未見明顯降解，可做為逆轉(zhuǎn)錄模板。TRPV5引物：上游引物5′-TCCGTGATGCCAACCGTACAC-3′，下游引物5′-GCCCCAATGACTGTCACGAGT-3′，GAPDH引物：上游引物5′-CGGCAAGT-TCAACGGCACAG-3′，下游引物5′-CGCCAGTAGACTCCACGACAT -3′。取總RNA 2 μL，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京天根生化科技有限公司）操作方法逆轉(zhuǎn)錄合成模板cDNA，再進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)Ct值，計(jì)算TRPV5 Ct值與GAPDH Ct值的比值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 24 h尿鈣檢查結(jié)果

結(jié)石組的24 h尿鈣濃度為（0.63±0.09）mmol/24 h，對(duì)照組為（0.36±0.06）mmol/24 h，結(jié)石組大鼠24 h的尿鈣濃度明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

2.2腎結(jié)石大鼠模型腎組織HE染色結(jié)果

結(jié)石組在腎小管區(qū)域能看到大量結(jié)石結(jié)晶形成（圖1），提示造模成功。

2.3兩組大鼠的腎臟組織免疫組化結(jié)果

結(jié)石組大鼠與對(duì)照組大鼠腎臟組織TRPV5表達(dá)的OD值分別為（0.38±0.07）、（0.62±0.10），提示TRPV5在兩組大鼠腎臟組織均有表達(dá)，且結(jié)石組大鼠腎臟組織的TRPV5蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組（P<0.01），并設(shè)有陰性對(duì)照（圖2-4）。

2.4 Real-time PCR結(jié)果

結(jié)石組大鼠腎臟組織的TRPV5 mRNA表達(dá)量低于對(duì)照組（P<0.01）（圖5）。

3討論

泌尿系結(jié)石由多種因素引起，我國泌尿系結(jié)石的發(fā)病率為1.2%～6.0%[1]，近年來，遺傳及代謝方面成為研究結(jié)石的熱點(diǎn)。鈣是泌尿系結(jié)石的重要成份，含鈣結(jié)石患者中約有1/3合并高鈣尿癥[2]。既往研究提示，尿鈣濃度升高容易誘發(fā)形成含鈣腎結(jié)石[2-3]。Daudon等[4]研究提示高鈣尿是特發(fā)性泌尿系含鈣結(jié)石形成的主要因素。泌尿系結(jié)石的治療方法有開放手術(shù)取石，體外沖擊波碎石，以及輸尿管鏡、腎鏡等聯(lián)合激光、氣壓彈道等技術(shù)，但術(shù)后復(fù)發(fā)率較高[5-6]，結(jié)石復(fù)發(fā)患者的尿鈣濃度高于結(jié)石未復(fù)發(fā)患者的尿鈣濃度[7]。Hess等[8]研究也提示，結(jié)石復(fù)發(fā)的患者中經(jīng)常出現(xiàn)高鈣尿。因此，高鈣尿是形成泌尿系結(jié)石的重要因素。

TRPVl-TRPV6是TRPV的6個(gè)成員，其中TRPV5與TRPV6跟鈣代謝及調(diào)控有關(guān)[9-10]。TRPV5是介導(dǎo)鈣離子跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的通道，可以調(diào)控尿鈣水平，其表達(dá)下降可能引起高鈣尿[11]，但具體機(jī)制目前仍不清楚。鈣的主動(dòng)吸收主要位于腎的遠(yuǎn)曲小管和集合管[12]，遠(yuǎn)曲小管的后半段（DCT2）和集合管（CNT）參與尿鈣重吸收，且是鈣離子調(diào)節(jié)激素作用部位，TRPV5在這兩個(gè)區(qū)域均有表達(dá)。TRPV5表達(dá)缺失的小鼠，其腎臟的遠(yuǎn)曲小管和集合管對(duì)鈣離子重吸收明顯減少，用TRPV5基因敲除的小鼠研究發(fā)現(xiàn)其尿鈣排泄量比正常組要高出6倍[13-14]，提示TRPV5缺乏可導(dǎo)致高尿鈣，TRPV5對(duì)尿鈣水平的調(diào)控起到關(guān)鍵作用。TRPV5激酶構(gòu)成了一種新的信號(hào)通路，Yang等[15]通過WNK（D561A/+）基因敲除鼠制作PHAⅡ動(dòng)物模型，檢測(cè)遠(yuǎn)曲小管的calbindin-D28k（CBP-D28k）表達(dá)，提示TRPV5（D561A/+）基因敲除鼠顯著表達(dá)CBP-D28k，他們認(rèn)為TRPV5上調(diào)CBP-D28k的表達(dá)，是導(dǎo)致PHAII模型中高鈣尿的原因。對(duì)遺傳性高尿鈣結(jié)石大鼠模型研究提示其TRPV5基因和蛋白表達(dá)水平低于正常對(duì)照組大鼠，但尿鈣水平則比對(duì)照組高[16]。

由此可見，TRPV5是尿液中鈣離子重吸收的重要通道，TRPV5的表達(dá)與泌尿系結(jié)石的發(fā)生率成負(fù)相關(guān)[17]，其缺乏或表達(dá)降低可產(chǎn)生高鈣尿，而腎結(jié)石患者多數(shù)伴有高尿鈣，推測(cè)TRPV5表達(dá)下降導(dǎo)致尿鈣濃度升高，這可能是含鈣結(jié)石的形成因素之一。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠腎結(jié)石模型，研究結(jié)果顯示結(jié)石組大鼠的24 h尿鈣濃度明顯高于正常對(duì)照組大鼠，而其腎臟組織的TRPV5蛋白表達(dá)水平、TRPV5 mRNA表達(dá)量則低于對(duì)照組。

結(jié)合本研究結(jié)果，提示TRPV5介導(dǎo)鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道，其表達(dá)下降或缺乏可使腎小管對(duì)鈣的重吸收減少，進(jìn)而產(chǎn)生高鈣尿，尿液中的鈣因過飽和析出，形成含鈣腎結(jié)石。除此之外，腎臟遠(yuǎn)曲小管后半段（DCT2）和集合管（CNT）與尿鈣重吸收密切相關(guān)，又是多種鈣離子調(diào)節(jié)激素的作用部位，TRPV5對(duì)尿鈣重吸收的調(diào)控是否受激素影響，目前相關(guān)報(bào)道較少，需進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2018-06-20 本文編輯：閆 佩）