付 麗，楊兆華，高雪琴，郝修振,*，馬路石

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院食品工程學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.河南伊賽牛肉股份有限公司，河南 焦作 454450）

排酸過程是現(xiàn)代肉類衛(wèi)生學(xué)及營養(yǎng)學(xué)所提倡的一種后成熟工藝[1]。動物屠宰后的半胴體經(jīng)一定時間排酸后即可完成肉類成熟。排酸牛肉又叫冷鮮牛肉、冷卻排酸牛肉，由于低溫排酸且經(jīng)歷了較為充分的解僵、成熟過程，不僅肉質(zhì)柔軟有彈性、味道鮮美，而且安全營養(yǎng)[2-3]，其肌肉蛋白的膠凝性、黏結(jié)性和保水性等加工性能更適于肉品加工。實踐證明，不經(jīng)排酸的牛肉品質(zhì)較差[4-6]，而且動物屠宰后胴體經(jīng)排酸成熟是獲得高品質(zhì)肉的必需條件[7]。

從20世紀60年代開始，發(fā)達國家就開始研究和推廣排酸牛肉。Olson等[8]對比研究宰后于2 ℃和25 ℃條件下貯藏的牛背最長肌、半腱肌和腰大肌肌原纖維的變化，揭示動物宰后肌肉成熟的機制；Neath等[9]比較研究水牛肉與黃牛肉宰后成熟期間肉嫩度及pH值的變化；Smith等[10]研究得出，電刺激處理可以明顯改善羊駝肉的嫩度。據(jù)報道，在法國，牛肉上市之前至少要經(jīng)歷6～8 d的成熟[11]，歐盟牛肉市場中100%為排酸牛肉。牛肉在我國雖然是第二大肉類食品[12]，但排酸牛肉只占25%，這是由于牛胴體排酸時間長，生產(chǎn)效率低，是冷鮮肉生產(chǎn)過程中能源消耗最大的工序[13]。一般在工業(yè)生產(chǎn)條件下，為提高生產(chǎn)效率，通常把胴體放在2～4 ℃的冷庫中吊掛2～3 d，使其適當成熟后即可分割，在運銷過程中繼續(xù)成熟，造成市場上的牛肉多數(shù)成熟不夠，迫切需要開發(fā)一種安全、快速的牛肉排酸技術(shù)；另外，國內(nèi)對于牛肉排酸過程中品質(zhì)變化規(guī)律的系統(tǒng)研究，尤其是肌原纖維超微結(jié)構(gòu)的研究較少，多數(shù)企業(yè)實際生產(chǎn)中缺乏具體的牛胴體排酸成熟操作規(guī)范，也沒有相應(yīng)的排酸牛肉標準，造成我國冷鮮牛肉品質(zhì)參差不齊。

本研究以牛肉為研究對象，測定牛肉排酸1～7 d期間的硬度、保水性、pH值、肌原纖維小片化指數(shù)（myofibril fragmentation index，MFI）、菌落總數(shù)、大腸菌群數(shù)以及肌原纖維超微結(jié)構(gòu)，對牛肉排酸過程中的品質(zhì)變化規(guī)律進行研究，為冷鮮牛肉實際生產(chǎn)提供一定的指導(dǎo)，并為牛胴體快速排酸技術(shù)的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛肉（西冷）來自河南伊賽牛肉股份有限公司，在屠宰完不超20 min的牛胴體上取相應(yīng)部分的牛肉約2 500 g（5 cm×15 cm×60 cm），簡易包裝后，在0～4 ℃條件下，2 h內(nèi)運送到實驗室。

氯化鉀、氯化鈉、磷酸鉀、乙二胺四乙酸（elhylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、氯化鈣、鹽酸、氫氧化鈉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、標準酪蛋白及50%戊二醛（均為分析純） 河南華豐試劑有限公司；平板計數(shù)瓊脂、LST肉湯、BGLB肉湯 青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1S超凈工作臺 蘇州凈化有限公司；冰溫保鮮庫 南京金陵鴻博環(huán)境科技發(fā)展有限公司；DHP-080電熱恒溫培養(yǎng)箱 鄭州生元儀器有限公司；Scientz-04無菌均質(zhì)機 寧波新芝生物科技股份有限公司；Hh-S11-2-S電熱恒溫水浴鍋 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；FA224電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；FSH-2A高速勻漿器 江蘇省金壇市白塔新寶儀器廠；pHSJ-3F酸度計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；CT-3質(zhì)構(gòu)儀 美國Brookfield公司；V-1200可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；KH20R臺式高速冷凍離心機 湖南凱達科學(xué)儀器有限公司；JEM-1400透射電子顯微鏡 日本電子株式會社。

1.3 方法

1.3.1 實驗設(shè)計

在無菌條件下，打開包裝取出牛肉，用無菌的不銹鋼鉤掛在掛腸車上，共3 塊，推入排酸冷庫內(nèi)吊掛排酸，溫度（4±1） ℃，相對濕度80%，肉樣間距10 cm。在排酸第1、2、3、4、5、6、7天時分別取肉樣測定硬度、保水性、pH值、MFI、菌落總數(shù)、大腸菌群數(shù)等指標，并用透射電鏡觀察排酸1、3、5 d時牛肉肌原纖維超微結(jié)構(gòu)的變化。

1.3.2 指標測定

1.3.2.1 硬度

參照劉佳東等[4]的方法，并稍做改動。取厚度為3 cm的肉樣，去除肉樣表面的脂肪及結(jié)締組織，裝入塑料薄膜袋，在80 ℃的水浴鍋中恒溫加熱至肉樣中心溫度達75 ℃，冷卻至室溫；用直徑1.27 cm的取樣器沿肌纖維方向鉆取3 cm長的肉柱，用質(zhì)構(gòu)儀測定硬度。采用TA7探頭，TA-SBA夾具，測試模式為壓縮，測試速率2 mm/s，返回速率1 mm/s，觸發(fā)點負載10 g，循環(huán)2 次，目標形變50%。

1.3.2.2 保水性

保水性是評價冷鮮牛肉品質(zhì)的重要指標[14-15]。汁液流失率是表征肉保水性的指標之一，其值越大說明牛肉的保水性（持水力）越差[16]。參照付麗等[17]的方法。選取紅肉部分，切成5 cm×5 cm×5 cm的肉塊，用濾紙吸干表面水分并準確稱質(zhì)量，記為吊掛前質(zhì)量（m1）；將肉樣用塑料袋套住，用線繩懸掛于冷庫內(nèi)，吊掛24 h后取出，吸干表面水分再準確稱質(zhì)量，記為吊掛后質(zhì)量（m2）。汁液流失率按照下式計算。

1.3.2.3 pH值

參照GB 5009.237—2016《食品安全國家標準 食品pH值的測定》[18]及楊文婷等[13]的方法。稱取4 g瘦肉樣，放入40 mL 0.1 mol/L KCl溶液中，并用高速勻漿器勻漿，然后用pH計測定。

1.3.2.4 MFI

MFI是宰后牛肉排酸成熟過程中，肌原纖維的結(jié)構(gòu)被破壞及蛋白質(zhì)不斷被降解的程度，可以反映冷卻牛肉成熟的進程[19]，是衡量宰后肌肉排酸成熟速率的指標。MFI越大，說明肌原纖維內(nèi)部結(jié)構(gòu)受到破壞的程度越大，則肉的嫩度越佳[20]。

參照孫天利[21]、Culler[22]、Geesink[23]等的方法。除去肉樣中筋腱、肌膜及脂肪組織，稱取4 g放入勻漿器內(nèi)，加入15 mL預(yù)冷的MFI緩沖液（含100 mmol/L氯化鉀、20 mmol/L磷酸鉀、0.1 mmol/L EDTA、1 mmol/L氯化鈣溶液，用HCl調(diào)節(jié)pH值至7.0），在冰浴條件下10 000 r/min勻漿3 次，每次20 s，間隔1 min；勻漿后加緩沖液至40 mL，然后進行冷凍離心（1 000×g、15 min、4 ℃）；棄上清液，用40 mL預(yù)冷的MFI緩沖液懸浮沉淀，繼續(xù)冷凍離心（1 000×g、15 min、4 ℃），棄上清液；在沉淀中加入20 mL預(yù)冷的MFI緩沖液，使其充分懸浮，然后用150 目濾布過濾懸浮液，除去結(jié)締組織；用10 mL預(yù)冷的MFI緩沖液沖洗離心管，再次過濾；準確吸取10 mL濾液于燒杯中待用。用雙縮脲法測定濾液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度，然后用MFI緩沖液將蛋白質(zhì)濾液的質(zhì)量濃度調(diào)整為0.5 mg/mL，在540 nm波長處測定其吸光度，所得結(jié)果乘以200即為MFI。

1.3.2.5 菌落總數(shù)

取具有代表性的肉樣，稱取無菌條件下剪碎的肉樣25 g，裝入無菌的均質(zhì)袋內(nèi)，加入225 mL生理鹽水，用拍打式勻漿機拍打3 min，制成1∶10（m/V）稀釋液，參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》[24]進行測定。

1.3.2.6 大腸菌群數(shù)

肉樣處理方法同上，采用GB 4789.3—2016《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 大腸菌群計數(shù)》[25]中的MPN（most probable number）法進行測定。

1.3.2.7 肌原纖維超微結(jié)構(gòu)

參照Mestre等[26]的方法，并稍作修改。采用透射電鏡（transimission electron microscrope，TEM）觀察排酸1、3、5 d牛肉肌原纖維超微結(jié)構(gòu)的變化。

用取樣刀順肌纖維方向?qū)⑷鈽忧谐? mm×1 mm×2 mm的小條→立即用預(yù)冷的2.5%戊二醛溶液固定4 h→用0.1 mol/L、pH 7.4的磷酸緩沖液（PBS）沖洗4 次，每次10 min→在通風(fēng)櫥內(nèi)用1%鋨酸固定1.5 h→PBS漂洗4 次，每次10 min→用梯度乙醇浸泡脫水2 次：50%乙醇15 min、70%乙醇15 min、80%乙醇15 min、95%乙醇15 min、100%乙醇15 min→無水丙酮浸泡脫水2 次，每次15 min→1∶1環(huán)氧樹脂812和丙酮溶液浸泡滲透1.5 h→2∶1環(huán)氧樹脂812和丙酮溶液浸泡滲透過夜→環(huán)氧樹脂812浸泡滲透過夜→放置于硅膠板上，37 ℃條件下聚合12 h→45 ℃條件下聚合12 h→60 ℃條件下聚合24 h→半薄切片定位、超薄切片→飽和醋酸雙氧鈾水溶液染色20 min→水洗→烘干→檸檬酸鉛溶液染色5 min→水洗→烘干→電鏡觀察、拍照（加速電壓80 kV，放大倍率50 000）（圖片由河南中醫(yī)藥大學(xué)電鏡中心提供）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個實驗重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。圖表采用Sigmaplot 12.5軟件繪制，數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 20.0統(tǒng)計分析軟件進行顯著性分析，顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 排酸過程中牛肉硬度的變化

動物宰殺前依靠一系列有氧代謝獲取能量，宰殺放血后，正常的新陳代謝停止，肌糖原無氧酵解最終形成乳酸，乳酸會使肌球蛋白凝固，肌肉很快收縮變硬。另外，由于ATP水平下降及乳酸濃度提高（pH值下降），使得肌漿網(wǎng)鈣泵的功能失常，失去鈣泵作用，無法收回釋放的Ca2＋，致使其濃度增高，引起肌動蛋白沿著肌球蛋白滑動收縮；Ca2＋促使粗絲中肌球蛋白頭部的ATP酶活化，從而更加快了ATP的分解，促使肌動蛋白細絲和肌球蛋白粗絲之間交聯(lián)形成肌動球蛋白，引起肌肉連續(xù)且不可逆的收縮，稱為肉的僵直。達到僵直期的肌肉內(nèi)將發(fā)生諸多化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致肌肉的結(jié)構(gòu)及成分發(fā)生變化，使肉變軟，同時肉的保水性增加，牛肉能達到最佳風(fēng)味，即為肉的解僵及成熟。

圖1 排酸過程中牛肉硬度的變化Fig. 1 Change in beef hardness during postmortem aging

由圖1可知，排酸期間牛肉的硬度呈先上升后下降的趨勢。排酸1～3 d期間，肉樣硬度極顯著增加（P＜0.01），由1 349 g升至2 493 g，說明屠宰后的牛肉在排酸初期逐漸進入僵直期，使肌肉硬度變大，在排酸3 d時進入最大僵直期[19-20]，這與張成龍等[2]研究得出的排酸1 d牛肉最硬的結(jié)論不太一致，這可能是牛品種不同所致；從排酸3 d開始，肉樣的硬度開始極顯著下降（P＜0.01），排酸7 d時降為1 844 g，這可能是由于隨著排酸的進行，肉樣經(jīng)過最大僵直期后開始進入解僵期，肌肉組織內(nèi)發(fā)生一系列生物化學(xué)變化，尤其是在組織蛋白酶的作用下，肌肉蛋白發(fā)生降解，肌原纖維小片化使肌肉保水性回升，從而使肉樣的硬度降低，嫩度增加[27]，這與Braghieri等[28]研究發(fā)現(xiàn)7 d成熟期會明顯改善牛肉嫩度的結(jié)論一致。

2.2 排酸過程中牛肉保水性的變化

圖2 排酸過程中牛肉汁液流失率的變化Fig. 2 Change in beef drip loss during postmortem aging

由圖2可知，隨著排酸時間的延長，肉樣汁液流失率呈先上升后下降的趨勢。排酸1～3 d時，肉樣的汁液流失率極顯著增加（P＜0.01），這是由于在排酸的前3 d，肉樣處于僵直狀態(tài)，牛肉組織中的自由水不斷外滲，導(dǎo)致汁液流失率不斷增大，保水性逐漸變差，尤其是排酸第3天時達到最大僵直期，牛肉的保水性最差；排酸3 d后，隨著排酸時間的延長，牛肉的汁液流失率開始顯著下降（P＜0.05），說明牛肉進入解僵期，肌肉回軟，保水性開始恢復(fù)；但排酸第7天時牛肉的保水性顯著低于排酸1 d時（P＜0.05），說明宰后牛肉經(jīng)過僵直后肌肉變硬，保水性下降，解僵、成熟后保水性上升，但無法恢復(fù)熱鮮肉狀態(tài)，這與圖1的趨勢相一致。

2.3 排酸過程中牛肉pH值的變化

pH值對肉色、嫩度及保水性等指標均有重要影響[29-30]。牛屠宰后，由于肌肉中糖原無氧酵解產(chǎn)生的乳酸和ATP分解產(chǎn)生的磷酸根離子使肉的pH值逐漸下降，當肌糖原無氧酵解酶被無氧酵解產(chǎn)生的酸和ATP降解產(chǎn)生的氨氣所抑制而失活，使糖酵解停止，此時肉pH值達到動物宰后最低值。

圖3 排酸過程中牛肉pH值的變化Fig. 3 Change in beef pH value during postmortem aging

由圖3可知，牛肉在排酸過程中，pH值呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。排酸前3 d時，牛肉的pH值下降極顯著（P＜0.01），這是由于牛被宰殺后，牛肉組織細胞即開始進行無氧呼吸，細胞內(nèi)的糖類物質(zhì)經(jīng)生化反應(yīng)生成乳酸，剛宰殺后的牛肉細胞內(nèi)有很多糖類物質(zhì)，故在排酸前3 d，乳酸以持續(xù)較快的速率生成，使得牛肉的pH值下降較快；排酸1 d時，牛肉的pH值為5.78，與NY/T 2793—2015《肉的食用品質(zhì)客觀評價方法》[31]規(guī)定的宰后24 h時牛肉pH值介于5.50～5.90的標準一致；排酸3 d時，牛肉pH值降至最低，為5.56，這與王凱[32]研究得出的黃牛肉排酸第3天時pH值降為最低（5.6）的結(jié)果基本一致，但與劉佳東等[4]研究得出的牦牛肉排酸4 d及黃牛肉排酸5 d時pH值降至最低的結(jié)果不一致，與劉萌等[33]研究得出的牛屠宰后4 d pH值降為最低的結(jié)論也不一致，這可能是由于牛品種及牛肉部位不同；從排酸第3天開始，牛肉pH值開始顯著回升（P＜0.05），原因是隨著糖類物質(zhì)的消耗殆盡，乳酸生成結(jié)束，開始進行生化分解，其分解速率高于生成速率，pH值開始升高，故在排酸的后4 d，pH值以較為緩慢的速率回升，在排酸第7天達到5.84，恢復(fù)到正常新鮮牛肉的pH值，說明宰后牛肉達到排酸成熟需要7 d。

2.4 排酸過程中牛肉MFI的變化

MFI是反映肌細胞內(nèi)部肌原纖維及其骨架蛋白完整程度的指標。由圖4可知，在牛肉排酸過程中，隨著排酸時間的延長，肉樣MFI顯著增加（P＜0.05），說明牛肉肌原纖維內(nèi)部結(jié)構(gòu)完整性受到的破壞程度不斷增加，牛肉的嫩度不斷提高，這與劉玉青[34]、Li Ke[27]等的研究結(jié)果基本一致。排酸3～5 d時，肉樣的MFI增加極顯著（P＜0.01），這可能是由于肌原纖維在微生物酶和蛋白酶的作用下，結(jié)構(gòu)被破壞，造成肌原纖維的小片化，且隨著排酸過程的進行，小片化程度不斷加深；也有可能是由于在冷藏條件下，隨著時間的延長，肌原纖維粗細絲逐漸發(fā)生冷收縮以及鈣離子的長時間作用，造成Z線斷裂，使肉樣的MFI升高。上述結(jié)果說明，排酸3 d時宰后牛肉進入解僵階段。

2.5 排酸過程中牛肉菌落總數(shù)的變化

由圖5可知，在牛肉排酸過程中，菌落總數(shù)呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢（P＜0.05）。原因可能是牛肉在4 ℃條件下排酸，雖然溫度低但并不能完全抑制微生物的生長與繁殖，尤其是一些嗜冷菌在0～4 ℃條件下生長繁殖，造成了菌落總數(shù)的不斷上升，當排酸7 d時菌落總數(shù)達4.82 （lg（CFU/g）），肉樣為次鮮肉[35]。因此，牛肉在排酸期間一定要控制好排酸間的衛(wèi)生狀況。

圖5 排酸過程中牛肉菌落總數(shù)的變化Fig. 5 Change in beef aerobic plate count during postmortem aging

2.6 排酸過程中牛肉大腸菌群數(shù)的變化

圖6 排酸過程中牛肉大腸菌群數(shù)的變化Fig. 6 Change in beef coliform count during postmortem aging

由圖6可知，牛肉在排酸過程中，大腸菌群數(shù)呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢（P＜0.05）。這可能是由于牛肉在進入排酸庫之前，受到了空氣中大腸菌群或牛糞的污染，其在排酸過程中不斷繁殖，造成了大腸菌群數(shù)的不斷上升，同樣說明牛肉在排酸期間一定要控制好排酸間的衛(wèi)生狀況。

2.7 排酸過程中牛肉超微結(jié)構(gòu)（肌原纖維）的變化

圖7 排酸過程中牛肉的肌原纖維超微結(jié)構(gòu)Fig. 7 Ultrastructure of beef myofibrils during postmortem aging

宰后僵直期間，肌肉肌節(jié)長度與肉的嫩度呈正相關(guān)，即肌節(jié)長度越長，肉質(zhì)越嫩[36-38]。正常肌肉肌節(jié)長度為2 000～2 500 nm。由圖7a可知，排酸1 d時，肌原纖維結(jié)構(gòu)清晰，Z線排列較整齊，肌節(jié)長度為1 495.21 nm；排酸3 d時，Z線開始扭曲，部分已斷裂，肌節(jié)長度為1 464.17 nm，最窄處只有1 402.48 nm，說明此時肌節(jié)處于收縮狀態(tài)，原因可能是肌漿網(wǎng)釋放的鈣離子激活A(yù)TP酶活性，引起肌肉收縮；排酸5 d時，Z線模糊不清，肌節(jié)長度為1 718.52 nm，較寬處為1 765.84 nm，較窄處為1 649.41 nm，說明隨著排酸時間的延長，肌動蛋白和肌球蛋白的僵直聯(lián)結(jié)弱化，導(dǎo)致肌節(jié)僵直收縮復(fù)原，僵直肌節(jié)長度恢復(fù)，使肌節(jié)長度逐漸增加。

由圖7b可知，在牛肉排酸1 d時，Z線、粗細絲清晰可見；排酸3 d時，Z線、粗細絲已扭曲變形，變得模糊不清，且呈點狀分布，說明此時Z線已斷裂且大部分被降解；排酸5 d時，Z線變得更加模糊，幾乎消失，成為暈染狀，幾何構(gòu)型發(fā)生明顯變化，粗細絲依稀可見。這也從超微結(jié)構(gòu)的角度證明了牛肉排酸過程中，肌原纖維小片化程度確實在不斷加深。

3 結(jié) 論

活牛被宰殺后，其肌肉組織轉(zhuǎn)化成適宜食用的肉要經(jīng)歷僵直、解僵和成熟3 個過程，即牛胴體的冷卻排酸過程，也就是牛肉的成熟過程[39-40]。本研究通過對排酸過程中牛肉品質(zhì)變化的研究發(fā)現(xiàn)，隨著排酸過程的進行，牛肉的硬度和汁液流失率均先增大后減小，在排酸3 d時達到最大值；pH值則是先降低后升高，在排酸3 d時達到最低值5.56，在排酸7 d時回升到5.84，達到正常新鮮牛肉的范圍；MFI、菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)均逐漸增大；從TEM觀察肌原纖維超微結(jié)構(gòu)可以發(fā)現(xiàn)，Z線逐漸扭曲變形直至近乎消失，證明肌原纖維確實在不斷降解。

由以上研究得出結(jié)論：牛肉在0～4 ℃條件下排酸成熟需要至少7 d，排酸3 d時為最大僵直期，即前3 d是排酸的關(guān)鍵時期；另外，進入排酸間前最好對胴體表面進行一定的減菌處理，并且嚴格執(zhí)行衛(wèi)生操作規(guī)范，控制好屠宰間、排酸間的環(huán)境衛(wèi)生，以盡量減少牛胴體表面初始菌數(shù)，從而保證排酸成熟過程中牛肉的品質(zhì)。