鹿文靜 趙煜 王克玉

266035青島，山東大學(xué)齊魯醫(yī)院（青島）皮膚科（鹿文靜）；山東大學(xué)齊魯醫(yī)院皮膚科（趙煜、王克玉）

京尼平苷是一種環(huán)烯醚萜類化合物，具有抗炎［1?2］、抗血栓［3］、抵抗肝損傷［4］等多種藥理活性。此外有多項研究顯示，京尼平苷對氧化應(yīng)激引起的多種細胞損傷有保護作用［5?7］，且此保護作用與PI3K?Akt信號通路的活化有關(guān)［6?7］。氧化應(yīng)激損傷是白癜風(fēng)發(fā)病的一個重要環(huán)節(jié)［8?10］。白癜風(fēng)患者表皮中H2O2過量聚集［11］，高濃度 H2O2可氧化損傷核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等，產(chǎn)生大量氧化產(chǎn)物，直接或間接引起黑素細胞突變或死亡［12］。目前尚無京尼平苷對黑素細胞氧化損傷作用方面的研究。為了探討京尼平苷對黑素細胞的氧化損傷有無保護作用及其可能的機制，我們應(yīng)用體外培養(yǎng)的人正常黑素細胞，以H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，觀察京尼平苷對細胞生長狀態(tài)及抗氧化酶系統(tǒng)的影響，并檢測PI3K?Akt信號通路在其中的作用。

材料與方法

一、試劑和儀器

黑素細胞培養(yǎng)基（M254基礎(chǔ)培養(yǎng)基）、人黑素細胞生長添加劑2（HMGS?2）、1%青霉素/鏈霉素、胰酶為美國Gibco公司產(chǎn)品；中性酶、噻唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）抑制劑LY294002為美國Sigma公司產(chǎn)品。兔抗人β肌動蛋白、Akt、p?Akt、血紅素加氧酶1（HO?1）、谷胱甘肽過氧化物酶1（GPx?1）抗體及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗均為美國Abcam公司產(chǎn)品?；钚匝酰≧OS）檢測試劑盒、總超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒（WST?8法）、過氧化氫酶（CAT）活性檢測試劑盒、RIPA裂解液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS?PAGE）預(yù)制膠、BCA蛋白濃度測定試劑盒均為上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒來自美國Millipore公司產(chǎn)品。

二、實驗方法

1.黑素細胞分離、培養(yǎng)和純化：正常人表皮黑素細胞來源于山東大學(xué)齊魯醫(yī)院泌尿外科門診行包皮環(huán)切術(shù)的健康青少年包皮，所有樣本取材前均由供皮者監(jiān)護人簽署知情同意書。取包皮，聚維酮碘消毒3 min，PBS洗滌3次，去除皮下組織，將包皮剪成約0.5 cm×0.5 cm的小片，置于0.25%中性酶中，4℃放置過夜，分離表真皮。用0.25%胰酶37℃消化表皮10 min，吹打成細胞懸液，200目篩網(wǎng)過濾，PBS洗滌2次，接種至含100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素及1%HMGS?2的M254培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每3天更換培養(yǎng)液，10～14 d后待細胞長至80%融合時傳代，取第2～4代表皮黑素細胞用于實驗。

2.實驗分組及處理：收集第2～4代對數(shù)生長期黑素細胞，培養(yǎng)24 h后分為6組。①對照組：在M254培養(yǎng)基中培養(yǎng)，不作任何處理；②京尼平苷組：參考文獻［13?14］，首先選擇62.5、125、250、500、1 000 μmol/L H2O2孵育黑素細胞約4 h，觀察黑素細胞的增殖率，發(fā)現(xiàn)250 μmol/L H2O2能夠明顯抑制細胞增殖且又不至于細胞死亡過多，因此選用250 μmol/L H2O2用于后續(xù)實驗。然后參考文獻［5?6］選用5、25、125、625 μmol/L京尼平苷培養(yǎng)黑素細胞，發(fā)現(xiàn)細胞增殖率與對照組無明顯差異，用5、25、125、625 μmol/L京尼平苷聯(lián)合250 μmol/L H2O2培養(yǎng)黑素細胞，發(fā)現(xiàn)5、25 μmol/L京尼平苷組細胞增殖率與H2O2組無明顯差異，125、625 μmol/L京尼平苷組細胞增殖率高于H2O2組，故選用125 μmol/L京尼平苷進行后續(xù)實驗。用含125 μmol/L京尼平苷的M254培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，更換為M254培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)5 h；③LY294002組，細胞在M254培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，加入含 5 μmol/L LY294002的 M254培養(yǎng)基作用1 h，更換為M254培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)4 h；④H2O2組：細胞在M254培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，然后根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，加入含250 μmol/L H2O2的M254培養(yǎng)基作用4 h，更換為M254培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)1 h；⑤京尼平苷+H2O2組：用含125 μmol/L京尼平苷的M254培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，換液后加入含250 μmol/L H2O2的M254培養(yǎng)基作用4 h，更換為M254培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)1 h；⑥京尼平苷+LY294002+H2O2組：用含125 μmol/L京尼平苷的M254培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，換液，加入含5 μmol/L LY294002的M254培養(yǎng)基作用1 h，再次換液加入含250 μmol/L H2O2的M254培養(yǎng)基作用4 h。

3.MTT法檢測細胞活性：將黑素細胞以5×103/孔接種至96孔板，按上述分組處理，每組5個復(fù)孔，并設(shè)空白組（不含細胞，僅有培養(yǎng)基）。經(jīng)相應(yīng)藥物處理后，每孔加5 g/L MTT溶液10 μl，在培養(yǎng)箱中作用4 h后，棄上清液，每孔加100 μl DMSO，用酶標儀在570 nm波長處測定每孔吸光度（A值）。細胞增殖率（%）=（A含藥組-A空白組）/（A對照組-A空白組）×100%。

4.Western印跡法檢測p?Akt、Akt、HO?1和GPx?1蛋白水平：按上述分組處理黑素細胞，每組3個復(fù)孔。每孔加入100 μl RIPA裂解液裂解30 min，收集細胞后，4℃離心機12 000 r/min（離心半徑7.7 cm）離心30 min。取上清液用BCA蛋白濃度測定試劑盒定量蛋白濃度，加入5×蛋白上樣緩沖液充分混勻，100 ℃變性10 min，每樣本取 15 μl，SDS?PAGE（預(yù)制膠）上樣，電泳后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）。取PVDF膜置于10%脫脂牛奶中封閉非特異性抗原2 h，分別加入兔抗人p?Akt（1∶1 000稀釋）、Akt（1∶1 500稀釋）、HO?1（1∶2 500稀釋）、GPx?1（1∶1 000稀釋）及β肌動蛋白單克隆抗體（1∶1 000稀釋），4℃過夜，TBST洗脫3次后加入二抗（1∶1 000稀釋）孵育2 h，暗室內(nèi)ECL試劑盒顯影。用目的條帶p?Akt、Akt、HO?1、GPx?1與相應(yīng)內(nèi)參β肌動蛋白條帶的灰度值比值表示蛋白相對表達水平。

5.SOD和CAT酶活性檢測：細胞分組處理方法同上，收集蛋白，定量蛋白濃度。按照SOD活性檢測試劑盒和CAT檢測試劑盒說明書操作，分別通過檢測A450值和A520值計算SOD酶和CAT酶活性。

6.ROS含量檢測：將黑素細胞以5×104/孔接種在6孔板中，細胞分組方法同上。收集細胞后，PBS沖洗2遍，加入10 μmol/L熒光探針2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH?DA），在暗室中37℃孵育20 min，上流式細胞儀（美國BD公司）檢測。以細胞熒光強度反映細胞ROS水平。

7.統(tǒng)計學(xué)分析：應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件分析。各指標數(shù)據(jù)以表示，均符合正態(tài)分布，單因素方差分析（ANOVA）進行多組間比較，SNK?q檢驗進行組間兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、京尼平苷降低H2O2對黑素細胞增殖活性的影響

MTT實驗結(jié)果顯示，京尼平苷組與對照組黑素細胞增殖率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（q=0.6818，P＞0.05），而H2O2組顯著低于對照組（q=10.06，P＜0.01）和京尼平苷 +H2O2組（q=9.378，P＜ 0.05）；京尼平苷+LY294002+H2O2組顯著低于京尼平苷+H2O2組（q=5.822，P＜ 0.05），與H2O2組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（q=1.257，P＞0.05）。見表1。

二、京尼平苷活化黑素細胞PI3K?Akt信號通路

與對照組相比，京尼平苷組黑素細胞Akt磷酸化水平（p?Akt/Akt）無明顯變化（q=2.014，P＞0.05），而H2O2組則顯著降低（q=6.486，P＜ 0.01）。京尼平苷+H2O2組p?Akt/Akt水平顯著高于H2O2組（q=5.044，P＜0.05）和京尼平苷+LY294002+H2O2組（q=8.560，P＜0.01），而后兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（q=3.516，P＞ 0.05）。見表1，圖1。

三、京尼平苷促進氧化應(yīng)激下黑素細胞中HO?1、GPx?1的表達

H2O2組黑素細胞HO?1和GPx?1表達水平顯著低于對照組（q值分別為4.580、4.388，均P＜0.05）和京尼平苷 +H2O2組（q值分別為5.282、6.265，均P＜0.01），京尼平苷+LY294002+H2O2組顯著低于京尼平苷 +H2O2組（q值分別為4.064、6.618，P值分別 ＜ 0.05、＜ 0.01）。見表1，圖2。

表1 京尼平苷對黑素細胞增殖率、SOD活性、CAT活性、ROS含量及p?Akt、血紅素加氧酶1（HO?1）和谷胱甘肽過氧化物酶1（GPx?1）蛋白表達水平的影響（）

表1 京尼平苷對黑素細胞增殖率、SOD活性、CAT活性、ROS含量及p?Akt、血紅素加氧酶1（HO?1）和谷胱甘肽過氧化物酶1（GPx?1）蛋白表達水平的影響（）

注：黑素細胞增殖率、SOD活性、CAT活性和ROS含量檢測實驗重復(fù)5次；p?Akt、HO?1、GPx?1蛋白水平檢測實驗重復(fù)3次，以目的條帶與相應(yīng)內(nèi)參β肌動蛋白條帶的灰度值比值表示蛋白表達水平。與對照組比較，aP＜0.01，bP＜0.05；與H2O2組比較，cP＜0.05，dP＜0.01；與京尼平苷 +H2O2組比較，eP ＜ 0.05，fP ＜ 0.01。SOD：超氧化物歧化酶；CAT：過氧化氫酶；ROS：活性氧

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圖1 京尼平苷對黑素細胞p?Akt、Akt蛋白表達的影響 1：對照組；2：京尼平苷組；3：LY294002組；4：H2O2組；5：京尼平苷 +H2O2組；6：京尼平苷 +LY294002+H2O2組。H2O2組p?Akt蛋白表達明顯低于對照組，京尼平苷+H2O2組p?Akt蛋白較H2O2組明顯增加，而京尼平苷+LY294002+H2O2組較京尼平苷+H2O2組表達減少

四、京尼平苷提高氧化應(yīng)激下黑素細胞SOD活性和CAT活性

與對照組比較，京尼平苷組黑素細胞SOD和CAT酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），H2O2組SOD和CAT活性則顯著降低（q值分別為9.842、9.400，均P＜0.01）。京尼平苷+H2O2組SOD和CAT酶活性顯著高于H2O2組（q值分別為5.033、5.929，均P＜0.05）和京尼平苷 +LY294002+H2O2組（q值分別為5.013、4.946，均P＜ 0.05）。見表1。

五、京尼平苷抑制氧化應(yīng)激下黑素細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生

京尼平苷組ROS含量與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（q=0.133，P＞ 0.05），H2O2組顯著高于對照組（q=17.140，P＜ 0.01）和京尼平苷 +H2O2組（q=10.910，P＜0.01），京尼平苷 +LY294002+H2O2組顯著高于京尼平苷 +H2O2組（q=5.048，P＜0.05），見表1。

圖2 京尼平苷對黑素細胞血紅素加氧酶1（HO?1）和谷胱甘肽過氧化物酶1（GPx?1）蛋白表達的影響 1：對照組；2：京尼平苷組；3：LY294002組；4：H2O2組；5：京尼平苷 +H2O2組；6：京尼平苷 +LY294002+H2O2組。H2O2組的HO?1、GPx?1蛋白表達明顯低于對照組，京尼平苷+H2O2組兩種蛋白的表達均較H2O2組明顯增加，而京尼平苷+LY294002+H2O2組則較京尼平苷+H2O2組表達減少

討 論

近年研究發(fā)現(xiàn)，ROS所致的氧化應(yīng)激反應(yīng)是黑素細胞凋亡及黑素生成障礙的重要因素。已有大量研究證明，白癜風(fēng)患者皮損及全身處于高氧化應(yīng)激狀態(tài)［15?17］，且抗氧化系統(tǒng)出現(xiàn)障礙［18］，氧化-抗氧化失衡，導(dǎo)致ROS過度聚集，攻擊黑素細胞，干擾其正常代謝、功能和分化，誘發(fā)機體的自身免疫反應(yīng)，造成表皮黑素細胞不可逆性損傷，導(dǎo)致白癜風(fēng)患者皮膚和毛囊黑素細胞數(shù)量減少，引起局限性或泛發(fā)性皮膚色素脫失。

PI3K?Akt信號通路在細胞增殖、分化、凋亡及功能表達等方面發(fā)揮重要作用。本實驗結(jié)果顯示，H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激后黑素細胞p?Akt減少，京尼平苷預(yù)培養(yǎng)可以提高氧化應(yīng)激下黑素細胞Akt磷酸化水平，活化PI3K?Akt信號通路。黑素細胞PI3K和Akt活化后能夠激活核因子NF?E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2?related factor 2，Nrf2），促使其轉(zhuǎn)位到細胞核［19］，啟動一系列抗氧化酶如HO?1［13?14］、SOD、CAT［14］、GPx［20］的表達。HO?1 屬于微粒體酶系，是血紅素分解代謝的限速酶，能夠?qū)谒丶毎趸瘬p傷起保護作用［21］。SOD能夠通過催化超氧陰離子的岐化反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化為毒性更低的H2O2；而CAT和GPx?1能把H2O2分解為O2和H2O，從而保護細胞免受氧化應(yīng)激損傷。Yin等［7］發(fā)現(xiàn)，京尼平苷能夠通過活化PI3K上調(diào)海馬神經(jīng)元細胞中HO?1的表達，增強細胞抗氧化性。Wang等［22］在對小鼠急性酒精性肝損傷模型的研究中發(fā)現(xiàn)，京尼平苷可以提高SOD、CAT和GPx等抗氧化酶的水平。上述研究說明，京尼平苷通過影響抗氧化酶發(fā)揮其抗氧化作用。本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激后，HO?1和GPx?1蛋白表達下調(diào)，細胞內(nèi)SOD和CAT活性降低，ROS含量顯著增加，而京尼平苷可以改善H2O2對上述抗氧化酶的抑制作用，進而減少細胞內(nèi)ROS含量，提高黑素細胞存活率。另外，京尼平苷對黑素細胞的氧化保護作用能夠被PI3K抑制劑LY294002所抑制，說明京尼平苷通過PI3K?Akt信號通路發(fā)揮其抗氧化作用。

綜上，本研究表明，京尼平苷能夠通過PI3K?Akt途徑上調(diào)抗氧化酶HO?1和GPx?1蛋白水平，增強SOD和CAT活性，從而提高黑素細胞的抗氧化能力，保護其免受氧化應(yīng)激損傷，為京尼平苷用于防治白癜風(fēng)提供實驗依據(jù)和和研究方向。