張軍

(慈溪市庵東鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村辦公室，浙江 寧波 315327)

黑木耳(Auriculariaauricula)是一種自然生長(zhǎng)或人工栽培在各種朽木上的真菌，有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1]，是傳統(tǒng)的出口商品[2]。黑木耳不僅可以防治冠心病等心血管疾病，還可以防癌。黑木耳還有豐富的植物膠質(zhì)和纖維素，具有減肥、治便秘和清胃滌腸等功效；黑木耳還含有發(fā)酵素、植物堿和多種礦物質(zhì)，能促進(jìn)消化系統(tǒng)及泌尿系統(tǒng)各腺體的分泌，有協(xié)助催化結(jié)石的作用。還因含高達(dá)185 mg·100 g-1的Fe而成為天然的補(bǔ)血食品[1]。黑木耳是一種在偏酸性環(huán)境下生長(zhǎng)的食用菌，最適的pH在5.0～6.5[3]，從而造成許多酸適應(yīng)性雜菌對(duì)其生產(chǎn)過(guò)程產(chǎn)生或輕或重的影響，最終影響其產(chǎn)量和質(zhì)量。因此，研究耐高pH的黑木耳菌株是減輕或避免雜菌污染的最有效方法之一。本文就從8個(gè)菌株在不同pH環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，最后篩選出長(zhǎng)勢(shì)旺、抗雜菌能力強(qiáng)、菌絲健壯的耐高pH菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源

供試菌株有單片2號(hào)(單片、段木分離)、RF82(耳木分離)、139(段木分離)、RF145(耳木分離)、RF176(耳片組織分離)、916、8808(袋料)和K3(袋料、段木分離)，依次編號(hào)為A1～A8，其中A1、A3、A6、A7及A8由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菌種場(chǎng)提供，A2、A4和A5由陜西省寧強(qiáng)縣真菌研究所提供。

1.1.2 麩皮培養(yǎng)基

每1 000 mL培養(yǎng)基由麩皮150 g、瓊脂20 g、葡萄糖20 g、VB11片、Vc2片配制而成，還有濃度2 mol·L-1的NaOH和HCl溶液以調(diào)節(jié)溶液的pH值。

1.2 方法

1.2.1 菌株的初步篩選

先將8個(gè)菌株的菌種活化，按1.1.2中的材料(不用NaOH和HCl)配制自然狀態(tài)的麩皮培養(yǎng)基，在121.3 ℃下高溫高壓滅菌25 min，倒入平板，分別將8個(gè)菌株接入直徑約0.5 cm的菌塊，每處理設(shè)4個(gè)重復(fù)，置于25 ℃下恒溫箱中培養(yǎng)，每天定時(shí)觀察菌株的生長(zhǎng)狀況并作記錄。

1.2.2 不同pH值的培養(yǎng)基上耐高pH值菌株的篩選

按1.1.2中的材料配制麩皮培養(yǎng)基，在121.3 ℃下高溫高壓滅菌，在超凈工作臺(tái)上用2 mol·L-1的NaOH和HCl溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值梯度為4、5、6(CK)、7、8、9、10、11和12等9個(gè)值，然后將培養(yǎng)基倒入平板，接入1.2.1方法中所篩選的幾個(gè)菌株，每處理重復(fù)4個(gè)，于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，每天定時(shí)觀察記錄各菌株的生長(zhǎng)情況。

1.2.3 Vc對(duì)菌株耐堿性的影響

在進(jìn)行耐高pH值的菌株篩選的同時(shí)，挑選其中1個(gè)菌株作Vc對(duì)其耐堿性的影響試驗(yàn)。本試驗(yàn)選擇的是A2(RF82)號(hào)菌株。配制培養(yǎng)基的方法如1.1.2(不加Vc)，設(shè)培養(yǎng)基pH值梯度為6(CK)、7、8、9和10，接種，每處理重復(fù)4個(gè)，25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，每天定時(shí)對(duì)比觀察并記錄菌株生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 自然pH值環(huán)境下菌株初步篩選

各菌株在自然培養(yǎng)基上接種1 d后均可萌發(fā)，但生長(zhǎng)速度有較大差別。由表1可知，A1、A2、A4和A7菌絲生長(zhǎng)得很快，菌落直徑也很大；但A1的菌絲相對(duì)較薄，A2、A4和A7則很濃厚，長(zhǎng)勢(shì)很旺，菌絲健壯、潔白，且A7表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗菌能力；A3、A5長(zhǎng)勢(shì)均一般，但A5的菌落邊緣比A3整齊，速度也稍快；A8雖然長(zhǎng)速不是很快，但菌絲很濃密、也很健壯。根據(jù)各菌株的綜合生長(zhǎng)情況，結(jié)合其不同來(lái)源，篩選出A1、A2、A5和A7等4個(gè)菌株作為耐高pH值篩選試驗(yàn)菌株。

表1 黑木耳菌株在自然pH值的麩皮培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀態(tài)

2.2 耐高pH菌株的篩選

不同pH值環(huán)境下菌絲的生長(zhǎng)速度、萌發(fā)時(shí)間和長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿的時(shí)間都可以用來(lái)衡量該菌株對(duì)該生長(zhǎng)環(huán)境的適應(yīng)程度。各菌株在不同pH值環(huán)境下的生長(zhǎng)情況和對(duì)高pH值環(huán)境的適應(yīng)情況如圖1所示。

圖1 不同pH值對(duì)黑木耳菌絲生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，各菌株在pH值為4時(shí)還能萌發(fā)生長(zhǎng)，在pH為11時(shí)各菌株幾乎不能萌發(fā)，而A7不僅可以萌發(fā)，還稍擴(kuò)散生長(zhǎng)。其中A1在pH為6和8時(shí)速度最快，也較均勻；但在高pH值環(huán)境下，如pH值為9和10時(shí)生長(zhǎng)雖較快(日平均生長(zhǎng)速度分別為48.988和30.798 mm)，但菌絲很薄，不健壯，抗雜菌能力不強(qiáng)。A2在各pH值環(huán)境下生長(zhǎng)情況均較A1好，其生長(zhǎng)最快是在pH值為8的環(huán)境中，日平均生長(zhǎng)速度達(dá)65.366 mm，比在自然pH值(pH值6)和pH值 7下的速度快2 mm左右；在高pH值環(huán)境(pH值9和pH值 10)下，A2的菌絲長(zhǎng)勢(shì)較旺(日平均長(zhǎng)速分別為55.851和36.304 mm)，且菌絲濃厚、潔白，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗雜菌能力。A5在自然pH值環(huán)境下菌絲生長(zhǎng)最快，此后隨pH值的升高而降低，在pH 9和pH 10下生長(zhǎng)較快(日均長(zhǎng)速分別是48.742和31.850 mm)，但不均勻，有些菌絲成塊狀，且菌落邊緣不整齊。A7的總體長(zhǎng)速和均勻度較前三者好，其最適pH也是7，但在高pH值環(huán)境下生長(zhǎng)速度較前三者均快(pH值 9和pH值10日均生長(zhǎng)速度分別為58.042和41.387 mm)，且菌絲均勻一致、健壯、潔白、抗菌力強(qiáng)；在pH值11時(shí)菌絲還能萌發(fā)和稍微生長(zhǎng)，郭硯翠等[4]的試驗(yàn)結(jié)果表明有較明顯的差異，但在該試驗(yàn)中與其他三者差異顯著，最終選出A7號(hào)(8808)菌株為目標(biāo)菌株。

2.3 Vc對(duì)黑木耳菌株耐堿性的影響

Vc在黑木耳菌絲培養(yǎng)過(guò)程中為菌絲的生長(zhǎng)提供了豐富的營(yíng)養(yǎng)，有效地促進(jìn)了菌絲生長(zhǎng)，對(duì)其生長(zhǎng)速度和菌絲形態(tài)產(chǎn)生重要且明顯的影響。由表2可知，添加Vc的對(duì)照組無(wú)論是生長(zhǎng)速度、長(zhǎng)勢(shì)，還是菌絲的濃密程度均比試驗(yàn)組強(qiáng)。由圖2可知，在偏中性pH值環(huán)境下，菌絲在含Vc培養(yǎng)基上的總體生長(zhǎng)狀態(tài)比試驗(yàn)組好，在偏堿環(huán)境下則表現(xiàn)出生長(zhǎng)速度較快，在其他方面則無(wú)明顯差別。因此認(rèn)為，培養(yǎng)基中所含的Vc不僅對(duì)黑木耳菌絲的生長(zhǎng)提供了一定的營(yíng)養(yǎng)，對(duì)其耐堿性也有一定的增強(qiáng)作用。

表2 不同pH值下Vc對(duì)木耳菌絲生長(zhǎng)狀況的影響

圖2 不同pH值下Vc對(duì)木耳菌絲生長(zhǎng)速度的影響

3 討論

A7號(hào)菌株的菌絲在pH值高達(dá)10時(shí)能健壯、旺盛地生長(zhǎng)；在pH值為11時(shí)也能微弱生長(zhǎng)，這是其他幾個(gè)菌株所不及的，故篩選出8808號(hào)為該試驗(yàn)的目標(biāo)菌株。

在黑木耳的栽培生產(chǎn)過(guò)程中，有許多雜菌是酸適應(yīng)性的，如木霉菌、青霉菌等[7-12]。故耐高pH值的菌株的篩選有利于抵抗這些酸性雜菌的作用，將危害降至最低水平。但由于條件限制，未能篩選更多的耐高pH值菌株用于栽培生產(chǎn)，這也是以后在相關(guān)研究中要著重提高和投入的地方。