魯海菊， 董文彥， 沈云玫， 洪 亮， 李 珣

(紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南蒙自 661199)

木霉是重要的內(nèi)生真菌，廣泛分布于蘆薈[1]、蘆竹[2]、銀杏[3]、紅豆杉[4]、板藍(lán)根[5]、枸骨[6]、滇牡丹[7]、香榧[8]等藥用植物中，能定殖于植物的根[5，9-10]、莖(樹(shù)皮)[4，11]、葉[12]，能抑制細(xì)菌[13]、真菌[14]及線蟲(chóng)[15]生長(zhǎng)，對(duì)植物有防病促生作用[16-19]。因此，利用內(nèi)生木霉控制植物病害已成為研究熱點(diǎn)之一。有學(xué)者嘗試用香蕉內(nèi)生木霉防治香蕉枯萎病[20]，茶樹(shù)內(nèi)生木霉防治茶花褐斑病[21]，楊樹(shù)內(nèi)生木霉防治楊樹(shù)潰瘍病[22]，枇杷內(nèi)生木霉防治枇杷根腐病，均已取得階段性成果。木霉菌劑施入土壤，對(duì)植物根際土壤真菌群落影響較小[23-24]。木霉在土壤中定殖是其防病促生的前提條件，然而，它在土壤中的定殖能力，通常會(huì)受到土壤農(nóng)藥殘留因素的限制。因此，篩選抗化學(xué)農(nóng)藥的木霉菌株尤為重要。鑒于此，本研究從具有抗枇杷根腐病病菌活性的枇杷內(nèi)生木霉中，篩選到1株抗撲海因的菌株P(guān)J3，其原始菌株J3對(duì)枇杷根腐病、萬(wàn)壽菊葉斑病、石榴枯萎病和石榴干腐病等病原菌均具有極強(qiáng)的抑菌作用。經(jīng)測(cè)定菌株P(guān)J3的抑菌活性未衰退，為明晰此菌株的其他性狀是否衰退，有必要明確其與原始菌株J3的生物學(xué)特性差異。本研究測(cè)定不同培養(yǎng)基、碳源、氮源、pH值、溫度和光照對(duì)菌株P(guān)J3、J3菌絲生長(zhǎng)及其產(chǎn)孢的影響，為其工業(yè)發(fā)酵提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 木霉菌株J3，采用常規(guī)組織分離法[24]從枇杷主干韌皮部中分離純化獲得，PJ3是在含撲海因藥劑(100 mg/L)的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的J3抗藥性菌株。將菌株置于斜面培養(yǎng)基低溫(4 ℃)保存，現(xiàn)保存于云南省紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院植物病理教學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：20%馬鈴薯浸汁，2%葡萄糖，瓊脂18 g，水1 000 mL；胡蘿卜葡萄糖瓊脂(CDA)培養(yǎng)基：20%胡蘿卜浸汁，2%葡萄糖，瓊脂18 g，水1 000 mL；香蕉葡萄糖瓊脂(BDA)培養(yǎng)基：20%香蕉浸汁，2%葡萄糖，瓊脂18 g，水 1 000 mL；查氏(CM)培養(yǎng)基：蔗糖30.00 g、NaNO32.00 g、K2HPO41.00 g、KCl 0.50 g、MgSO4·7H2O 0.50 g、水 1 000 mL。

1.1.3 試劑 碳源：可溶性淀粉、α-乳糖、麥芽糖、葡萄糖、D-果糖、蔗糖、鼠李糖、甜醇、D-甘露醇；氮源：硫酸銨、硝酸銨、磷酸二氫銨、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、甘氨酸、尿素；鹽酸、氫氧化鈉和撲海因。

上述材料均購(gòu)自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)及試劑公司，試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)及其產(chǎn)孢的影響 將菌株J3、PJ3接種到已滅菌的PDA培養(yǎng)基中央，28 ℃擴(kuò)大培養(yǎng) 7 d。在培養(yǎng)基同一半徑周?chē)么蚩灼?，取直徑? mm的菌塊，同時(shí)接種于PDA、CDA、BDA、CM 4種培養(yǎng)基平板中央，3次重復(fù)，在28 ℃下恒溫培養(yǎng)7 d，采用十字交叉法測(cè)定菌落直徑，采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)產(chǎn)孢量。

1.2.2 不同碳源、氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)及其產(chǎn)孢的影響 以CM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用相等質(zhì)量分?jǐn)?shù)的碳(可溶性淀粉、α-乳糖、麥芽糖、葡萄糖、D-果糖、蔗糖、鼠李糖、甜醇、D-甘露醇)和氮(硫酸銨、硝酸銨、磷酸二氫銨、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、甘氨酸、尿素)替換蔗糖和硝酸鈉，以不加碳、氮為對(duì)照。每個(gè)處理3次重復(fù)，接種及測(cè)量方法同“1.2.1”節(jié)。

1.2.3 不同pH值對(duì)菌絲生長(zhǎng)及其產(chǎn)孢的影響 以PDA為供試培養(yǎng)基，分別用0.1%鹽酸及0.1%氫氧化鈉溶液將pH值調(diào)至3、4、5、6、7、8、9、10之后倒平板，每個(gè)處理重復(fù)3次。接種及測(cè)量方法同“1.2.1”節(jié)。

1.2.4 不同溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)及其產(chǎn)孢的影響 以PDA為供試培養(yǎng)基，接種后分別在10、15、20、25、28、30、35、40 ℃下恒溫培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)3次，接種及測(cè)量方法同“1.2.1”節(jié)。

1.2.5 光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)及其產(chǎn)孢的影響 以PDA為供試培養(yǎng)基，接種后分別在光暗交替(12 h光照12 h黑暗)、全黑暗和全光照3種光處理下培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)3次。接種及測(cè)量方法同“1.2.1”節(jié)。

以上所有配制好的培養(yǎng)基用高壓蒸汽滅菌鍋在121 ℃條件下滅菌25 min。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件Duncan’s多重比較法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)參試菌株菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響

由表1可知，參試菌株在供試的4種培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)，在PDA、CDA和BDA 3種培養(yǎng)基中參試菌株菌落直徑差異不顯著，CM培養(yǎng)基中參試菌株菌落直徑與其余3種培養(yǎng)基差異極顯著，菌落直徑最小。原始菌株J3在4種培養(yǎng)基中均能產(chǎn)孢，但在4種培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢量差異極顯著，其中在CDA培養(yǎng)基中產(chǎn)孢量最大，為2.59×108個(gè)/mL，CM培養(yǎng)基中產(chǎn)孢量最小，為0.12×108個(gè)/mL，相差近200倍?？箵浜Ｒ蚓關(guān)J3在4種培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢量差異極顯著，其中在BDA培養(yǎng)基中產(chǎn)孢量最大，為2.70×108個(gè)/mL，CM培養(yǎng)基中產(chǎn)孢量最小，為 0.19×108個(gè)/mL。說(shuō)明抗撲海因菌株P(guān)J3與原始菌株J3相比，在產(chǎn)孢能力方面，對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求有所改變，CDA培養(yǎng)基最適合原始菌株J3產(chǎn)孢，BDA培養(yǎng)基最適合抗撲海因菌株P(guān)J3產(chǎn)孢，在PDA培養(yǎng)基中，抗撲海因菌株P(guān)J3比原始菌株J3產(chǎn)孢能力增強(qiáng)近1倍。

表1 不同培養(yǎng)基對(duì)參試菌株菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響

注：不同小寫(xiě)字母表示在0.05水平上差異顯著；不同大寫(xiě)字母表示在0.01水平上差異顯著。下表同。

2.2 不同碳源對(duì)參試菌株菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響

由表2可知，原始菌株J3在供試的9種碳源培養(yǎng)基中菌落直徑均大于對(duì)照，且均與對(duì)照差異極顯著。其中，以D-果糖為碳源時(shí)菌落直徑最大，為88.0 mm，以甜醇為碳源時(shí)菌落直徑最小，為45.0 mm；抗藥菌株P(guān)J3在可溶性淀粉、α-乳糖、麥芽糖和葡萄糖4種碳源培養(yǎng)基及甜醇和鼠李糖2種碳源培養(yǎng)基中，兩兩菌落直徑差異不顯著，與其余碳源培養(yǎng)基差異極顯著，其中在可溶性淀粉、α-乳糖、麥芽糖和葡萄糖4種碳源培養(yǎng)基中菌落直徑最大，為88.0 mm，在以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基中菌落直徑最小，為79.0 mm。原始菌株J3的產(chǎn)孢量在以蔗糖和D-甘露醇為碳源的培養(yǎng)基中差異不顯著，其余碳源培養(yǎng)基之間差異極顯著，其中，以D-果糖為碳源時(shí)產(chǎn)孢量最大，為6.50×107個(gè)/mL，以可溶性淀粉為碳源時(shí)產(chǎn)孢量最小，為0.98×107個(gè)/mL；抗藥菌株P(guān)J3在9種碳源中產(chǎn)孢量均差異極顯著，其中在以D-果糖為碳源對(duì)產(chǎn)孢量最大，為3.65×107個(gè)/mL，以甜醇為碳源時(shí)產(chǎn)孢量最少，為 0.11×107個(gè)/mL。整體而言，抗撲海因菌株P(guān)J3與原始菌株J3相比在不同碳源培養(yǎng)基中的菌絲生長(zhǎng)能力增強(qiáng)，產(chǎn)孢能力略有下降。

2.3 不同氮源對(duì)參試菌株菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響

由表3可知，參試菌株在供試的8種氮源培養(yǎng)基中，菌落直徑與對(duì)照均差異極顯著。其中，原始菌株J3在以酵母膏為氮源時(shí)菌落直徑最大，為88.0 mm，在以尿素為氮源時(shí)菌落直徑最小，為18.8 mm?？箵浜Ｒ蚓關(guān)J3菌落直徑在除尿素和無(wú)氮對(duì)照外的其余7種氮源培養(yǎng)基中， 菌落直徑差異不顯著，其中在牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、硝酸銨、硫酸銨、磷酸二氫銨和甘氨酸7種氮源培養(yǎng)基中，菌落直徑最大，均為88.0 mm，在以尿素為氮源的培養(yǎng)基中菌落直徑最小，為 22.0 mm。原始菌株J3和抗撲海因菌株P(guān)J3在8種氮源培養(yǎng)基中均能產(chǎn)孢，其中在以酵母膏為氮源的培養(yǎng)基中產(chǎn)孢量最大，分別為3.00×108、2.63×108個(gè)/mL，在以尿素為氮源的培養(yǎng)基中產(chǎn)孢量最小，分別為0.02×108、0.01×108個(gè)/mL。說(shuō)明酵母膏為最適合J3、PJ3菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的氮源。

表2 不同碳源對(duì)參試菌株菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響

表3 不同氮源對(duì)參試菌株菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響

2.4 不同pH值對(duì)參試菌株菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響

由表4可知，原始菌株J3在pH值為3～9的培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)并產(chǎn)孢，且菌落直徑及產(chǎn)孢量間差異極顯著。其中pH值為8時(shí)，菌落直徑及產(chǎn)孢量均最大，分別為88.0 mm、8.88×108個(gè)/mL。pH值為10時(shí)不能生長(zhǎng)及產(chǎn)孢?？箵浜Ｒ蚓關(guān)J3在培養(yǎng)基pH值為3～10時(shí)，菌落直徑差異不顯著，均為88.0 mm。在8個(gè)pH值梯度培養(yǎng)基中均能產(chǎn)孢，且產(chǎn)孢量間差異極顯著，其中pH值為10時(shí)產(chǎn)孢量最大，為19.38×108個(gè)/mL，pH值為7時(shí)產(chǎn)孢量最小，為4.00×108個(gè)/mL。說(shuō)明抗撲海因菌株P(guān)J3的生長(zhǎng)及產(chǎn)孢性能對(duì)pH值適應(yīng)性更強(qiáng)。

2.5 不同溫度對(duì)參試菌株菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響

由表5可知，參試菌株在15～30 ℃范圍內(nèi)菌絲均能生長(zhǎng)，且菌落直徑差異不顯著，均為88.0 mm。原始菌株J3在25～30 ℃范圍內(nèi)能產(chǎn)孢，且產(chǎn)孢量之間差異極顯著，其中 28 ℃ 時(shí)產(chǎn)孢量最大，為25.75×107個(gè)/mL，30 ℃時(shí)產(chǎn)孢量最小， 為 0.35×107個(gè)/mL， 其余溫度均不能產(chǎn)孢?？箵浜Ｒ蚓關(guān)J3在20～30 ℃范圍內(nèi)均能產(chǎn)孢，且產(chǎn)孢量之間差異極顯著，其中28 ℃時(shí)產(chǎn)孢量最大，為62.50×107個(gè)/mL，20 ℃ 時(shí)產(chǎn)孢量最小，為0.85×107個(gè)/mL，其余溫度均不能產(chǎn)孢?？箵浜Ｒ蚓關(guān)J3與原始菌株J3相比，產(chǎn)孢量明顯增強(qiáng)。

表4 pH值對(duì)參試菌株菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響

表5 溫度對(duì)參試菌株菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響

2.6 不同光處理對(duì)參試菌株菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響

由表6可知，在光暗交替(12 h光照12 h黑暗)、全黑暗和全光照3種光處理下，參試菌株菌落直徑差異不顯著，均為 88.0 mm。菌株P(guān)J3在全黑暗處理時(shí)不產(chǎn)孢，其余2種處理均能產(chǎn)孢，且產(chǎn)孢量差異極顯著，其中光暗交替處理產(chǎn)孢量最大，為 4.75×108個(gè)/mL。原始菌株J3在3種光處理下，均能產(chǎn)孢，且產(chǎn)孢量間差異極顯著，其中光暗交替處理產(chǎn)孢量最大，為2.56×108個(gè)/mL，全黑暗處理產(chǎn)孢量最小，為 0.13×108個(gè)/mL。另外，在光暗交替下，抗撲海因菌株P(guān)J3比原始菌株J3產(chǎn)孢量增強(qiáng)近1倍。

表6 光對(duì)參試菌株菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響

3 結(jié)論與討論

本研究篩選獲得抗撲海因的枇杷內(nèi)生木霉菌株P(guān)J3，其菌絲生長(zhǎng)的適合條件為PDA、CDA或BDA培養(yǎng)基，適合碳源為可溶性淀粉、α-乳糖、麥芽糖或葡萄糖，適合氮源為牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、硝酸銨、硫酸銨、磷酸二氫銨或甘氨酸，適宜pH值為3～10，溫度為15～30 ℃，光照條件為光暗交替、全黑暗或全光照。原始菌株J3菌絲生長(zhǎng)適合條件為PDA、CDA或BDA培養(yǎng)基，適合碳源為D-果糖，適合氮源為酵母膏，最適pH值為8，適合溫度為15～30 ℃，適合的光照條件為光暗交替、全黑暗或全光照。前者產(chǎn)孢最佳條件為BDA培養(yǎng)基、碳源為D-果糖、氮源為酵母膏、pH值為10、溫度 28 ℃、光照條件為光暗交替；后者為CDA培養(yǎng)基、碳源為D-果糖、氮源為酵母膏，pH值為8，溫度28 ℃、光照條件為光暗交替。由此可見(jiàn)，抗撲海因內(nèi)生木霉菌株P(guān)J3菌絲生長(zhǎng)適應(yīng)性比原始菌株J3范圍廣。二者適應(yīng)的培養(yǎng)基和pH值不同，菌株P(guān)J3為BDA培養(yǎng)基和pH值為10，菌株J3為CDA培養(yǎng)基和pH值為8，其余參數(shù)均相同。產(chǎn)孢數(shù)量方面，除了不同碳、氮源之外，在其余參數(shù)中，抗撲海因菌株P(guān)J3整體強(qiáng)于原始菌株J3。段銀芝等研究發(fā)現(xiàn)，吡蟲(chóng)啉、咪唑乙煙酸和咪唑煙酸3種農(nóng)藥能促進(jìn)哈茨木霉菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢[25]。前人曾篩選獲得耐多菌靈[26]、速克靈[27-28]，能降解敵敵畏[29]、毒死蜱和甲胺磷[30]等的木霉菌株，但尚未見(jiàn)抗藥性菌株其他生物學(xué)特性是否衰退的報(bào)道。本研究表明，與原始菌株J3相比，抗撲海因枇杷內(nèi)生木霉菌株P(guān)J3產(chǎn)孢能力增強(qiáng)，且其他生物學(xué)特性未衰退。田連生等報(bào)道，木霉菌劑與多菌靈混配防治灰霉病有協(xié)同增效作用[31]。任鳳山等發(fā)現(xiàn)，木霉與幾種殺菌劑混配能增強(qiáng)對(duì)蘋(píng)果輪紋病的防治效果[32]。此抗藥性菌株P(guān)J3可與撲海因混配使用，可以減少化學(xué)農(nóng)藥用量，保護(hù)農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境，具有廣闊的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。