陳學(xué)進(jìn) 郭衛(wèi)麗 姜立娜 李新崢 周俊國(guó)

摘要：DNA提取是基因克隆、PCR擴(kuò)增、分子雜交以及遺傳多態(tài)性分析等實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。Whatman FTA卡已廣泛應(yīng)用于DNA的保存和提取，具有簡(jiǎn)便和高效的特點(diǎn)。采用煮沸法和FTA法分別提取南瓜（Cucurbita nwschata Duch.）根、莖、葉DNA，以常規(guī)CTAB法為對(duì)照，以期尋找一種簡(jiǎn)便快捷的DNA提取方法。結(jié)果表明，CTAB法適用于南瓜各組織部位的DNA提取，DNA質(zhì)量最高，PCR擴(kuò)增的條帶清晰，亮度高，但實(shí)驗(yàn)操作也最復(fù)雜;用煮沸法從葉片中提取的DNA質(zhì)量相對(duì)較好，從根和莖提取的DNA不宜用于PCR反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)操作相對(duì)簡(jiǎn)單;FTA法提取的DNA質(zhì)量較好，PCR擴(kuò)增的條帶清晰，亮度較高，實(shí)驗(yàn)操作最簡(jiǎn)單，是一種最佳的DNA簡(jiǎn)化提取方法。

關(guān)鍵詞：南瓜;DNA;CTAB;煮沸法;FTA法

南瓜（Cucurbita moschata Duch.）是葫蘆科南瓜屬一年生蔬菜，在世界范圍內(nèi)廣泛栽培和食用[1]。南瓜果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，含有糖類、維生素、多種氨基酸和礦物質(zhì)等，南瓜還富含保健活性物質(zhì)，具有抗氧化功效，南瓜多糖具有降血糖的作用[2-4]。南瓜還可作為其他瓜類蔬菜的砧木，提高嫁接苗的抗逆性及產(chǎn)量[5-6]。

南瓜DNA的提取是南瓜基因克隆，PCR擴(kuò)增、分子雜交以及遺傳多態(tài)性分析等分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。植物DNA提取的方法較多，如CTAB法、SDS法、試劑盒提取等[7]，文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于DNA的提取多為改進(jìn)或提高DNA質(zhì)量的方法[8]，鮮有DNA提取方法的簡(jiǎn)化。其中CTAB法是最常用的經(jīng)典方法。作為一種陽(yáng)離子去污劑，CTAB可溶解細(xì)胞膜，能與核酸形成復(fù)合物，該復(fù)合物在高鹽濃度下可溶解，在低鹽濃度下會(huì)因溶解度降低而沉淀，通過(guò)離心可將CTAB- 核酸復(fù)合物同蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)分開(kāi)，然后用高鹽溶液溶解CTAB- 核酸復(fù)合物，再用乙醇沉淀DNA而除去CTAB。該法需要經(jīng)過(guò)預(yù)熱、研磨、保溫、2次離心等步驟，時(shí)間長(zhǎng)、過(guò)程復(fù)雜，需要配置多種試劑，但提取的DNA質(zhì)量較好。煮沸法提取DNA是在加入TE緩沖液之后，植物組織經(jīng)過(guò)一冷一熱極端的溫度差，然后經(jīng)過(guò)離心獲得DNA，操作過(guò)程進(jìn)行了簡(jiǎn)化，但提取的DNA質(zhì)量不及CTAB法[9]。FTA法是將植物材料DNA保存在Whatman FTA卡（Flinders Technology Associates，簡(jiǎn)稱FTA卡）上，經(jīng)過(guò)FTA洗脫液洗脫、高溫處理，F(xiàn)TA卡上的DNA釋放到TE-1緩沖溶液中，進(jìn)而獲得DNA的一種方法[10-11]。FTA卡已廣泛應(yīng)用于動(dòng)物、植物、微生物及噬菌體DNA的提取，F(xiàn)TA卡上的DNA可以長(zhǎng)期保存，節(jié)省DNA存儲(chǔ)空間，可隨時(shí)用于DNA提取，方便快捷[12-14]，但提取的DNA質(zhì)量一般。實(shí)踐證明，在滿足實(shí)驗(yàn)要求的前提下，簡(jiǎn)化DNA提取可大幅提高實(shí)驗(yàn)效率。

筆者以河南科技學(xué)院南瓜創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)培育的南瓜品種‘百蜜一號(hào)為試材[15]，采用煮沸法和FTA法分別對(duì)南瓜根、莖和葉進(jìn)行DNA提取，以常規(guī)CTAB法為對(duì)照，以期尋找一種簡(jiǎn)便快捷的DNA提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料

南瓜品種為‘百蜜一號(hào)，是由河南科技學(xué)院南瓜創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)培育的雜交品種。

1.2 方法

CTAB法：1.5 mL離心管中加入0.4 mL CTAB提取緩沖液，65℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱，取適量新鮮材料研磨成粉。轉(zhuǎn)至提取緩沖液中，保溫30min，期間輕柔攪動(dòng)，加入等體積的氯仿/異戊醇（24：1），旋渦震蕩，靜置10min后10000r·min^-1離心10min。取上清液，加入2/3體積的異丙醇，混勻，室溫放置15min后10000r·min^-1離心10min，去上清液，用70%（φ）乙醇沖洗2次，風(fēng)干。用50μL TE緩沖液溶解DNA，取1μL用Nanodrop 2000進(jìn)行DNA質(zhì)量和濃度的檢測(cè)。

煮沸法：取適量新鮮材料在研缽中研磨粉碎，加入0.4mL TE緩沖液，倒入離心管中;沸水中煮1～10min，之后立刻冰浴10min。最后在室溫13000r·min^-1離心5min;取上清液作為DNA樣品[9]。取1μL用Nanodrop 2000進(jìn)行DNA質(zhì)量和濃度的檢測(cè)。

FTA法：Whatman FTA卡購(gòu)于上海仁邦醫(yī)藥科技有限公司。將適量南瓜組織放在FTA卡上，墊上封口膜，用力按壓使汁液被FTA卡吸收，室溫晾干。用打孔器在FTA卡上有組織印記的區(qū)域打孔，將得到的圓形紙餅放入離心管，加入50μL的FTA溶液浸泡5min，吸出;加入200 I-LL的TE-1溶液浸泡1min，吸出：再加入200μL的TE-1溶液浸泡1min，吸出;加入50μL TE緩沖液，將離心管蓋好，放入干式恒溫器中，95℃加熱巧min，取出后室溫冷卻。取1μL用Nanodrop 2000進(jìn)行DNA質(zhì)量和濃度的檢測(cè)。

以上述3種方法提取的DNA樣品為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)及電泳檢測(cè)。PCR引物來(lái)自于國(guó)際葫蘆科基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//cucurbitgenomics.org/）美洲南瓜（Cucurbita pepo L.） SSR分子標(biāo)記數(shù)據(jù)庫(kù)，正向引物序列：5-GGAAGAAGAGAGGTTGTGCG-3'，反向引物序列：5-CGTTTTCTGTGGC-CATTTCT-3，PCR反應(yīng)體系總體積20μL，其中模板1μL，10×緩沖液2μL， dNTP1.6μL，正向及反向引物各0.3μL，Taq DNA聚合酶0.1μL， dd Hz014.7μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃2min，94℃20s，58℃30s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)：每個(gè)樣品加入2μL溴酚藍(lán)上樣緩沖液，用1xTAE緩沖液配置1%（ω）的瓊脂糖凝膠，加入適量Goldview核酸染料，120V條件下電泳30min后采用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA質(zhì)量及濃度檢測(cè)

為簡(jiǎn)化試驗(yàn)操作，3種提取方法均未準(zhǔn)確稱取樣品，根據(jù)表1的試驗(yàn)結(jié)果，3種提取方法、從不同組織得到的DNA濃度各不相同，也說(shuō)明了這一點(diǎn)，但是表1中濃度均基本滿足一般生物技術(shù)的實(shí)驗(yàn)操作所需濃度，說(shuō)明本試驗(yàn)中DNA提取不需要準(zhǔn)確稱取樣品，取樣適量即可。

比較3種提取方法，CTAB法獲得的DNA質(zhì)量最高，如表1所示，OD₂₆₀/OD₂₈₀均在2.0左右，說(shuō)明樣品 DNA中蛋自含量較低;OD₂₆₀/OD₂₃₀均高于1.9，說(shuō)明樣品DNA中小分子雜質(zhì)較少，從不同的南瓜組織（根、莖、葉）提取的DNA質(zhì)量差異不明顯，說(shuō)明這些組織均可用CTAB法提取DNA。煮沸法和FTA法得到的DNA質(zhì)量總體不高，尤其是以根和莖為提取組織時(shí)，但從葉片提取的DNA質(zhì)量OD₂₆₀/OD₂₈₀均在1.8左右，OD₂₆₀/OD₂₃₀也在1.8左右，基本可以滿足一般生物技術(shù)的實(shí)驗(yàn)需求。

2.2 PCR檢測(cè)

為了檢測(cè)提取的DNA樣品能否用于PCR反應(yīng)，將上述3種方法提取的根、莖、葉組織DNA分別進(jìn)行PCR反應(yīng)。結(jié)果表明，CTAB法提取的DNA作為PCR反應(yīng)的模板擴(kuò)增得到的條帶清晰，亮度較高，效果最佳;煮沸法提取的DNA經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后，條帶隱約可見(jiàn)，亮度低，只有葉片組織的條帶亮度稍微高一些。FTA法提取的DNA作為PCR反應(yīng)的模板，擴(kuò)增得到的條帶清晰，亮度較高，效果較好（圖1）。

3 討論與結(jié)論

為了找到簡(jiǎn)單、快捷、高效且適用南瓜基因組DNA的提取方法，筆者以煮沸法和FTA法分別從南瓜的根、莖、葉進(jìn)行DNA提取，并以常規(guī)CTAB法作為參照。經(jīng)過(guò)比較，CTAB法提取的DNA質(zhì)量最好，但操作程序繁瑣，需要的試劑多，操作時(shí)間長(zhǎng)。煮沸法只需要離心1次，操作過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，時(shí)間短，但得到的DNA質(zhì)量欠佳。FTA法不需要研磨和離心，需要的試劑較少，操作方便，還可根據(jù)需要將材料DNA隨時(shí)保存，與CTAB法相比具有高效、便捷的優(yōu)點(diǎn)，雖然提取的DNA質(zhì)量不及CTAB法，但可滿足一般PCR反應(yīng)。提取樣品量較大時(shí)，F(xiàn)TA法的優(yōu)勢(shì)更加明顯。綜合比較，F(xiàn)TA法操作最簡(jiǎn)單，是提取葉片DNA的最佳方法。

FTA法是Whatman公司的一項(xiàng)專利技術(shù)，主要應(yīng)用于室溫下DNA的采集、存貯及提取，采集的樣品通常是血液、口腔細(xì)胞等[13]，有文獻(xiàn)報(bào)道，擬南芥大規(guī)模批量提取DNA時(shí)采用FTA法更加簡(jiǎn)便快捷，且成本很低[14]，但FTA法在其他植物上的應(yīng)用鮮有報(bào)道。通過(guò)與經(jīng)典的CTAB法和煮沸法比較，筆者為簡(jiǎn)化南瓜DNA提取提供了一條更優(yōu)途徑，是FTA法在南瓜DNA提取上的首次應(yīng)用，也為探索南瓜DNA快捷提取提供了有價(jià)值的參考。

本試驗(yàn)中，筆者以葉片為材料，3種方法提取的DNA均可用于一般的PCR反應(yīng)，但其能否滿足基因克隆等其他生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)要求，還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)

[1]舒迎瀾.主要瓜類蔬菜栽培簡(jiǎn)史[J].中國(guó)農(nóng)史，1998，17（3）：94-99.

[2]李新崢，楊鵬鳴，范文秀，等.南瓜多糖及可溶性固形物含量與口感性狀相關(guān)性分析[J].中國(guó)蔬菜，2009（4）：26-29.

[3]王士苗，康文藝，孫麗，等.25個(gè)南瓜品種不同溶劑提取物抗氧化活性研究[J].食品r一業(yè)科技，2015（7）：118-121.

[4]王士苗，康文藝，周俊國(guó)，等.2個(gè)品種南瓜有機(jī)溶劑提取物和多糖成分降血糖作用研究[J].食品科技，2015，40（4）：263-267.

[5]周俊國(guó)，扈惠靈，趙潤(rùn)洲，等.中國(guó)南瓜F1砧木對(duì)黃瓜嫁接苗生長(zhǎng)的影響[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2010，25（1）：117-120.

[6]周俊國(guó)，扈惠靈.NaCl脅迫對(duì)不同砧木的嫁接黃瓜產(chǎn)量和品質(zhì)的影響[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2010，（4）：851-855.

[7]李會(huì)，任志瑩，王穎，等.不同DNA提取試劑盒提取作物種子基因組DNA效果的比較[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（8）：1956-1958.

[8]徐艷，徐繼法，陳磊，等.小麥TILLING突變體檢測(cè)中基因組DNA提取方法的優(yōu)化[J].麥類作物學(xué)報(bào)，2017，37（2）：185-191.

[9]赫然，黃小樂(lè)，劉秋云，等.快速制備水稻基因組DNAPCR模板的煮沸法[J].植物生理學(xué)通訊，2003，391）：41-42.

[10]徐飛，成述儒，羅玉柱.FTA卜和普通定性濾紙?zhí)崛NA方法研究[J].生物技術(shù)通訊，2011（11）：221-224.

[11]匡金枝，聶同鋼，楊智，等.FTA-DNA直接提取法的研究與應(yīng)M[J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志，2008，23（2）：107-110.

[12]魯巧云，余進(jìn)，劉偉，等.FTA-DNA直接提取法在病原真菌分子鑒定中的應(yīng)用[J].中國(guó)真菌學(xué)雜志，2010，5（3）：137-140.

[13]包鵬甲，胡江，羅玉柱，等.綿羊血液基因組DNA的提取方法研究[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，43（2）：37-40.

[14]李麗，吳凡，周榮明，等一種快速批量提取擬南芥DNA的方法[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2017（3）：1-5.

[15]李新崢，孫麗，王士苗，等.百蜜系列南瓜品種性狀調(diào)查與分析[.1].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2014（1）：16-20.