李 強,李俊潔,吳楊雪,張宜輝,黃曉磊?

(1.閩臺作物有害生物生態(tài)防控國家重點實驗室，福建農(nóng)林大學植物保護學院，福建福州350002；2.廈門大學環(huán)境與生態(tài)學院，福建廈門361102)

互花米草(Spartina alterniflora)起源于美洲大西洋海岸,為多年生草本植物,隸屬于禾本科Poaceae米草屬Spartina?；セ撞萸o稈粗壯,地下根系發(fā)達,具有很強的生產(chǎn)力、繁殖力以及抗鹽堿等生物學特性。二十世紀七十年代,美國本土的互花米草被廣泛應(yīng)用于沿海地區(qū)固沙促淤、減浪護堤、重建灘涂鹽沼生態(tài)系統(tǒng)(Knutson et al.,1982；方民杰,2012；欽佩等,2012；楊東等,2014)。1979年,我國分別從美國北卡羅來納州、佐治亞州和佛羅里達州引進了三種不同生態(tài)型的互花米草。雖然引種前期產(chǎn)生了一定的經(jīng)濟和生態(tài)效益,但由于互花米草的快速擴張,嚴重危害了沿海地區(qū)鹽沼生態(tài)系統(tǒng),因此2003年被中國環(huán)境保護部列為入侵物種(王卿等,2006)。

目前已知僅少數(shù)蚜蟲物種可寄生米草屬植物,包括：Anoecia corni取食S.cynosuroides,Sipha littoralis取食S.maritima及S.townsendii,Prociphilus erigeronensis取食S.patens(Blackman et al.,2018)。但互花米草上尚無蚜蟲紀錄,不管是在其原產(chǎn)地美國(Gary Miller,USDA,personal communication),還是在其入侵地區(qū)。然而在近期調(diào)查中,我們于廈門大學翔安校區(qū)的互花米草培育溫室中發(fā)現(xiàn)大量取食該植物的蚜蟲,經(jīng)形態(tài)鑒定確定為一條蚜Hysteroneura setariae。

一條蚜隸屬于半翅目(Hemiptera)蚜科(Aphididae)蚜族(Aphidini),被認為起源于北美洲,并在北美溫帶地區(qū)周期性孤雌生殖,一般在歐洲李(Prunus domestica)完成有性世代。1940年,北非地區(qū)也發(fā)現(xiàn)了該蚜蟲的存在。1976年,澳大利亞李屬植物P.persica上發(fā)現(xiàn)了一條蚜的性蚜和卵,但其是否在澳大利亞進行全周期生活尚未可知(Carver,1976)。一條蚜在1960年代中后期經(jīng)歷了一個快速擴散的過程,其無性生殖世代已經(jīng)廣泛的分布在世界范圍內(nèi)較為溫暖的地區(qū),包括印度、澳大利亞、南非、東南亞等地區(qū)(Blackman et al.,2018)。一條蚜主要取食禾本科植物,如水稻、甘蔗和玉米等,一般在穗的基部聚集為害,有時還會取食葉片以及未成熟的種子,造成谷物表面壞死斑點甚至空殼(Akibobetts et al.,1978；Noordam,2004)。Jahn等人(2005)曾報道在大豆(soybean)上發(fā)現(xiàn)一條蚜。另外在一些莎草科(Cyperaceae)以及油棕和椰子的幼苗上也偶見發(fā)生(Stoetzel et al.,2001；Blackman et al.,2018)。一條蚜還是重要的植物病毒攜帶者,比如南瓜花葉病毒(WMV)(Coudriet,1962)、甘蔗花葉病毒(SCMV)(Harborne,1988)以及大豆花葉病毒(SMV)(Quimio et al.,1993；Wijerathna et al.,1995)等,給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成重大損失。

本研究在對華南地區(qū)不同寄主植物上的一條蚜廣泛采樣的基礎(chǔ)上,基于DNA條形碼技術(shù)和分子系統(tǒng)發(fā)育分析,期望對互花米草上的一條蚜種群開展進一步的分子鑒定,并探究互花米草上一條蚜種群的來源。通過整合中國華南、印度、巴基斯坦、美國等地區(qū)一條蚜樣品的序列數(shù)據(jù),探討不同地區(qū)或寄主植物一條蚜種群的遺傳分化格局。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2015-2018年,對中國華南地區(qū)(福建、廣東、云南、海南、廣西)進行了廣泛的野外采樣,每號樣品保證為同一寄主同一生態(tài)位上的單克隆。采集到的樣品均放入裝有95%酒精的凍存管并置于-20℃環(huán)境中保存。共有62號一條蚜樣品用來進行分子生物學試驗以及系統(tǒng)發(fā)育分析,其中HL_20160302_Y1為采自互花米草上的樣品。詳細的樣品編號、GenBank登錄號、單倍型信息、寄主以及地理信息見表1,憑證標本均放置于福建農(nóng)林大學植物保護學院。

1.2 DNA提取、PCR和測序

本研究使用DNeasy Blood＆Tissue Kit(QIAGEN,GERMANY)試劑盒來提取單個蚜蟲的基因組DNA。選用的分子標記為線粒體細胞色素氧化酶I亞基(cytochrome oxidase subunit I,COI),并由 COI的通用引物 LepF(5′-ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG-3′) 和 LepR(5′-TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3′)(Foottit et al.,2008)進行目標片段的擴增。PCR擴增體系為：20 μL ddH2O,3 μL 10×buffer,2.4 μL dNTP,0.6 μL 前后引物 (10 μmol·L-1),0.4 μL Taq DNA聚合酶 (5 U·μL-1)and 3 μL DNA模板。反應(yīng)條件為：95℃預變性5 min；94℃變性20 s,50℃退火30 s,72℃延伸2 min,共35個循環(huán)；最后,72℃的終延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,目的條帶清晰的樣品寄送到上海生工生物有限公司進行雙向測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用BioEdit軟件(Hall,1999)對所獲得的序列進行匯總,依據(jù)每號樣品的峰圖對其雙向序列進行校正。另外從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載了15條一條蚜的COI序列(表1)。將整合自測序列以及GenBank數(shù)據(jù)庫下載的序列,進行下一步的系統(tǒng)發(fā)育分析。用MAFFT(Katoh et al.,2013)對序列進行對齊,并用BioEdit將序列切成相同的長度。準備好的序列文件使用MEGA 7.0(Kumar et al.,2016)基于Kimura 2-parameter(K2P)(Kimura,1980)模型計算遺傳距離并分析序列的堿基的組成以及位點的變異情況?；贏kaike Information Criterion(AIC)使用jModelTest 2.1.7(Darriba et al.,2012)計算最佳核苷酸替換模型。選擇同為蚜族的棉蚜Aphis gossypii和竹色蚜Melanaphis bambusae作為外群,使用MEGA 7.0、RaxML以及MrBayes 3.2.6等軟件,使用鄰接法(Neighbor-joining,NJ)、最大似然法(Maximum likelihood,ML)和貝葉斯法(Bayesian inference,BI)分別對一條蚜的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。另外對獲得的COI序列進行單倍型網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,以探究一條蚜不同地理種群之間的種群遺傳結(jié)構(gòu)。首先將COI序列導入到DNAsp v5(Librado et al.,2009)來分析單倍型的組成,之后用NETWORK 5.0.0.3(Bandelt et al.,1999)來構(gòu)建Median-joining單倍型網(wǎng)絡(luò)。

表1 樣品的采集信息、單倍型及GenBank登錄號信息1)Table 1 Samples used in this study,with collection information,haplotype number and GenBank accession number

續(xù)表1Table 1(Continued)

續(xù)表1Table 1(Continued)

續(xù)表1Table 1(Continued)

2 結(jié)果與分析

2.1 序列特征

本研究所獲得的62條序列最終統(tǒng)一截齊為560 bp,共包含554個保守位點,6個可變位點以及3個簡約信息位點。序列核苷酸組成呈現(xiàn)很明顯的A+T偏向(T：40.2%,C：14.8%,A：35.7%,G：9.3%)。加上NCBI下載的15條一條蚜序列最終共77條序列,包含546個保守位點,14個可變位點和4個簡約信息位點。序列核苷酸堿基T、C、A、G的占比分別為40.2%、14.8%、35.7%和9.3%,依然呈現(xiàn)非常明顯的A+T偏向。

2.2 遺傳距離及系統(tǒng)發(fā)育分析

基于K2P模型計算的自測樣品序列的遺傳距離范圍為0%-0.7%,平均遺傳距離為0.2%；加上NCBI下載的一條蚜序列后,遺傳距離范圍0%-1.6%,平均遺傳距離0.7%。值得注意的是,序列間最大遺傳距離(1.6%)來自于美國的樣品(表2)。jModelTest軟件所計算的最佳核苷酸替換模型為GTR+I,基于此模型構(gòu)建的BI和ML系統(tǒng)發(fā)育樹以及基于K2P模型計算的NJ樹均顯示相似的拓撲結(jié)構(gòu)(圖1,附圖1、2)。中國、巴基斯坦以及印度的一條蚜樣品在系統(tǒng)發(fā)育樹上很好的聚成一支,但是來自美國的兩號樣品(CNC?HEM028532和 CNC?HEM055851)很明顯的聚成了獨立于其他分支的兩個單獨分支,并且均具有很高的支持率以及后驗概率。在廈門地區(qū)取食互花米草的一條蚜樣品與其他不同地區(qū)、不同寄主的一條蚜聚在同一分枝。

圖1 基于COI序列構(gòu)建的貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹(BI)Figure 1 The BI phylogenetic tree based on COI

表2 一條蚜不同樣品組成的遺傳距離范圍以及平均遺傳距離Table 2 The genetic distances for different sequence sets of Hysteroneura setariae

2.3 單倍型與單倍型網(wǎng)絡(luò)分析

本研究所涉及的77號樣品中,共包含9個COI單倍型(表1)。根據(jù)單倍型網(wǎng)絡(luò)分析可以看出(圖2),H_1包含了 77.9%的樣品(60號),覆蓋了 Guangdong、Yunnan、Fujian、Hainan、Guangxi、Pakistan、India等地。相較于其他單倍型,H_6和H_7呈現(xiàn)了較大的分化,這兩條序列分別代表美國的兩號樣品。

圖2 基于COI序列的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖Figure 2 Haplotype networks based on COI sequences

3 討論

由一條蚜的系統(tǒng)發(fā)育樹以及單倍型組成可以看出,采自廈門溫室中互花米草上的一條蚜與同域分布但取食其他寄主植物(馬唐屬、屬以及芒屬等)的很多一條蚜樣本具有同一單倍型,并位于系統(tǒng)樹的同一分支。考慮到廈門大學翔安校區(qū)溫室中的互花米草均為采自各地的種子種植而來,不存在一條蚜隨植株遠距離擴散的可能,因此取食互花米草的一條蚜應(yīng)該由周邊其他寄主種群擴散而來。

在DNA條形碼研究中,判別為不同物種的遺傳距離閾值在不同類群中有所差別。Weigand等人(2013)在關(guān)于Carychiidae的研究中表明,3.2%可以用來區(qū)分不同的物種。在鱗翅目中,2%常用區(qū)分不同的物種(Hajibabaei et al.,2006)。在蚜蟲相關(guān)研究中,2%也被用來作為區(qū)分種內(nèi)與種間關(guān)系閾值(Foottit et al.,2008；Liu et al.,2013；Zhu et al.,2017)。在本研究中,自測樣品覆蓋了中國華南地區(qū),其樣品之間最大遺傳距離僅0.7%,遠遠低于種間距的閾值。自測樣品與從GenBank下載的巴基斯坦和印度的序列之間遺傳距離也為0.7%,表明中國華南及東南亞地區(qū)分布的一條蚜遺傳分化不大。一條蚜原產(chǎn)地北美洲的序列與其他樣品間遺傳距離非常顯著,最大達到1.6%,暗示一條蚜從原產(chǎn)地北美向世界其他地區(qū)擴散后,在不同的地理區(qū)域已形成一定的遺傳分化。然而,北美種群與亞洲種群明顯的遺傳分化主要由地理因素還是寄主植物因素所導致,尚需要基于更多樣品的深入分析。

目前防控互花米草的主要方法有物理清除、化學農(nóng)藥和生物防治等方法(Hedge et al.,2003)。物理防治主要通過手工拔除、遮陰、刈割等(李艷麗等,2009),有研究表明,圍堤浸泡互花米草使其缺氧而亡也是一種相對有效的防治方法(Aberle,1990),使用物理的方法雖然暫時有效,但是費時費力高成本。而且互花米草的根系比較發(fā)達,使用物理的方法常常達不到根除的效果(李賀鵬等,2007)。化學防治主要是通過施用一些除草劑(草甘膦、咪唑煙酸以及米草敗育靈),施用除草劑會對其周邊生態(tài)系統(tǒng)造成非常大的傷害,并且受季節(jié)和天氣的影響(Norman et al.,1994)。關(guān)于對互花米草的生物防治學術(shù)界持保守態(tài)度。主要是由于互花米草的天敵作用比較復雜,因為有些天敵不僅作用于互花米草,有時還會對非靶標生物造成危害,更有甚者會導致新的生物入侵。一些有益的探索,例如大豐王港用蘆葦替代互花米草的生態(tài)工程(張茜等,2007),以及利用真菌(麥角菌Claviceps purpurea)和植食性昆蟲(飛虱Prokelisia marginata以及蝗蟲Melanoplus sp.等的寄生或取食,暗示生物防控或可作為有效控制互花米草擴散的方法(Johnson et al.,2008；Grevstad et al.,2012)。本研究首次發(fā)現(xiàn)一條蚜取食互花米草的紀錄,將為后期研究互花米草的生物防控提供有效參考。

圖1 基于COI序列構(gòu)建的最大似然法系統(tǒng)發(fā)育樹(ML)
Figure 1 The ML phylogenetic tree based on COI

圖2 基于COI序列構(gòu)建的鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹(NJ)
Figure 2 The NJ phylogenetic tree based on COI