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(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心,北京100097; 2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué),遼寧沈陽110866; 3.喀什大學(xué),新疆喀什 844006; 4.果蔬農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100097;5.農(nóng)業(yè)部蔬菜產(chǎn)后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100097)

哈密瓜(CucumismeloL.)主產(chǎn)于新疆,自2015年以來,種植面積穩(wěn)定在120萬畝左右,總產(chǎn)量為280萬噸左右,其中大約70%銷往內(nèi)地[1]。在銷售過程中,大部分哈密瓜采用常溫平板車運(yùn)輸方式,缺乏預(yù)冷、冷鏈運(yùn)輸系統(tǒng),約有15%的果實(shí)發(fā)生腐爛[2]。引起果實(shí)腐爛主要有兩個原因,一個是哈密瓜在常溫運(yùn)輸過程中,生理代謝加速,從而發(fā)熱引起腐爛[3];另一種是真菌侵害引起的腐爛。目前,生理代謝加速引起的腐爛可以通過果實(shí)預(yù)冷或冷藏車儲運(yùn)的方式減少;真菌引起的腐爛可以通過消毒劑處理的方式減少[4]。但是,引起哈密瓜腐爛真菌的種類還存在一定爭議,部分研究者認(rèn)為青霉屬、毛霉屬、曲霉屬和根霉屬真菌是引起哈密瓜腐敗的主要病原菌[5-7],而其他研究者認(rèn)為鏈格孢屬、鐮孢屬和根霉屬是主要致腐菌[8-10]。而且,上述學(xué)者對哈密瓜上致腐真菌的鑒定主要是通過顯微鏡觀察菌落特征來鑒定的,缺少進(jìn)一步的科學(xué)證據(jù)。因而,引起哈密瓜腐敗的真菌種類有待于進(jìn)一步鑒定。

鑒定真菌種類的方法除了使用顯微鏡觀察菌落特征外,還可以從微生物表型特征和分子學(xué)方面對微生物進(jìn)行鑒定。微生物表型芯片系統(tǒng)(PMs)是利用微生物對95種不同碳源的代謝情況,確定微生物的表型,從而將微生物鑒定至種、亞種水平上[11-13]。分子生物學(xué)方面,采用ITS(Internal transcribed spacer)基因序列可以獲得菌株的遺傳信息,從而確定真菌種類,并為其系統(tǒng)發(fā)育的研究提供重要依據(jù)[14-15]。

因此,本課題組從哈密瓜表面分離出兩種具有致腐作用的真菌,結(jié)合顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察、表型特征和分子學(xué)方法對其進(jìn)行鑒定,以期明確引起哈密瓜腐爛的主要菌種,為減少哈密瓜采后腐敗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

哈密瓜和土豆 北京市果香四溢蔬菜超市(曙光花園店);葡萄糖(分析純) 北京化工廠;瓊脂 北京輝宏德業(yè)生物科技有限公司;FF-IF接種液(FF板) 美國Biolog公司;TaKaRa Fungi Identification PCR Kit(Code No.RR178)、TaKaRa Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR(Code No.9164) 寶生物工程(大連)有限公司。

Incucell系列恒溫恒濕培養(yǎng)箱 德國MMM集團(tuán);G154DW型高壓滅菌鍋 美國致微公司;DL-CJ-2N雙人雙面超凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;Gen III Microstation 美國Biolog公司;TaKaRa Thermal Cycler Dice TP600 PCR擴(kuò)增儀 TaKaRa BIO INC.;Mupid核酸電泳儀 ADVANCE-BIO Co.,Ltd;EPS300 蛋白質(zhì)電泳儀 上海天能;ImageMaster?VDS電泳成像裝置 Pharmacia Biotech公司;ABI PRISMTM3730XL DNA測序儀 美國Applied Biosystem公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 微生物純化及其形態(tài)觀察 PDA培養(yǎng)基:稱取馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂18 g,加水補(bǔ)足1 L,121 ℃滅菌15 min。將哈密瓜置于25～30 ℃環(huán)境中,待哈密瓜表面出現(xiàn)由微生物引起的軟化腐爛現(xiàn)象時,將微生物利用無菌接種環(huán)在PDA培養(yǎng)基上劃線分離培養(yǎng)7 d,然后將不同菌落的微生物挑出劃線培養(yǎng)至新的PDA培養(yǎng)基上,直至純化為單一菌落。將單一菌落的微生物置于PDA培養(yǎng)基上于28 ℃培養(yǎng)7 d,用顯微鏡觀察菌落形態(tài)和顏色,物鏡40倍,目鏡10倍,拍照。

1.2.2 表型特征分析 將分離的菌株在PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)7 d,用一次性無菌接種棉簽將真菌孢子接種至FF-IF接種液中,使用濁度計調(diào)整菌懸液的菌體濃度至濁度為75%±2%,將配好的菌懸液用移液槍接種至FF板上,每孔100 μL。置于25 ℃培養(yǎng),在24、48、72和96 h分別用Biolog微生物鑒定系統(tǒng)在490和750 nm下記錄吸光值,獲得致腐菌對95種碳源的消耗情況以及生長情況。

1.2.3 ITS基因測序、比對以及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 在培養(yǎng)基中挑取菌體于50 μL TaKaRa Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR(Code No.9164)中變性后離心取上清作為模板。反應(yīng)條件:80 ℃,15 min。使用TaKaRa Fungi Identification PCR Kit(Code No.RR178)試劑盒對分離的菌株ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR 反應(yīng)體系中含上述變性反應(yīng)液1 μL;PCR premix 25 μL;引物(20 pmol/L)各0.5 μL;無菌超純水補(bǔ)足總體積至50 μL。ITS區(qū)擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸l min,30個循環(huán),72 ℃ 延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR 產(chǎn)物加1 μL 6倍溴酚藍(lán)上樣緩沖液,在3%瓊脂糖凝膠上200 mA 電泳15 min 進(jìn)行檢測,EB染色后于紫外燈下觀察電泳條帶,切膠回收目的片段進(jìn)行測序,使用ABI PRISMTM 3730XL DNA Sequencer測序儀進(jìn)行測序。

測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列搜索,比較純化菌株與已知霉菌相應(yīng)序列的同源性。為進(jìn)一步顯示實(shí)驗(yàn)菌株與已知菌株的親緣關(guān)系及其分類地位,根據(jù)同源序列搜索結(jié)果與表型鑒定分析得到的幾種相似度最高的菌種進(jìn)行對比,提取相關(guān)模式菌株的ITS區(qū)基因序列,用MEGA7.0軟件選用參數(shù)P-距離和成對刪除法,將序列資料轉(zhuǎn)換成距離后以鄰位歸并法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,并通過Bootstraps進(jìn)行1000次漸啟式復(fù)制以檢驗(yàn)進(jìn)化樹枝的置信度。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)及顯微鏡觀察

由圖1可知,菌株A在培養(yǎng)基上產(chǎn)生大量氣菌絲,氣生菌絲為白色棉絮狀,菌落突起呈白色。分生孢子呈紡錘形至鐮刀形,彎曲或端直,3個隔膜的多。菌株B菌絲匍匐,生長初期菌絲為白色,后變?yōu)楹诤稚?分生孢子倒棒狀呈現(xiàn)橢球形,頂端延長成喙?fàn)?顏色呈淡褐色,孢子壁光滑,內(nèi)部隔膜觀察明顯,具有3個或多個隔膜。將菌落形態(tài)與《真菌鑒定手冊》[16]進(jìn)行比對,發(fā)現(xiàn)菌株A可能為鐮刀屬,菌株B可能為鏈格孢屬。

圖1 菌株A和菌株B的菌落特征以及顯微形態(tài)Fig.1 Colony characteristics and micromorphology profiles of strain A and strain B

2.2 微生物表型芯片系統(tǒng)(PMs)表型特征分析

PMs將95種碳源脫水干燥后填充于96孔板中,通過加入碘硝基四唑紫為指示劑來顯示微生物對不同碳源的利用情況[17-18]。將菌株A和菌株B接種于上述96孔板中,將生長過程中,菌株A和菌株B碳源利用情況和生長情況與數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對。在碳源利用方面,菌株A共可以利用72種碳源,與數(shù)據(jù)庫中FusariumoxysporumSchlechtendahl:Fries BGA、FusariumoxysporumSchlechtendahl:Fries BGB和Fusariumchlamydosporum對碳源的利用相似度最高(圖2),其中菌株A的碳源消耗與FusariumoxysporumSchlechtendahl:Fries BGA的相似度為77.1%,與FusariumoxysporumSchlechtendahl:Fries BGB的相似度為76.0%,與Fusariumchlamydosporum的相似度為71.9%。菌株A與上述3種真菌均可利用碳源有杏苷、糊精、D-半乳糖、D-葡萄糖酸、麥芽糖、肝糖、L-鼠李糖、L-山梨糖、L-乳酸等58種碳源。在菌株生長情況方面,菌株A的生長情況與FusariumoxysporumSchlechtendahl:Fries BGA的相似度為81.3%,與FusariumoxysporumSchlechtendahl:Fries BGB的相似度為85.4%,與Fusariumchlamydosporum的相似度為80.2%。

圖2 菌株A與Fusarium oxysporum Schlechtendahl:Fries BGA、Fusarium oxysporum Schlechtendahl:Fries BGB和Fusarium chlamydosporum的對比Fig.2 Comparison of strain A with Fusarium oxysporum Schlechtendahl:Fries BGA, Fusarium oxysporum Schlechtendahl:Fries BGB and Fusarium chlamydosporum注:其中,A、B和C分別為菌株A與Fusarium oxysporum Schlechtendahl:Fries BGA、Fusarium oxysporum Schlechtendahl:Fries BGB和Fusarium chlamydosporum的碳源利用情況對比;D、E和F分別為菌株A與Fusarium oxysporum Schlechtendahl:Fries BGA、Fusarium oxysporum Schlechtendahl:Fries BGB和Fusarium chlamydosporum的生長情況對比?；疑珵槲镔|(zhì)利用/生長情況相同,黑色為物質(zhì)消耗/生長情況不同。

在碳源利用方面,菌株B共可以利用54種碳源,與數(shù)據(jù)庫中Alternariaalternata[Fries]Keissl.BGA、Phomasorghina(Saccardo)Boerema和Curvularialunatavar lunata[Wakker]Boedjin BGA的碳源利用情況相似度最高(圖3),其中菌株B的碳源消耗與Alternariaalternata[Fries]Keissl.BGA的相似度為76.0%,與Phomasorghina(Saccardo)Boerema的相似度為74.0%,與Curvularialunatavar lunata[Wakker]Boedjin BGA的相似度為67.7%。菌株B與上述3種真菌均可利用碳源有L-阿拉伯糖、D-果糖、丙三醇、蔗糖和木糖醇等45種碳源。在菌株生長情況方面,菌株B的生長情況與Alternariaalternata[Fries]Keissl. BGA的相似度為83.3%,與Phomasorghina(Saccardo)Boerema的相似度為79.2%,與Curvularialunatavar lunata[Wakker]Boedjin BGA的相似度為76.0%。

圖3 菌株B與Alternaria alternata[Fries]Keissl.BGA、Phoma sorghina(Saccardo)Boerema和Curvularia lunata var lunata[Wakker]Boedjin BGA的對比Fig.3 Comparison of strain B with Alternaria alternata[Fries]Keissl.BGA, Phoma sorghina(Saccardo)Boerema and Curvularia lunata var lunata[Wakker]Boedjin BGA注:其中,A、B和C分別為菌株B與Alternaria alternata[Fries]Keissl. BGA、Phoma sorghina(Saccardo)Boerema和Curvularia lunata var lunata[Wakker]Boedjin BGA的碳源利用情況對比;D、E和F分別為菌株B與Alternaria alternata[Fries]Keissl.BGA、Phoma sorghina(Saccardo)Boerema和Curvularia lunata var lunata[Wakker]Boedjin BGA的生長情況對比?；疑珵槲镔|(zhì)利用/生長情況相同,黑色為物質(zhì)消耗/生長情況不同。

以相似度為排序指標(biāo),根據(jù)菌株A和B的PMs比對結(jié)果進(jìn)行排序[19-20],菌株A與尖孢鐮刀菌的相似度最高,菌株B與鏈格孢菌的相似度最高。

2.3 ITS序列分析

圖4顯示菌株A和菌株B ITS rDNA PCR的電泳圖。正對照有條帶證明PCR擴(kuò)增試劑正常,負(fù)對照無條帶,樣品1、2有條帶,說明電泳結(jié)果正常。菌株A和菌株B的PCR條帶清晰完整,ITS區(qū)rDNA片段約為750 bp。

圖4 菌株A和B的ITS rDNA PCR的電泳圖Fig.4 Electrophoresis profile of PCR product of ITS rDNA of strain A and strain B注:M:Marker;1:菌株A;2:菌株B;+:正對照;-:負(fù)對照。

2.4 菌株A和菌株B在NCBI比對及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

根據(jù)Biolog表型鑒定得到的相似度最高的幾個菌種(FusariumoxysporumSchlechtendahl:Fries BGA、FusariumoxysporumSchlechtendahl:Fries BGB和Fusariumchlamydosporum),菌株A與鐮刀菌屬中的尖孢鐮刀菌和禾谷鐮刀菌的相似度最高,因此將分離得到的菌株A的ITS區(qū)rDNA基因部分序列與GenBank內(nèi)登錄的相應(yīng)序列進(jìn)行比對,構(gòu)建菌株A與已知菌株的ITS區(qū)rDNA序列進(jìn)行同源性比對(表1),結(jié)果表明菌株A與Fusariumoxysporum,Fusariumoxysporumf. sp.melonis的同源性分別達(dá)到了100%和99%,而菌株A與Fusariumchlamydosporum的同源性達(dá)到了95%。

表1 菌株A ITS rDNA序列在NCBI同源性比對結(jié)果Table 1 NCBI alignments of ITS rDNA gene sequence of strain A

由圖5的系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果可以看出，菌株A與Fusariumoxysporumf. sp.melonis在同一分枝上,且通過Bootstraps的驗(yàn)證表明它們具有較高的置信度,支持率達(dá)94%。在菌株A和Fusariumoxysporumf. sp.melonis菌種的進(jìn)化枝上,進(jìn)化分支長度均為0.00,而Fusariumoxysporum的進(jìn)化分支長度為1.35。結(jié)合形態(tài)特征以及與《真菌鑒定手冊》中的尖孢鐮孢菌(Fusariumoxysporum)描述進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)結(jié)果基本一致,因此可將本研究分離到的菌株A確定為尖孢鐮刀菌甜瓜轉(zhuǎn)化型。

圖5 基于菌株A ITS rDNA基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree based on ITS rDNA sequence of strain A

根據(jù)Biolog表型鑒定得到的相似度最高的幾個菌種(Alternariaalternata,Phomasorghina和Curvularialunata),菌株B與鏈格孢菌、莖點(diǎn)霉菌和月狀彎孢菌相似度最高,因此將分離得到的菌株B的ITS區(qū)rDNA基因部分序列與GenBank內(nèi)登錄的相應(yīng)序列進(jìn)行比對,構(gòu)建鑒定菌株與已知菌株的ITS區(qū)rDNA序列進(jìn)行同源性比對(表2),結(jié)果表明菌株B與Alternariaalternata的同源性均達(dá)到了100%,而菌株B與Phomasorghina和Curvularialunata的同源性都只達(dá)到了89%。

表2 菌株B ITS rDNA基因序列的NCBI同源性比對Table 2 NCBI alignment of the ITS rDNA gene sequence of strain B

由圖6的系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果可以看出，菌株B與AlternariaalternataLC171718.1 在同一分枝上,且通過Bootstraps的驗(yàn)證表明它們具有較高的置信度,支持率可達(dá)99%。在菌株B和Alternariaalternata菌種的進(jìn)化枝上,進(jìn)化分支長度均為0.00,而菌株B與Phomasorghina和Curvularialunata的進(jìn)化分支長度分別為3.08和2.26。因此,結(jié)合形態(tài)特征(圖1d、圖1f)以及與《真菌鑒定手冊》中的鏈格孢菌(Alternariaalternata)描述進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)結(jié)果基本一致,因此可將本研究分離到的菌株B確定為鏈格孢菌。

圖6 基于菌株B ITS rDNA 基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree based on ITS rDNA sequence of strain B

3 結(jié)論

從哈密瓜上分離純化出兩株具有引起果實(shí)腐爛能力的菌株A和菌株B,其中菌株A可利用碳源包括杏苷、糊精、D-半乳糖、D-葡萄糖酸、麥芽糖、肝糖、L-鼠李糖、L-山梨糖、L-乳酸等72種碳源;其ITS rDNA序列與尖孢鐮刀菌甜瓜轉(zhuǎn)化型(Fusariumoxysporumf. sp.melonis)的同源性為99%,分支長度為0.00。菌株B可利用碳源包括L-阿拉伯糖、D-果糖、丙三醇、蔗糖和木糖醇等54種碳源;其ITS rDNA序列與鏈格孢菌(Alternariaalternata)的同源性為100%,分支長度為0.00。結(jié)合形態(tài)學(xué)、表型鑒定以及分子生物學(xué)鑒定推測，菌株A為尖孢鐮刀菌甜瓜轉(zhuǎn)化型,菌株B為鏈格孢菌。