李杰，羅倩，張琴萍，鄔曉勇，孫雁霞

（成都大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，四川成都610106）

山葵（Wasabi）一種綠色高山植物，植株高約為20公分～50公分，具有一種特殊的辛辣味及香氣。一般生長(zhǎng)在原始森林里，被譽(yù)為“綠色黃金”、“東方山葵”。在原野山谷流水等相對(duì)陰濕環(huán)境中栽培出的山葵品質(zhì)最好，是加工各類山葵產(chǎn)品的適宜原料。山葵的各種保健作用也在近年來(lái)越來(lái)越受到人們的重視[1]。人體各組織器官的損傷主要來(lái)源于氧化，Shin S和Korenori Y的研究都表明了山葵的抗氧化作用[2-3]；山葵風(fēng)味物質(zhì)的刺激作用，也可促進(jìn)脂肪的消耗，從而達(dá)到減肥和預(yù)防肥胖癥的作用[4-5]；Aoyagi S[6]研究發(fā)現(xiàn)山葵中的黑芥子硫甘酸鉀具有一定的抗癌作用。一直都有對(duì)于山葵產(chǎn)品的研發(fā)，昝加志等[7]研發(fā)出一款新型的山葵抑菌口香糖，山葵特殊的辛辣味可以用于制作一款特殊風(fēng)味的山葵調(diào)味醬[8]。響應(yīng)面法也早用于山葵以及山葵產(chǎn)品加工工藝的研究，劉艷全等[9]使用響應(yīng)面法對(duì)山葵異硫氰酸酯制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，林艷如等[10]使用響應(yīng)面法對(duì)山葵葉柄調(diào)味菜防腐工藝進(jìn)行優(yōu)化。

酸菜是我國(guó)傳統(tǒng)的發(fā)酵蔬菜制品，有著近千年的歷史[11]。但普通酸菜因?yàn)槭褂名}漬方式進(jìn)行發(fā)酵，因此大部分酸菜中含有一定量的亞硝酸鹽，長(zhǎng)期食用含亞硝酸鹽的食品會(huì)導(dǎo)致消化系統(tǒng)癌癥[12]。因此尋找一種更為經(jīng)濟(jì)安全的腌制工藝，必將促進(jìn)酸菜行業(yè)的發(fā)展。采用面湯水[13]發(fā)酵工藝加工山葵酸菜，可以有效的增加山葵中異硫氰酸酯的穩(wěn)定性，同時(shí)降低酸菜中亞硝酸鹽含量。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺鹽酸鹽、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、酚酞（均為國(guó)產(chǎn)分析純）：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司。

UV5100B型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；JA3103N型電子天平：上海明橋精密科學(xué)儀器有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州澳華儀器有限公司。

1.2 山葵酸菜中亞硝酸鹽含量測(cè)定

按照GB 5009.33-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》中分光光度法測(cè)定山葵酸菜的亞硝酸鹽含量。

1.3 山葵酸菜加工工藝流程

參考民間酸菜加工工藝[14]和劉夏薇以及謝玉鵬對(duì)新產(chǎn)品酸菜工藝研究[15-16]并結(jié)合山葵中特殊風(fēng)味物質(zhì)異硫氰酸酯的特性，確定山葵酸菜工藝流程如下：

山葵花苔→原料選取→切制→清洗→漂燙→面湯水發(fā)酵→包裝→巴氏滅菌→冷卻→包裝→檢驗(yàn)→成品

1.4 山葵酸菜的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

在經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)后，制得感官、性狀等存在明顯差異的產(chǎn)品，為了能較公正有效地判斷制得的山葵酸菜品質(zhì)的好壞，在山葵酸菜自身特性的基礎(chǔ)上，結(jié)合趙國(guó)忠、趙丹對(duì)酸菜品質(zhì)研究中酸菜感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[17-18]，最終從色澤（20分）、滋味（35分）、組織狀態(tài)（30分）和氣味（15分）4個(gè)方面，分別設(shè)立評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，來(lái)有效地對(duì)山葵酸菜產(chǎn)品感官品質(zhì)進(jìn)行綜合評(píng)比，感官質(zhì)量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 山葵酸菜感官評(píng)定指標(biāo)和評(píng)分參考Table 1 The sensory evaluation index and grading reference of Wasabi sauerkraut

感官評(píng)定方法：取適量樣品放入潔凈的瓷盤(pán)中，在充足的自然光下觀察其色澤、組織形態(tài)、檢查有無(wú)外來(lái)雜質(zhì)，并嗅其氣味、嘗其滋味。由10人組成感官評(píng)定小組，分別山葵酸菜的色澤（20分）、滋味（35分）、組織狀態(tài)（30分）和氣味（15分）進(jìn)行評(píng)分，取其平均值作為山葵酸菜感官評(píng)定的最后得分。

1.5 山葵酸菜中總酸（以乳酸計(jì)）含量的測(cè)定

按照GB/T 12456-2008《食品中總酸的測(cè)定》中的酸堿中和滴定法進(jìn)行測(cè)定。

1.6 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

經(jīng)過(guò)多次預(yù)試驗(yàn)確定，分別考察發(fā)酵面湯水比例（4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%）、腌制時(shí)間（12、16、20、24、28、32、36 h）、腌制溫度（10、15、20、25、30、35、40℃）對(duì)山葵酸菜感官品質(zhì)和總酸含量的影響。

1.7 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析軟件Design Expert 8.06中的Box-Behnken程序，設(shè)計(jì)腌制面湯水比例、腌制溫度、腌制時(shí)間三因素三水平的試驗(yàn)，最終通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果確定山葵酸菜的最佳腌制發(fā)酵條件。

2 結(jié)果分析

2.1 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照GB 5009.33-2016中分光光度法得到亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

得到的亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.027 7x-0.000 2，R2=0.999 9，擬合度較高。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 腌制面湯水的比例對(duì)山葵酸菜感官品質(zhì)和總酸含量的影響

對(duì)不同比例面湯水發(fā)酵腌制的山葵酸菜進(jìn)行感官評(píng)價(jià)和總酸含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 不同面湯水比例腌制山葵酸菜感官評(píng)分Fig.2 The sensory score of Wasabi sauerkraut with different proportion of noodle soup

圖3 不同面湯水比例腌制山葵酸菜中總酸含量Fig.3 The total acid content of Wasabi sauerkraut with different proportion of noodle soup

由圖2可知選用面粉含量為7%的面湯水對(duì)山葵葉柄和花苔進(jìn)行腌制，制得的山葵酸菜達(dá)到感官評(píng)分最高，在面湯水過(guò)低或者過(guò)高都會(huì)逐漸降低山葵酸菜的感官品質(zhì)。從圖2可以得出，對(duì)山葵酸菜滋味影響因素最顯著的為面湯水比例，在山葵酸菜的腌制過(guò)程中，如果面湯水比例過(guò)低，將使得山葵花苔得不到充分的腌制發(fā)酵，從而影響山葵酸菜的滋味；當(dāng)面湯水比例過(guò)高不僅會(huì)降低山葵酸菜自身的滋味，同時(shí)由于面湯水比例過(guò)高，會(huì)使山葵酸菜的色澤降低，進(jìn)而降低山葵酸菜的感官品質(zhì)。由圖3可知，選用面粉含量為7%的面湯水對(duì)山葵進(jìn)行腌制，制得的山葵酸菜的總酸含量最高。因此在山葵酸菜腌制發(fā)酵工藝優(yōu)化中選擇面湯水比例7%作為響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)中心點(diǎn)。

2.2.2 腌制時(shí)間對(duì)山葵酸菜感官品質(zhì)和總酸含量的影響

對(duì)不同腌制時(shí)間制得的山葵酸菜進(jìn)行感官評(píng)價(jià)和總酸含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖4、圖5。

圖4 不同腌制時(shí)間腌制山葵酸菜感官評(píng)分Fig.4 The sensory score of Wasabi sauerkraut with different curing time

圖5 不同腌制時(shí)間腌制山葵酸菜中總酸含量Fig.5 The total acid content of Wasabi sauerkraut with different curing time

由圖4可知，腌制時(shí)間為24 h制得的山葵酸菜感官評(píng)分最高。從圖4可以明顯看出，在腌制時(shí)間逐漸增加的過(guò)程中，山葵酸菜的各項(xiàng)感官品質(zhì)都在逐漸增加。但當(dāng)腌制時(shí)間超過(guò)24 h后，山葵酸菜的各項(xiàng)感官品質(zhì)就會(huì)降低，其中最明顯的表現(xiàn)為組織形態(tài)的急劇變壞，原因可能為腌制時(shí)間過(guò)久，使得山葵的花苔和葉慢慢的開(kāi)始變軟，甚至腌制時(shí)間更久之后，山葵酸菜會(huì)出現(xiàn)軟爛的現(xiàn)象。由圖5可知，從腌制時(shí)間12 h到24 h，總酸含量上升趨勢(shì)明顯；當(dāng)腌制時(shí)間超過(guò)24 h后，總酸含量上升趨勢(shì)逐漸平緩。因此在山葵酸菜腌制發(fā)酵工藝優(yōu)化中選擇發(fā)酵時(shí)間24 h作為響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)中心點(diǎn)。

2.2.3 腌制溫度對(duì)山葵酸菜感官品質(zhì)和總酸含量的影響

對(duì)不同腌制溫度制得的山葵酸菜進(jìn)行感官評(píng)價(jià)和總酸含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖6、圖7。

圖6 不同腌制溫度腌制山葵酸菜感官評(píng)分Fig.6 The sensory score of Wasabi sauerkraut with different curing temperature

圖7 不同腌制溫度腌制山葵酸菜中總酸含量Fig.7 The total acid content of Wasabi sauerkraut with different curing temperature

由圖6可知將山葵酸菜置于25℃下進(jìn)行發(fā)酵，制得的山葵酸菜感官評(píng)分最高。由圖7可知，在腌制溫度為25℃時(shí)，山葵酸菜中總酸含量達(dá)到最高。從圖中還可發(fā)現(xiàn)溫度超過(guò)25℃后總酸含量降低，造成這種現(xiàn)象的原因可能是高溫抑制了乳酸菌的代謝活動(dòng)，從而使總酸含量降低。因此山葵酸菜腌制發(fā)酵過(guò)程中選擇腌制溫度25℃作為響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)中心點(diǎn)。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析軟件Design Expert 8.06中的Box-Behnken程序，設(shè)計(jì)腌制面湯水比例為6%、7%、8%，腌制溫度為20、25、30℃，腌制時(shí)間為20、24、28 h三因素三水平的試驗(yàn)，最終通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果確定山葵酸菜的最佳腌制發(fā)酵條件。

本試驗(yàn)總共有17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，12個(gè)分析試驗(yàn)點(diǎn)，5個(gè)中心試驗(yàn)點(diǎn)。因素水平見(jiàn)表2，得到的山葵感官評(píng)分和總酸含量結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)因素水平Table 2 Box-Behnken experimental factor level

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Box-Behnken experimental design arrangement and results

使用軟件Design Expert 8.06對(duì)表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析，最終得到的回歸模型方程為：

感官評(píng)分=98.047＋0.242A－1.057B－3.206C－1.109AB＋3.834AC＋0.221BC－10.495A2－7.225B2－7.880C2

總酸含量=1.856 4＋0.035 4A－0.071 4B＋0.105 3C＋0.038 3AB+0.053 5AC-0.068 5BC-0.343 1A2-0.329 6B2-0.002 3C2

2.3.2 模型方差分析

感官評(píng)分回歸模型方差分析見(jiàn)表4，總酸含量回歸模型方差分析見(jiàn)表5。

表4 感官評(píng)分回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance for the fifi tted quadratic polynomial model with the sensory score

表5 總酸含量回歸模型方差分析Table 5 Analysis of variance for the fifi tted quadratic polynomial model with the total acid content

由表4和表5可知，兩個(gè)模型具有極高的顯著性（P＜0.001），變量對(duì)于響應(yīng)值的影響都表現(xiàn)為顯著或極顯著。失擬項(xiàng)P＞0.05，表現(xiàn)為不顯著，這表明設(shè)計(jì)模型具有良好的擬合性，因此可以使用此模型對(duì)于山葵酸菜腌制發(fā)酵過(guò)程中的工藝參數(shù)進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

2.3.3 響應(yīng)面分析

將回歸模型中的任意一因素固定在一個(gè)水平，就可以得到另外兩個(gè)變量因素對(duì)山葵酸菜感官評(píng)分和總酸含量的交互影響結(jié)果。

2.3.3.1 感官品質(zhì)響應(yīng)面分析

腌制面湯水比例、腌制時(shí)間、腌制溫度對(duì)山葵酸菜感官評(píng)分的交互影響如圖8～圖10。

圖8 腌制面湯水比例和腌制溫度對(duì)感官評(píng)分交互影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.8 The response surface plot and contour plot of interaction between proportion of noodle soup and curing temperature with the sensory score

圖9 腌制面湯水比例和腌制時(shí)間對(duì)感官評(píng)分交互影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.9 The response surface plot and contour plot of interaction between proportion of noodle soup and curing time with the sensory score

圖10 腌制溫度和腌制時(shí)間對(duì)感官評(píng)分交互影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.10 The response surface plot and contour plot of interaction between curing temperature and time with the sensory score

由圖8中的等高線圖呈現(xiàn)橢圓形可以看出腌制面湯水比例和腌制溫度有一定的交互作用，但是交互作用并不顯著，并且沿A軸等高線相對(duì)密集一些，這說(shuō)明對(duì)山葵酸菜感官品質(zhì)的影響腌制面湯水比例比腌制溫度大一些。從三維立體圖中可以看出，感官評(píng)分出現(xiàn)最大值出現(xiàn)在腌制面湯水比例和腌制時(shí)間都在中心部分的位置。由圖9的三維立體圖中可以看出，隨著腌制面湯水比例的增加，感官評(píng)分呈現(xiàn)一個(gè)拋物線趨勢(shì)；并且在腌制時(shí)間增加時(shí)，拋物線的頂點(diǎn)也呈現(xiàn)一個(gè)拋物線趨勢(shì)，這說(shuō)明山葵酸菜感官品質(zhì)的極大值出現(xiàn)在腌制面湯水比例和腌制時(shí)間都處于中心點(diǎn)附近的位置。由圖10中的等高線圖中腌制溫度和腌制時(shí)間等高線密集程度基本相同可以看出腌制溫度和腌制時(shí)間的交互作用并不顯著。

2.3.3.2 總酸含量響應(yīng)面分析

腌制面湯水比例、腌制時(shí)間、腌制溫度對(duì)山葵酸菜感官評(píng)分的交互影響結(jié)果如圖11～圖13所示。

圖11 腌制面湯水比例和腌制溫度對(duì)總酸含量交互影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.11 The response surface plot and contour plot of interaction between proportion of noodle soup and curing temperature with the total acid content

圖12 腌制面湯水比例和腌制時(shí)間對(duì)總酸含量交互影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.12 The response surface plot and contour plot of interaction between proportion of noodle soup and curing time with the total acid content

圖13 腌制時(shí)間和腌制溫度對(duì)總酸含量交互影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.13 The response surface plot and contour plot of interaction between curing temperature and time with the total acid content

由圖11中的等高線圖中腌制溫度和腌制時(shí)間等高線密集程度基本相同可以看出腌制面湯水比例和腌制溫度的交互作用并不顯著，這一點(diǎn)從三維立體圖中兩者的變化曲面變化趨勢(shì)相差不大也可以證明。由圖12中的等高線圖可以看出腌制面湯水比例和腌制時(shí)間的交互作用比較顯著，并且沿A軸等高線更密集，這說(shuō)明對(duì)山葵酸菜總酸含量的影響腌制面湯水比例比腌制時(shí)間更大。由圖13三維立體圖中可以看出，隨著腌制溫度增加，總酸含量趨勢(shì)呈現(xiàn)拋物線趨勢(shì)，這可能是在低溫時(shí)，隨著溫度的增加，使山葵酸菜中的乳酸菌的代謝活動(dòng)更加活躍從而使山葵酸菜中的總酸含量增加；在溫度過(guò)高時(shí)，高溫對(duì)乳酸菌的代謝作用抑制過(guò)強(qiáng)，從而降低了山葵酸菜中的總酸含量。

2.3.4 腌制發(fā)酵工藝的優(yōu)化和可靠性驗(yàn)證

通過(guò)對(duì)響應(yīng)面三維立體圖和等高線圖進(jìn)行分析，可以基本確定腌制發(fā)酵工藝的最佳工藝參數(shù)的范圍。并且通過(guò)軟件優(yōu)化功能以山葵酸菜感官評(píng)分為主要指標(biāo)對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化得到最佳工藝條件為：腌制面湯水比例為6.98%，發(fā)酵溫度為24.62℃，腌制時(shí)間為23.76 h。此工藝條件下生產(chǎn)出來(lái)的山葵酸菜理論上感官評(píng)分能達(dá)到98.45分，總酸含量為1.836 g/100 g?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)中的便利，將得到的最佳工藝條件調(diào)整為：腌制面湯水比例為7%，發(fā)酵溫度為25℃，腌制時(shí)間為24 h。以此工藝條件為山葵酸菜的腌制工藝，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，最終得到的山葵酸菜感官評(píng)分為98分，總酸含量為1.869 g/100 g。從理論值與實(shí)際值對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)兩者非常接近，說(shuō)明此模型能較好的模擬山葵酸菜腌制發(fā)酵工藝，并能預(yù)測(cè)出最終得到山葵酸菜的感官品質(zhì)與總酸含量。

2.3.5 山葵酸菜中亞硝酸鹽含量結(jié)果分析

利用優(yōu)化后工藝所得的山葵酸菜，按照GB 5009.33-2016試樣處理方法進(jìn)行處理，得到山葵酸菜試樣于波長(zhǎng)538 nm處測(cè)吸光度（重復(fù)3次），并計(jì)算山葵酸菜中亞硝酸鹽含量，結(jié)果表明未檢出亞硝酸鹽。

3 結(jié)論

本文以山葵酸菜的腌制發(fā)酵工藝為主要研究對(duì)象，以山葵葉柄和花苔為原料采用響應(yīng)面法對(duì)山葵酸菜的加工工藝流程進(jìn)行優(yōu)化。最后通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)得到最佳腌制工藝為：腌制面湯水比例為6.98%，發(fā)酵溫度為24.62℃，腌制時(shí)間為23.76 h?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)中的便利，將得到的最佳工藝條件調(diào)整為：腌制面湯水比例為7%，發(fā)酵溫度為25℃，腌制時(shí)間為24 h。以此工藝條件得到的山葵酸菜感官評(píng)分為98分，總酸含量為1.869 g/100 g，產(chǎn)品中未檢出亞硝酸鹽。通過(guò)對(duì)山葵酸菜加工工藝的優(yōu)化，用面湯水發(fā)酵工藝，有效的減少山葵酸菜中亞硝酸鹽有害成分的含量，形成一款具有山葵特色風(fēng)味的山葵酸菜，在極大的提高了山葵原材料利用率和山葵附加值的同時(shí)，也提升了山葵酸菜的品質(zhì)和安全性。