其布日，薩初拉，蘇少鋒，高 娃，王蘊華，劉紅葵，吳青海，呼 和

（內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院生物技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031）

在絕大多數(shù)日糧情況下，蛋氨酸和賴氨酸是奶牛泌乳和乳蛋白合成的主要限制性氨基酸，在以玉米青貯為基礎(chǔ)的日糧中，蛋氨酸是乳汁和乳蛋白合成的第一限制性氨基酸［1-2］。國內(nèi)外研究表明，奶牛補充過瘤胃保護蛋氨酸能增加產(chǎn)奶量［3-9］，提高乳中乳蛋白［10-11］、乳脂肪［8，11］及總固形物含量［12］。此外，蛋氨酸作為反芻動物的重要限制性氨基酸，在充分發(fā)揮動物生產(chǎn)潛能，降低糞、尿氮排放等方面起著巨大作用［13］。

產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis，C.utilis）是國家衛(wèi)生健康委員會規(guī)定的可用于保健食品的11種真菌菌種之一，其既有酵母菌的優(yōu)良特性，又可應用于食品加工行業(yè)和畜牧業(yè)生產(chǎn)當中。酵母菌制劑的應用不僅可以節(jié)約生產(chǎn)成本，減少疾病發(fā)生，而且可以提高經(jīng)濟效益，有利于獲得高品質(zhì)的食品、畜牧產(chǎn)品以及口服藥品等［14］。隨著對產(chǎn)朊假絲酵母研究的深入，產(chǎn)朊假絲酵母表達系統(tǒng)也不斷成熟。在抗性標記的選擇方面，產(chǎn)朊假絲酵母基因組中存在一段L41基因，該基因?qū)俜啪€菌酮（cycloheximide，CYH）敏感性基因。研究表明，對L41基因第56位氨基酸密碼子的一個堿基進行突變即可獲得CYH抗性基因，這為構(gòu)建產(chǎn)朊假絲酵母整合型表達載體提供了便利［15］。GAP-p（三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子）是一種組成型強啟動子，已從產(chǎn)朊假絲酵母中成功克?。?6］。產(chǎn)朊假絲酵母沒有穩(wěn)定的附加質(zhì)粒，因此，采用整合型載體將外源基因整合到染色體中是產(chǎn)朊假絲酵母引入外源基因的主要方式。使用重復序列（rDNA）作為整合載體同源位點是提高外源基因在酵母基因組中拷貝數(shù)的有效途徑［17-18］。有學者研究表明，產(chǎn)朊假絲酵母是表達異源蛋白的有效宿主［19-20］。

圖1 重組質(zhì)粒pBR322-GAP-zein（PGZ）構(gòu)建技術(shù)路線

玉米胚乳中的玉米醇溶蛋白（zein）是天然存在的穩(wěn)定型蛋白，富含含硫氨基酸（含有20%的蛋氨酸），其中以δ-10kD型玉米醇溶蛋白的含量最高，并且該蛋白在反芻動物的瘤胃中不被降解且具有腸溶性［21］，可以巧妙地達到過瘤胃保護的目的。近年來，δ-10kD型玉米醇溶蛋白基因在植物中表達的研究報道較多［22-26］，但在微生物中表達的研究報道較少［27-29］，尤其尚未見在產(chǎn)朊假絲酵母中表達的研究報道。該研究采用同源重組技術(shù)將zein基因表達盒整合到產(chǎn)朊假絲酵母的染色體上，構(gòu)建表達zein蛋白的產(chǎn)朊假絲酵母工程菌，為解決奶牛日糧中主要限制性氨基酸不平衡，改善奶牛蛋白飼料利用率，提高奶牛生產(chǎn)性能提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 產(chǎn)朊假絲酵母菌株：購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，編號為CICC 1769；大腸桿菌感受態(tài)細胞Trans-T1購自北京全式金生物有限公司；pMD19-T克隆載體購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基：YPD培養(yǎng)基，配方為1%酵母粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖 （固體培養(yǎng)基瓊脂含量為1.5%）。

1.1.3 主要試劑：山梨醇，購自北京索萊寶科技有限公司；山梨醇Buffer：用0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液（pH值=7.4）配制1.2 mol/L山梨醇溶液；0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液 （pH值=7.4）的配制：77.4 mL 0.1 mol/L Na2HPO4溶液＋22.6 mL 0.1 mol/L NaH2PO4溶液；放線菌酮（CYH）購自Sigma-Aldrich公司；酵母轉(zhuǎn)化試劑盒YeastmakerTMYeast Transformation System 2購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；Lyticase、質(zhì)粒小提試劑盒、酵母基因組提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；試驗中用到的內(nèi)切酶購自NEB（北京）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 zein基因密碼子的優(yōu)化及表達盒的拼接合成：在NCBI中查找δ-10kD-醇溶蛋白基因序列、酵母3-磷酸甘油醛脫氫酶啟動子（GAP-p）和終止子（GAP-t）序列，由基因合成公司（蘇州金唯智生物科技有限公司）進行zein基因密碼子偏愛性及相關(guān)參數(shù)的優(yōu)化后，將啟動子（GAP-p）和終止子（GAP-t）序列與優(yōu)化過的zein基因序列進行拼接合成，然后在兩端加入設(shè)計好的酶切位點，構(gòu)建表達盒（GAP-p）-zein-（GAP-t）。

1.2.2 含有zein基因表達盒的整合載體的構(gòu)建：提取含（GAP-p）-zein-（GAP-t）表達盒的 pUC57和pBR322質(zhì)粒，分別用EcoRⅤ和BamHⅠ進行酶切，回收目的片段。用T4 DNA連接酶將片段進行連接，獲得質(zhì)粒 pBR322-GAP-zein（PGZ）（見圖1），同時加入設(shè)計好的酶切位點，然后對重組質(zhì)粒進行酶切和測序鑒定。

表1 PCR引物信息[30]

圖2 重組質(zhì)粒pBR322-GAP-zein-mL41（PGZM）構(gòu)建技術(shù)路線

1.2.3 含有放線菌酮抗性基因的整合載體的構(gòu)建

1.2.3.1 放線菌酮基因的點突變：復蘇擴增產(chǎn)朊假絲酵母后提取其基因組，進行重疊PCR試驗。以基因組為模板，以A1/B2，B1/A2為引物 （見表1）進行PCR擴增，對2組PCR產(chǎn)物進行膠回收，再以2組回收產(chǎn)物為模板進行PCR試驗，PCR產(chǎn)物膠回收后進行加A反應，將目的基因與pMD19-T 載體進行連接［30］，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，篩選陽性克隆子，重組子培養(yǎng)擴增，提取質(zhì)粒酶切鑒定后將陽性克隆子進行核苷酸序列測定 （由南京金斯瑞生物科技有限公司完成）。利用生物信息學軟件將所得序列和NCBI發(fā)布的序列進行比對分析。

1.2.3.2 含有放線菌酮抗性基因的整合載體的構(gòu)建：將目的基因載體pMD19-T-mL41質(zhì)粒和pBR322-GAP-zein（PGZ）載體酶切，回收與純化后，將目的基因mL41與載體pBR322-GAP-zein（PGZ）進行連接，構(gòu)建pBR322-GAP-zein-mL41（PGZM）載體（見圖2）。轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，篩選陽性克隆子，培養(yǎng)擴增，提取質(zhì)粒酶切鑒定后，將陽性克隆子進行核苷酸序列測定。利用生物信息學軟件將所得序列和NCBI發(fā)布的序列進行比對分析。

圖3 重組質(zhì)粒pBR322-GAP-zein-mL41-18S rDNA（PGZM18）構(gòu)建技術(shù)路線

1.2.3.3 產(chǎn)朊假絲酵母放線菌酮抗性試驗：用無水乙醇溶解放線菌酮（CYH），配制母液濃度為50 mg/mL的 CYH 溶液， 然后配制加入 5、10、15、20 μg/mL放線菌酮的YPD培養(yǎng)基，將產(chǎn)朊假絲酵母用0.9%生理鹽水稀釋104倍后進行涂布培養(yǎng)，觀察菌落生長狀況。

1.2.4 同源重組表達載體的構(gòu)建：以產(chǎn)朊假絲酵母基因組為模板，擴增克隆18S rDNA序列［26］，回收與純化目的基因PCR產(chǎn)物，加A反應后與pMD19-T載體連接。將載體pBR322-GAP-zeinmL41和目的基因載體pMD19-T-18S rDNA質(zhì)粒酶切后，進行回收與純化，對載體進行去磷酸化處理，目的基因18S rDNA與載體pBR322-GAP-zein-mL41（PGZM）進行連接，構(gòu)建 pBR322-GAP-zein-mL41-18S rDNA（PGZM18）載體（見圖 3），對載體進行酶切和測序鑒定。

1.2.5 構(gòu)建含zein基因的產(chǎn)朊假絲酵母基因工程菌：提取大腸桿菌中的酵母表達載體質(zhì)粒PGZM18，用NcoⅠ進行單酶切，酶切產(chǎn)物膠回收，制備產(chǎn)朊假絲酵母感受態(tài)細胞，將酶切回收產(chǎn)物用LiAC試劑方法轉(zhuǎn)化到產(chǎn)朊假絲酵母中，同源整合到染色體上。將轉(zhuǎn)化子涂布到含有CYH的YPD平板上28℃培養(yǎng)3～5 d。將酵母重組子擴增培養(yǎng)后提取酵母基因組，用目的基因zein引物進行PCR鑒定和測序鑒定。

1.2.6 液相色譜法測定產(chǎn)朊假絲酵母工程菌中的蛋氨酸含量：將未轉(zhuǎn)化目的基因的產(chǎn)朊假絲酵母與轉(zhuǎn)化目的基因的產(chǎn)朊假絲酵母分別設(shè)為對照組和試驗組，分別在YPD和含放線菌酮的YPD培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后，離心菌液收集沉淀，用液相色譜儀測定2組樣品中的蛋氨酸含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 δ-10kD-醇溶蛋白基因（zein）序列的獲得

將δ-10kD-醇溶蛋白基因（GenBank登錄號：NM_001111585.1）原始序列進行優(yōu)化。使用OPTIMWIZ和GENEWIZ軟件提供的基因密碼子優(yōu)化工具進行分析。由圖4可知，經(jīng)OPTIMWIZ分析處理后，CAI從0.65提高至0.96；GC含量和不利的山峰被優(yōu)化，mRNA的半衰期被延長；二級結(jié)構(gòu)以及影響核糖體mRNA的綁定和穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)也被移除。根據(jù)優(yōu)化后的zein基因序列合成基因。

圖4 zein基因密碼子優(yōu)化前后的CAI值、FOP值和GC含量

2.2 同源整合表達載體的構(gòu)建和鑒定

分別對利用pUC57-GAP-zein和pBR322質(zhì)粒構(gòu)建的重組載體pBR322-GAP-zein（PGZ），利用 pBR322-GAP-zein（PGZ）和 pMD19-T-mL41 構(gòu)建的重組載體pBR322-GAP-zein-mL41（PGZM），利用 pBR322-GAP-zein-mL41（PGZM）和 pMD19-T-18S rDNA構(gòu)建的重組載體pBR322-GAP-zeinmL41-18S rDNA（PGZM18）進行酶切鑒定，并對回收后的目的片段進行測序鑒定，結(jié)果顯示，同源整合表達載體構(gòu)建成功（見圖5）。

2.3 產(chǎn)朊假絲酵母放線菌酮抗性試驗

設(shè)置3個平行試驗組（A、B、C組），觀察產(chǎn)朊假絲酵母菌對不同濃度放線菌酮的敏感性，確定其對放線菌酮的敏感濃度臨界值。由表2可知，產(chǎn)朊假絲酵母菌抗放線菌酮敏感濃度臨界值為20 μg/mL，以該濃度作為后續(xù)試驗放線菌酮工作濃度。

2.4 產(chǎn)朊假絲酵母重組子鑒定

將構(gòu)建成功的PGZM18表達載體同源重組到產(chǎn)朊假絲酵母的染色體上，獲得含有目的基因zein的產(chǎn)朊假絲酵母菌株，然后提取重組酵母菌株基因組進行zein目的基因PCR鑒定和測序鑒定。結(jié)果顯示，zein基因被成功整合到產(chǎn)朊假絲酵母染色體上（見圖6），提示含zein基因的產(chǎn)朊假絲酵母基因工程菌構(gòu)建成功。

表2 不同放線菌酮濃度處理下酵母菌單菌落數(shù)量 個

圖5 重組載體酶切鑒定結(jié)果

圖6 酵母重組子PCR鑒定結(jié)果

2.5 基因工程產(chǎn)朊假絲酵母中的蛋氨酸含量測定

以未轉(zhuǎn)化zein基因的產(chǎn)朊假絲酵母菌為對照組，以轉(zhuǎn)化zein基因的重組產(chǎn)朊假絲酵母菌為試驗組，測定并比較二者的蛋氨酸表達量。由圖7及表3可知，試驗組的蛋氨酸含量比對照組提高0.24 g/kg（17.14%）。

3 討論

圖7 液相色譜法測定氨基酸含量結(jié)果

表3 蛋氨酸含量測定結(jié)果 g/kg，%

該試驗采用基因工程技術(shù)，將玉米δ-10kD-醇溶蛋白基因（zein），酵母的 GAP 啟動子（GAP-p）、終止子（GAP-t）拼接合成表達框，以18S rDNA片段為整合介導區(qū)，應用放線菌酮（CYH）抗性基因作為篩選標記，結(jié)合pBR322質(zhì)粒構(gòu)建了同源整合表達載體，把zein基因同源重組整合到產(chǎn)朊假絲酵母染色體上，構(gòu)建表達zein蛋白的產(chǎn)朊假絲酵母工程菌株。蛋氨酸含量測定結(jié)果顯示，重組菌株比起始菌株提高了17.14%，接近枯草芽胞桿菌的蛋氨酸表達量［29］，但是相較于重組產(chǎn)朊假絲酵母乙醇的產(chǎn)量 29.2 g/L［31］、異丙醇的產(chǎn)量 9.5 g/L［32］還有較大的差距。雖然構(gòu)建的產(chǎn)朊假絲酵母工程菌產(chǎn)蛋氨酸量比較低，但也為下一步提高其蛋氨酸的產(chǎn)量研究打下了良好的基礎(chǔ)。下一步應對產(chǎn)朊假絲酵母工程菌的關(guān)鍵調(diào)控基因進行系統(tǒng)的研究，包括提高啟動子的強度、增加目的基因的拷貝數(shù)量、引入信號肽基因及轉(zhuǎn)化方法等。