胡煜雯 高靜賢 江蘇省醫(yī)療器械檢驗所 （江蘇 南京 210019）

內(nèi)容提要： 細(xì)胞毒性試驗是評價醫(yī)療器械生物相容性的重要檢測項目，其中MTT細(xì)胞毒性試驗被視為較常規(guī)的一種試驗。GB/T 16886.5-2017已于2018年7月1日正式實施。目前國內(nèi)關(guān)于醫(yī)療器械MTT細(xì)胞毒性具體試驗方法有三種，分別收入在GB/T 16886.5-2017、GB/T 14233.2-2005和GB/T 16175-2008中。文章對三種MTT試驗方法進(jìn)行比較并對新版的GB/T 16886.5中MTT方法進(jìn)行解析，以為相關(guān)檢測人員提供參考。

體外細(xì)胞毒性試驗是醫(yī)療器械生物學(xué)評價體系中最常用的檢測指標(biāo)之一，它是一種在離體狀態(tài)下模擬生物生長環(huán)境，檢測醫(yī)療器械產(chǎn)品接觸人體組織后生物學(xué)反應(yīng)的體外試驗[1]。MTT試驗是醫(yī)療器械細(xì)胞毒性試驗常規(guī)的試驗方法之一。2018年7月1日，GB/T 16886.5-2017《醫(yī)療器械生物學(xué)評價 第5部分：體外細(xì)胞毒性試驗》正式實施。該標(biāo)準(zhǔn)替代了GB/T 16886.5-2003，等同采用ISO 10993-5:2009。下文將對新版GB/T 16886.5中MTT方法進(jìn)行解析。

1.GB/T 16886.5-2017與GB/T 16886.5-2003的比較

GB/T 16886.5-2017較GB/T 16886.5-2003相比，不是單純的指南性標(biāo)準(zhǔn)，而是加入了細(xì)胞毒性具體試驗方法和評價指標(biāo)[2]。其中增加了MTT試驗。其原理是：在活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素C作用下，MTT被還原成不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜，而死細(xì)胞缺失琥珀酸脫氫酶不能將MTT還原，故甲臜的生成量與樣本中的活細(xì)胞數(shù)目成正比[3]。MTT試驗通過用光度計測定甲臜溶于醇類后的色度來判斷細(xì)胞的存活率。MTT法是一項定量的試驗方法，能更準(zhǔn)確地判斷醫(yī)療器械產(chǎn)品細(xì)胞毒性指標(biāo)。

2.GB/T 16886.5-2017與GB/T 14233.2-2005中MTT試驗方法的區(qū)別

目前涉及醫(yī)療器械MTT細(xì)胞毒性具體試驗方法的國標(biāo)有三份：GB/T 16886.5-2017、GB/T 14233.2-2005和GB/T 16175-2008。3種MTT試驗方法有所不同（見表1）[4,5]。

3.GB/T 16886.5-2017中MTT試驗要點解析

3.1 浸提介質(zhì)和培養(yǎng)基的選擇

GB/T 16886.5-2017指出首選含血清培養(yǎng)基作為浸提介質(zhì)，因為不僅可以支持細(xì)胞生長，還具有浸提極性和非極性物質(zhì)的能力。另，GB/T 16886.5-2017的MTT試驗中明確了培養(yǎng)基使用最低限量基本培養(yǎng)基（MEM）。MEM是動物細(xì)胞培養(yǎng)中常用的一種基礎(chǔ)培養(yǎng)基，相比RPMI1640、F-10等更適合貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)。美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）亦推薦MEM為L929細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)基[6]。

表1.GB/T 16886.5-2017、GB/T 14233.2-2005及GB/T 16175-2008中MTT試驗的主要區(qū)別

3.2 試驗方法

GB/T 16886.5-2017的MTT方法中細(xì)胞接種密度為1×104/100μL，是GB/T 14233.5-2005中的細(xì)胞接種密度的10倍。細(xì)胞生長進(jìn)入對數(shù)生長期之前，對生長環(huán)境變化較為敏感，所以細(xì)胞毒性試驗宜選擇細(xì)胞處于對數(shù)生長期階段進(jìn)行換液步驟。相關(guān)研究表明，接種密度為1×103/100μL時，L929細(xì)胞在24h仍處于緩慢增殖狀態(tài)，會擴(kuò)大細(xì)胞對待檢物的反應(yīng)；而密度為1×104/100μL時，細(xì)胞在24h后便進(jìn)入了對數(shù)生長期，細(xì)胞狀態(tài)較為穩(wěn)定，適合給予待檢物浸提液[7]。

GB/T 16886.5-2017的MTT方法指明換液后繼續(xù)培養(yǎng)24h再進(jìn)行MTT反應(yīng)，而未指出可以48h、72h或更長時間培養(yǎng)。原因在于：換液后培養(yǎng)時間越長，空白對照組細(xì)胞可能會因進(jìn)入平臺期而受到抑制甚至凋亡，導(dǎo)致空白對照組增值率的降低，從而會出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

3.3 MTT溶液

為了避免酚紅影響MTT溶液的顏色，GB/T 16886.5-2017中在MTT溶液的配制中提出需用“不含酚紅的MEM培養(yǎng)基”。此外，在加入MTT溶液之前，也必須將原浸提液移出，是因為浸提液中的成分會還原MTT或與MTT發(fā)生其他反應(yīng)。這些都是為了防止試驗中假陰/陽性結(jié)果的出現(xiàn)。

3.4 最終結(jié)果判定

不同于GB/T 14233.2及GB/T 16175的分級判定，2017版GB/T 16886.5采用了存活率百分比判定。在參考波長650nm時測量在570nm的光度值，存活率為試驗樣品100%浸提液光密度平均值與空白對照組光密度平均值的比值。若試驗樣品100%浸提液的存活率小于空白對照組的70%，說明該試驗樣品具有潛在的細(xì)胞毒性。

4.討論

GB/T 14233和GB/T 16175均以GB/T 16886.1為基礎(chǔ)，根據(jù)具體適用產(chǎn)品的特性制定而成，與GB/T 16886.5一樣具有方法等同性。對于這三種MTT試驗方法，需注意這三份標(biāo)準(zhǔn)的適用范圍。GB/T 16886.5面對的對象為所有的醫(yī)療器械，而GB/T 14233.2僅適用于醫(yī)用輸液、輸血、注射器具，GB/T 16175僅適用于醫(yī)用有機硅材料。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期之前給予刺激物，會擴(kuò)大細(xì)胞對待檢物的反應(yīng)，所以是否GB/T 14233.2和GB/T 16175的MTT法相對GB/T 16886.5的更為嚴(yán)格還需要大量的檢驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計和研究。

此外，醫(yī)療器械產(chǎn)品種類繁多，發(fā)展迅速，MTT試驗是否適合所有的醫(yī)療器械還值得進(jìn)一步的研究。例如，劉永帥[8]指出在測試葡聚糖磁性納米材料時，MTT試驗過高評價了其細(xì)胞毒性，出現(xiàn)了假陰性的結(jié)果。新版GB/T 16886.5保留了舊版中的直接接觸法和間接接觸法，故在評價細(xì)胞毒性指標(biāo)時需了解待檢產(chǎn)品的理化性質(zhì)，深入貫徹GB/T 16886.1再來選擇合適的試驗方法。

GB/T16886.5-2017較舊版還增加了XTT細(xì)胞毒性試驗，XTT能被代謝活細(xì)胞轉(zhuǎn)化為橙色水溶性的甲臜，可直接測定光度值，避免了MTT還原產(chǎn)物因溶解不全而影響結(jié)果的問題；另有研究表明XTT還原產(chǎn)物更為穩(wěn)定，更適合大批量樣品的分析。在細(xì)胞毒性常規(guī)檢測方法中，CCK-8檢測法未被收入新版16886.5中。但現(xiàn)已有諸多實驗人員發(fā)現(xiàn)CCK-8生成的產(chǎn)物不破壞細(xì)胞，比MTT法重復(fù)性較好、靈敏度更高[9]。MTT、XTT、CCK-8這些細(xì)胞毒性試驗方法值得利用不同材料的醫(yī)療器械進(jìn)行深入地交叉比對。

綜上所述，不同的試驗細(xì)節(jié)均會導(dǎo)致不同的結(jié)果，為客觀科學(xué)地評價醫(yī)療器械的細(xì)胞毒性，根據(jù)所選用的細(xì)胞系，細(xì)胞毒性試驗應(yīng)嚴(yán)格遵從標(biāo)準(zhǔn)。但當(dāng)一個評價項目具有多種試驗方法時，需要結(jié)合實際產(chǎn)品的特性，并考慮試驗的原理、靈敏性、重現(xiàn)性等因素來選擇試驗方法。